李雙雙，陳 晨，段鵬鵬，許 欣，熊正琴

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095）

生物質(zhì)炭對酸性菜地土壤N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的影響

李雙雙，陳 晨，段鵬鵬，許 欣，熊正琴*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095）

【目的】生物質(zhì)炭顯著影響土壤氧化亞氮 (N2O) 排放，但關(guān)于其相關(guān)微生物機(jī)理的研究相對匱乏，尤其是生物質(zhì)炭對酸性菜地土壤N2O排放的微生物作用機(jī)理。本文通過研究氮肥配施生物質(zhì)炭對酸性菜地土壤N2O排放以及硝化和反硝化過程相關(guān)功能基因豐度的影響，探討酸性菜地土壤N2O排放與功能基因豐度的關(guān)系，闡釋生物質(zhì)炭對酸性菜地土壤試驗(yàn)N2O排放的微生物作用機(jī)理。【方法】在田間一次性施入生物質(zhì)炭 40 t/hm2，試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行了3年，共9茬蔬菜。設(shè)置4個處理：對照 (CK)、氮肥 (N)、生物質(zhì)炭 (Bc) 和氮肥 + 生物質(zhì)炭 (N +Bc)。在施用后第三年，采集土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測硝化過程氨氧化古菌(AOA)、氨氧化細(xì)菌 (AOB) 功能基因amoA和反硝化過程亞硝酸還原酶基因 (nirK、nirS) 以及N2O還原酶基因(nosZ) 等相關(guān)功能基因豐度，同時(shí)監(jiān)測土壤pH值、無機(jī)氮 (銨態(tài)氮、硝態(tài)氮) 含量及N2O排放。【結(jié)果】與CK相比，生物質(zhì)炭 (Bc) 處理的土壤有機(jī)碳 (SOC) 提高了27.1%，總氮 (TN) 提高了8.2%，amoA-AOB基因豐度顯著降低了11.0%，nosZ基因豐度增加了21.2% (P＜ 0.05)，N2O排放沒有顯著變化 (P＞ 0.05)。與CK相比，施用氮肥 (N) 顯著降低土壤pH (P＜ 0.05)，顯著增加土壤無機(jī)氮含量、nirK、nirS和nosZ功能基因豐度以及土壤N2O累積排放量 (P＜ 0.05)。與N處理相比，生物質(zhì)炭與氮肥聯(lián)合施用 (N + Bc) 處理顯著增加amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS和nosZ基因豐度，增幅分別為68.1%、39.3%、21.1%、19.8%、48.4% (P＜ 0.05)，但(nirK+nirS)/nosZ的比值降低，同時(shí)N2O累積排放量顯著降低33.3% (P＜ 0.05)。室內(nèi)培養(yǎng)期間N2O排放峰出現(xiàn)在1～5 d，N和N+Bc處理排放速率分別為 N 1.70 × 103和1.76 × 103ng/(kg·h)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，N2O排放速率與氧化亞氮還原酶的標(biāo)記基因nosZ基因拷貝數(shù) (P＜ 0.05)、NH4+-N含量 (P＜ 0.01) 呈顯著正相關(guān)，與pH呈顯著負(fù)相關(guān) (P＜ 0.01)?！窘Y(jié)論】在菜地生態(tài)系統(tǒng)中氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用可以有效緩解菜地土壤酸化，減少菜地土壤N2O排放，主要?dú)w因于反硝化作用nosZ基因豐度增加，(nirK+nirS)/nosZ比值降低。

菜地土壤；N2O排放；生物質(zhì)炭；硝化過程功能基因 ；反硝化過程功能基因

氧化亞氮 (N2O) 是重要的溫室氣體之一，與二氧化碳 (CO2) 的全球增溫潛勢 (GWP) 相比，N2O在100年時(shí)間尺度上的增溫潛勢約為CO2的298倍[1]，且其在大氣中的濃度以每年0.2%～0.3%的速率增長[2]。菜地生態(tài)系統(tǒng)因其耕作頻繁、復(fù)種指數(shù)高和氮肥施用量大等特點(diǎn)導(dǎo)致一系列環(huán)境問題[3–4]，例如氮肥利用率低、硝酸鹽累積、土壤酸化[5–6]，以及N2O的大量排放[7]等。土壤pH降低導(dǎo)致N2O/N2比值更高，增加N2O排放的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[6]。

