樊苗苗 陳肖學(xué) 張 訸 羅旭璐 曾為林 劉 麗 伍建榕 李 靖 趙 平

(1. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)與利用學(xué)院，云南 昆明 650224；3. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)，但不引起植物組織明顯病害癥狀的真菌，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分，在促進(jìn)宿主生長(zhǎng)、抗逆和抗病害等方面扮演著重要角色[1]。自1993年Stierle等[2]首次從短葉紅豆杉 (Taxusbreviflora) 韌皮部分離得到具有生產(chǎn)抗癌物質(zhì)紫杉醇的安德氏紫杉菌 (Taxomycesandreanae) 以來，引起了研究者對(duì)內(nèi)生真菌的廣泛關(guān)注。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)生真菌能夠生產(chǎn)與宿主植物相同或相似的活性次生代謝產(chǎn)物，其成為獲取活性天然產(chǎn)物的重要來源之一[3-5]。張文豪等[6]從側(cè)柏 (Platycladusorientalis) 1株內(nèi)生真菌球毛殼菌 (Chaetomiumglobosum) 發(fā)酵液中分離得到的球毛殼菌素A對(duì)枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis) 等4種病原細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。王麗薇等[7]從無花果 (Ficuscarica) 葉中分離得到的1株炭角菌屬 (Xylaria) 內(nèi)生真菌，其代謝產(chǎn)物細(xì)胞松弛素Q對(duì)11種植物病原真菌和3種腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抑制活性。

樟葉越桔 (Vacciniumdunalianum) 為杜鵑花科 (Ericaceae) 越桔屬植物[8]，多年生常綠灌木，生于山坡灌叢、闊葉林下或石灰山灌叢，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、西藏等地，在云南主要分布于云南西北部經(jīng)滇中高原至滇南和滇東南[9-10]。其幼嫩葉芽氨基酸種類齊全，含量豐富，據(jù)記載自明代開始即作為茶代用品在滇中地區(qū)長(zhǎng)期飲用至今，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[11-12]。Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)該植物富含咖啡酰熊果苷類功能性物質(zhì)，但其高含量蓄積是否與植物內(nèi)生真菌協(xié)助宿主植物抵御脅迫有關(guān)尚不清楚。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)越桔屬植物內(nèi)生真菌的研究較少，且多集中內(nèi)生真菌的多樣性研究方面[14-16]。僅徐大可等[17]從篤斯越橘 (V.uligionsum) 根部獲得1株具有病原真菌拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌DUT菌株，該菌株對(duì)菜豆炭疽病病原真菌 (Colletotrichumlindemuthianum)、越桔葉斑病病原真菌 (Pestalotiopsissp.) 和柯氏帚梗柱孢霉 (Cylindrocladiumcolhounii) 的抑菌率分別為70.5%、68.6%和57.7%。

本研究以小麥雪腐病菌 (Typhlaincarnata) 等10種植物病原真菌作為靶標(biāo)菌，首次采用平板對(duì)峙法和生長(zhǎng)速率法評(píng)價(jià)樟葉越桔葉內(nèi)生真菌的拮抗效果及其代謝產(chǎn)物的抑菌活性，以期為具有抑菌活性內(nèi)生真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株

2016年10月采集云南省武定縣樟葉越桔健康植物葉片組織，分離得到的34株內(nèi)生真菌作為本研究供試內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)鑒別和分子鑒定后保存，菌株編號(hào)及其歸屬見表1。

表1 34株樟葉越桔葉內(nèi)生真菌菌株歸屬Table 1 Strain attribution of 34 endophytic fungi from the leaves of V.dunalianum

以10種常見植物病害病原真菌 (小麥雪腐病菌、三七絲核病菌 (Verticilliumcinnabarium)、棉花枯萎病菌 (Fusariumoxysporiumf. sp.vasinfectum)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichumcapsici)、番茄灰霉病菌 (Botrytiscinerea)、辣椒鐮刀病菌 (Fusariumsolani)、梨黑星病菌 (Venturiapyrina)、水稻稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)、黃瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporiumsp.cucumebrium)、白菜黑斑病菌 (Alternariabrassicae)) 作為本研究供試病原真菌。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)內(nèi)生真菌，PDB培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌發(fā)酵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株培養(yǎng)

內(nèi)生真菌平板培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)中將滅過菌的PDA培養(yǎng)基倒平板，每個(gè)平板約倒20 mL培養(yǎng)基，用接種針挑取菌絲體部分接種于平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d。

