鄭婧萱，張舒月，何以寧，薛曉華，郭曉軍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

青貯飼料中黃曲霉毒素的污染是一個(gè)全球性問題，是青貯飼料中霉菌毒素評定的主要指標(biāo)［1］，給動(dòng)物生產(chǎn)性能和人類健康帶來巨大的威脅［2］。因此，青貯飼料中黃曲霉毒素的去除是反芻動(dòng)物養(yǎng)殖者和科研機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容。該研究前期工作篩選到1株頡頏黃曲霉生長并且降解黃曲霉毒素的雙功能菌株枯草芽胞桿菌N-1a，在青貯過程中起到良好的脫毒作用?？莶菅堪麠U菌所特有的芽胞抗逆性強(qiáng)，能夠滿足現(xiàn)代工業(yè)化的后處理生產(chǎn)要求，且具有十分驚人的休眠能力，普通條件下可保存幾年到幾十年的生活力［3-4］，延長了其貨架期和生物活性，所以現(xiàn)在芽胞桿菌產(chǎn)品的形式大多是以芽胞的形態(tài)存在的［5］。

該研究目的在于對菌株N-1a的產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其培養(yǎng)基的最佳組成配比及發(fā)酵條件，提高活菌數(shù)及芽胞形成率，從而為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株：黃曲霉毒素降解菌株枯草芽胞桿菌N-1a，保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和產(chǎn)芽胞優(yōu)化培養(yǎng)基參照郭曉軍等［6］的方法配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化：取4℃N-1a菌株斜面在NA平板上進(jìn)行劃線，挑取目的菌株單菌落接種到NA斜面上37℃培養(yǎng)12 h后備用。

1.2.2 菌株的種子培養(yǎng)：將活化后的菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.3 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)：按照6.0%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和芽胞形成率的檢測。

1.2.4 單因素試驗(yàn)：通過摸索發(fā)酵培養(yǎng)基的不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對活菌數(shù)和芽胞形成率的影響，確定培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽。

1.2.5 正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果配制不同濃度的培養(yǎng)基，按正交試驗(yàn)表L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，搖床培養(yǎng)48 h。通過測定活菌總數(shù)和芽胞形成率確定最優(yōu)培養(yǎng)基的配比。

在確定最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基pH值、接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間按正交試驗(yàn)表L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.2.6 測定方法：采用血球計(jì)數(shù)板法測定活菌總數(shù)［7］；參照楊繼業(yè)等［8］方法進(jìn)行芽胞形成率的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌株芽胞產(chǎn)量的影響

由表1可見，當(dāng)以玉米粉作為碳源時(shí)，活菌總數(shù)為3.82×108cfu/mL，芽胞形成率達(dá)到了86.13%，芽胞產(chǎn)量最高，因此選擇玉米粉作為培養(yǎng)基的最佳碳源。

表2 不同氮源對芽胞產(chǎn)量的影響

表3 不同無機(jī)鹽對芽胞產(chǎn)量的影響

2.2 不同氮源對菌株芽胞產(chǎn)量的影響

由表2可見，當(dāng)以黃豆餅粉作為氮源時(shí)，活菌總數(shù)達(dá)11.7×108cfu/mL，芽胞形成率達(dá)到最大，為84.02%，芽胞產(chǎn)量最高，因此，選擇黃豆餅粉作為培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.3 不同無機(jī)鹽對菌株芽胞產(chǎn)量的影響

無機(jī)鹽對菌體的生長和芽胞的形成均有較大影響，Mg2+的加入能促進(jìn)芽胞產(chǎn)生，芽胞產(chǎn)量達(dá)到2.41×108cfu/mL，活菌總數(shù)和芽胞形成率分別為2.93×108cfu/mL和 82.25%。 不少研究證明，Mn2+是菌體生長和芽胞形成的微量元素，也是許多酶的輔助因子。由表3可知，當(dāng)以Mn2+為無機(jī)鹽時(shí)，該菌株產(chǎn)芽胞能力也較強(qiáng)，芽胞產(chǎn)量達(dá)1.94×108cfu/mL，活菌總數(shù)和芽胞形成率分別為2.33×108cfu/mL和83.26%，因此，選擇 MgSO4·5H2O 和 MnSO4·H2O 作為培養(yǎng)基的最佳無機(jī)鹽。

2.4 培養(yǎng)基配比正交試驗(yàn)結(jié)果

將最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽按照不同濃度進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明，對芽胞產(chǎn)量影響的主次因素為：MnSO4·H2O>黃豆餅粉>玉米粉>MgSO4·5H2O。 試驗(yàn)中最佳組合為A2B2C3D1，其中活菌數(shù)為4.10×108cfu/mL，芽胞形成率達(dá)到83.52%，芽胞產(chǎn)量為3.42×108cfu/mL，與正交優(yōu)化表中最優(yōu)組合相同，所以確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成配比為玉米粉2.0%、黃豆 餅 粉 1.0% 、MnSO4·H2O 0.10% 、MgSO4·5H2O 0.01%。

2.5 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 N-1a菌株培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 N-1a菌株培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果（見表5）可知，對芽胞產(chǎn)量影響的主次因素為：發(fā)酵時(shí)間>接種量>pH值>裝液量。試驗(yàn)組中最佳組合為A2B1C2D3，其活菌總數(shù)為6.42×108cfu/mL、芽胞形成率為80.53%、芽胞產(chǎn)量為5.17×108cfu/mL。該結(jié)果與正交優(yōu)化表中最優(yōu)組合A2B1C2D2不一致，因此，需做驗(yàn)證試驗(yàn)。由驗(yàn)證試驗(yàn)（見表6）結(jié)果知，組合A2B1C2D2芽胞形成率、活菌總數(shù)和芽胞產(chǎn)量均優(yōu)于組合A2B1C2D3，分別為 81.25%、6.08×108cfu/mL、4.94×108cfu/mL。 所以確定最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量4%、pH值7.0、裝液量75 mL/250 mL。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

芽胞是產(chǎn)芽胞細(xì)菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，并非細(xì)菌生活史不可缺少的部分，它的形成受營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的影響。該試驗(yàn)結(jié)果表明，不同的碳源、氮源、無機(jī)鹽及其配比均可以作為影響芽胞形成率的底物。不同的菌株最適培養(yǎng)基成分也不盡相同，培養(yǎng)基成分的組成對不同菌株芽胞形成率的影響的主次順序也不同。但值得一提的是，研究無機(jī)鹽對該菌株的影響時(shí)，Mn2+的存在的確提升了菌株的芽胞形成率，這與陳秋紅等［9］人的相關(guān)研究大致相同。正交試驗(yàn)的優(yōu)化僅僅是對前人考察最多的影響因素進(jìn)行研究得到了芽胞產(chǎn)量的最優(yōu)組合，為了使黃曲霉毒素降解菌株在青貯及發(fā)酵飼料中發(fā)揮更好的作用，需要進(jìn)一步在中試發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上對影響芽胞形成的因素進(jìn)行研究，為黃曲霉毒素降解菌株的產(chǎn)品推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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［1］孟慶翔，楊軍香.全株玉米青貯制作與質(zhì)量評價(jià)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2016.

［2］王麗芳，楊健，姚一萍，等.影響生鮮乳質(zhì)量安全的風(fēng)險(xiǎn)因子——霉菌毒素 ［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2017，38（9）：41-43.

［3］郝慶紅，郭云霞，劉月琴，等.雞源抗腹瀉芽胞益生菌JM-35搖瓶發(fā)酵產(chǎn)芽胞條件優(yōu)化［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（2）：103-107.

［4］吳逸飛，趙旭民，黃小暉，等.凝結(jié)芽胞桿菌產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.飼料工業(yè)，2013，34（23）：22-24.

［5］楊立華，趙述淼，冷一非，等.一株凝結(jié)芽胞桿菌產(chǎn)芽胞條件的研究［J］.中國釀造，2010（5）：96-98.

［6］郭曉軍，郭威，楊繼業(yè)，等.堆肥用產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選、鑒定及產(chǎn)芽胞條件優(yōu)化 ［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（16）：61-64，293.

［7］程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，2012.

［8］楊繼業(yè)，郭曉軍，郭威，等.產(chǎn)有機(jī)酸芽胞桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)芽胞條件優(yōu)化 ［J］. 飼料工業(yè)，2015，36（4）：44-51.

［9］陳秋紅，孫梅，匡群，等.培養(yǎng)條件對凝結(jié)芽胞桿菌芽胞形成的影響［J］.生物技術(shù)，2009，19（1）：77-81.