內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng) 各菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5～7 d后，用直徑0.5 cm的打孔器在菌落邊緣制備菌餅，分部接入50 mL PDB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min 的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5～7 d，得到種子液。配制新的PDB液體培養(yǎng)基，每瓶接入約3%的種子液，在28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d，結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2發(fā)酵液的處理

采用抽濾裝置對(duì)各菌株發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，發(fā)酵濾液在1 200 r/min、4 ℃條件下離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入滅菌離心管中重復(fù)離心2次，所得上清液用0.22 mL微孔濾膜過濾后，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3抑菌活性測(cè)試

發(fā)酵液的抑菌實(shí)驗(yàn) 采用生長(zhǎng)速率法[18-19]測(cè)定發(fā)酵液對(duì)10種植物病原真菌的抑菌活性，按公式 (1) 計(jì)算抑菌率：

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑 × 100%

(1)

內(nèi)生真菌與病原真菌拮抗實(shí)驗(yàn) 采用對(duì)峙法[20]測(cè)定內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗活性。根據(jù)內(nèi)生真菌抑菌活性結(jié)果，從中選取抑菌活性強(qiáng)弱不等的25個(gè)菌株進(jìn)一步測(cè)定它們對(duì)植物病原真菌的拮抗效果，并選用抑菌響應(yīng)指數(shù)較高的小麥雪腐病菌、三七絲核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒鐮刀病菌和白菜黑斑病菌等5種病原真菌作為拮抗指示菌株，按公式 (1) 計(jì)算抑菌率。

抑菌率 < 25%標(biāo)記為 “+”，25% ≤ 抑菌率 < 50%標(biāo)記為 “++”，抑菌率 ≥ 50%標(biāo)記為 “+++”,“-” 表示沒有抑制作用，抑菌指數(shù)為 “+” 個(gè)數(shù)的累加數(shù)值[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)病原真菌的抑制作用

不同內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)不同病原真菌的抑菌活性差別較大，見表2。抑菌活性最強(qiáng)的菌株是VDL36，抑菌指數(shù)為17，且對(duì)三七絲核病菌、番茄灰霉病菌和辣椒鐮刀病菌等3株病原真菌的抑制率超過50%，其中對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性最強(qiáng) (圖1)，抑菌率達(dá)85.17%。其次，抑菌活性較強(qiáng)的菌株是VDL31和VDL166，抑菌指數(shù)為16，它們至少對(duì)4種以上的病原真菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性。但VDL105和VDL106對(duì)10株病原真菌均無抑菌活性。此外，就同一植物病原菌而言，不同內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)其抑制效果也不同。其中，對(duì)白菜黑斑病菌表現(xiàn)出抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株最多，有28株，抑菌響應(yīng)指數(shù)達(dá)48；其次對(duì)三七絲核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒鐮刀病菌和小麥雪腐病菌分別有27、27、27和23株菌株表現(xiàn)出抑菌活性，抑菌響應(yīng)指數(shù)分別為41、36、34和30。

2.2 內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗作用

前人研究表明，抑制率 ≥ 75%為強(qiáng)拮抗能力，抑菌率為50%～75%具有較強(qiáng)拮抗能力，抑制率 < 50%為弱拮抗能力[21]。樟葉越桔葉內(nèi)生真菌對(duì)白菜黑斑病菌 (圖2) 和三七絲核病菌 (圖3)拮抗作用較強(qiáng)，抑菌率最高分別達(dá)到66.47%和68.57%，見表3。抑菌率 > 75%的菌株有VDL36，抑菌率為50%～75%的菌株有9株，抑菌率 < 50%的菌株有15株。VDL105和VDL106對(duì)5種植物病原真菌均無拮抗作用，與表2所示結(jié)果一致。從對(duì)單一病原真菌的抑菌率來看，對(duì)小麥雪腐病菌抑菌率 > 50%的有VDL31和VDLS67，三七絲核病菌抑菌率 > 50%的有VDL36、VDL570、VDL164和VDL42，番茄灰霉病菌抑菌率 > 50%的有VDL36，辣椒鐮刀病菌抑菌率 > 50%的有VDL36，白菜黑斑病菌抑菌率 > 50%的有VDL570、VDLS64、VDLS84、VDL166和VDLS62。VDL36對(duì)5種植物病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性，其中對(duì)番茄灰霉病菌、辣椒鐮刀病菌和三七絲核病菌拮抗作用較強(qiáng)，抑菌率分別為83.26%、68.82%和68.57%，與生長(zhǎng)速率法所得出的結(jié)果相吻合。

表2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)10種植物病原真菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of the fermentation broth of endophytic fungi on 10 plant pathogenic fungi

圖1煙曲霉菌VDL36發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果
Fig.1 Inhibitory effects ofA.fumigatusVDL36 onBotrytiscinerea

圖2菌株VDL164和VDL166對(duì)白菜黑斑病菌的拮抗效果
Fig.2 Antagonistic effects of VDL164 and VDL166 strains onA.brassicae

圖3菌株VDL164和VDL166對(duì)三七絲核病菌的拮抗效果
Fig.3 Antagonistic effects of VDL164 and VDL166 strains onV.cinnabarium

表3 內(nèi)生真菌對(duì)5種植物病原真菌的拮抗效果Table 3 Antagonistic effects of endophytic fungi on 5 plant pathogenic fungi

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樟葉越桔葉內(nèi)生真菌對(duì)白菜黑斑病菌和三七絲核病菌的抑菌活性最強(qiáng)，這2種植物病原真菌更適合作為樟葉越桔葉內(nèi)生真菌抗菌活性指示菌株。且樟葉越桔葉內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)這2種植物病原真菌的抑菌響應(yīng)指數(shù)最高，有望以高活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物為基礎(chǔ)，開發(fā)出防治白菜黑斑病和三七絲核病的相關(guān)微生物制劑。

拮抗活性實(shí)驗(yàn)表明有10株內(nèi)生真菌分別對(duì)小麥雪腐病菌、三七絲核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒鐮刀病菌和白菜黑斑病菌具有較強(qiáng)的拮抗效果。其中，VDL36對(duì)5種植物病原真菌均表現(xiàn)出拮抗活性，尤其對(duì)番茄灰霉病菌、辣椒鐮刀病菌和三七絲核病菌的拮抗活性較強(qiáng)，抑菌率分別為83.26%、68.82%和68.57%。樟葉越桔葉內(nèi)生真菌VDL36對(duì)多種植物病原真菌的高拮抗活性結(jié)果與其他來源煙曲霉具有的抑菌活性類似，如源于北極海泥的煙曲霉對(duì)白色念珠菌 (Candidaalbicans) 具有較好的抑制活性[22]，源于恒山黃芪的煙曲霉對(duì)番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、辣椒疫霉病菌 (Phytophthoracapsici)、煙草赤星病菌 (Alternariaalternata) 等均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性[23]，表明針對(duì)煙曲霉抑菌活性物質(zhì)值得進(jìn)一步深入系統(tǒng)的開展研究，具有良好的開發(fā)利用前景。此外，曲霉屬真菌能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，不僅具有新穎獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，而且具有抑菌、抗癌、抗腫瘤、殺蟲和除草等多種生物活性[24-25]，是活性先導(dǎo)化合物的主要來源之一。如Sugie等[26]從委瑞內(nèi)拉土壤中來源的赭曲霉 (Aspergillusochraceus) CL41582菌株的發(fā)酵液中分離得到的化合物CJ-17665，具有良好的抑制金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)、釀膿鏈球菌 (Streptococcuspyogenes) 生長(zhǎng)的活性，Song等[27]從中國(guó)渤海海底60 m沉積物中分離得到的雜色曲霉 (Aspergillusversicolor) MF030 的固體發(fā)酵提取液中分離得到的化合物brevianamides S具有選擇性抗結(jié)核分枝桿菌的活性，表明曲霉屬內(nèi)生真菌抑菌活性較強(qiáng)，值得進(jìn)一步深入研究和開發(fā)利用。

目前對(duì)植物內(nèi)生真菌的研究顯示，約有30%的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，對(duì)多種病原真菌具有廣譜性或?qū)Ｒ豢剐訹28]。本研究中除了菌株VDL105和VDL106之外，供試34株內(nèi)生真菌中有32株均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。此外，內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的活性因菌株不同而有較大差異，即使同一菌株對(duì)不同病原真菌的抑制活性也不同。樟葉越桔葉中的內(nèi)生真菌也不例外，如VDLS67和VDL31對(duì)小麥雪腐病菌的抑制活性分別為61.00%和58.05%，而其他23個(gè)菌株對(duì)小麥雪腐病菌的抑制活性均小于50%，個(gè)別菌株甚至不表現(xiàn)出抑菌活性。VDLS64只對(duì)白菜黑斑病菌表現(xiàn)出強(qiáng)的抑菌活性，而對(duì)其他4種植物病原真菌的抑菌活性都較弱，同樣說明植物內(nèi)生真菌對(duì)不同病原真菌的抑菌作用既表現(xiàn)出一定的選擇性，也具有專一性。

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