生物質(zhì)炭 (biochar) 被認(rèn)為能夠改善土壤特性，增加作物產(chǎn)量，通過吸持作用降低酸性土壤交換性H+的水平，提高鹽基飽和度和土壤pH[8–10]。研究表明，施用生物質(zhì)炭可有效緩解農(nóng)田土壤N2O排放[11–12]，或沒有顯著影響[13–14]，或增加N2O排放[15]，因此施用生物質(zhì)炭對N2O排放的作用具有不確定性。已有研究表明，生物質(zhì)炭減少N2O排放的可能原因主要有：1) 增加吸附土壤NO3–，降低基質(zhì)有效性[16]；2)增加土壤孔隙而降低反硝化作用[17]；3) 提高土壤pH而促進(jìn)N2O還原為N2[18]；4) 由于自身含有乙烯而抑制硝化作用和NO3–的形成[19]。近來的研究開始從微生物角度揭示生物質(zhì)炭對土壤N2O排放的影響機(jī)理，主要包括土壤的硝化 (amoA) 和反硝化 (nirK、nirS和nosZ) 功能基因群落的組成和結(jié)構(gòu)[20–22]，但其研究結(jié)果尚未統(tǒng)一。王曉輝等[21]研究發(fā)現(xiàn)施用生物質(zhì)炭顯著提高了nirK基因的群落豐度，但對nirS和nosZ基因豐度沒有顯著影響。由于N2O形成途徑復(fù)雜、產(chǎn)生N2O的生態(tài)系統(tǒng)具有多樣性，生物質(zhì)炭對菜地土壤N2O排放的微生物作用機(jī)制并不明確。本研究采用室內(nèi)培養(yǎng)和熒光定量PCR技術(shù)，探究酸性菜地田間施用生物質(zhì)炭后對相關(guān)功能基因豐度和N2O排放的影響，為揭示生物質(zhì)炭對菜地土壤N2O排放的微生物學(xué)機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)點(diǎn)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于江蘇省南京市高橋門鎮(zhèn)上坊村(32°01′N，118°52′E) 集約化種植菜地 (具有 15 年的種植歷史)。該地區(qū)屬于典型的長江中下游亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫15.4℃，年均降水量1.11 × 103mm。一年可以種植3～5季蔬菜，是南方集約化蔬菜生產(chǎn)的典型代表。試驗(yàn)地土壤屬于黃棕壤，質(zhì)地為粉粘壤土 (粘粒30.1%、粉粒64.7%和砂粒5.2%)。初始土壤pH為5.5，容重1.2 g/cm3，有機(jī)碳 (SOC)15.6 g C/kg，總氮 (TN) 1.9 g/kg，陽離子交換量(CEC) 31.2 cmol/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)設(shè)置4個處理：對照 (CK)；氮肥(N)；生物質(zhì)炭 (Bc)；氮肥+生物質(zhì)炭 (N + Bc)。每個小區(qū)面積為 6 m2(3 m × 2 m)，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。田間管理包括蔬菜品種、施肥量和施用方法、耕作、灌溉、除蟲和雜草控制，與當(dāng)?shù)剞r(nóng)民管理方式保持一致。氮肥施用量為常規(guī)施用量N 1.25 × 103kg/(hm2·a)，施氮處理均使用復(fù)合肥，其N∶P2O5∶K2O比例為15∶15∶15。生物質(zhì)炭于2012年4月一次性施入土壤中，施用量為40 t/hm2，翻耕混勻，生物質(zhì)炭施用后近3年內(nèi)共種植9季蔬菜，不同處理種植蔬菜種類和農(nóng)業(yè)管理措施等保持一致。生物質(zhì)炭為河南三利新能源有限公司生產(chǎn)，由小麥秸稈在500℃條件下高溫?zé)岱纸庵频?，pH 9.4、總碳量46.7 g/kg、全氮 5.6 g/kg、CEC 24.1 cmol/kg、表面積 8.9 m2/g、灰分20.8%。土壤樣品于2014年9月蔬菜成熟季采集，在每個小區(qū)內(nèi)均勻分布采樣，用土鉆獲得0—20 cm土層鮮土，取15 g用于土壤理化性質(zhì)測定，2 g置于–80℃冰箱供微生物測定，其余置于4℃冰箱供室內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 室內(nèi)培養(yǎng)

取出貯存于4℃冰箱的鮮土，過2 mm篩，分別稱取相當(dāng)于30 g烘干土的新鮮土樣于250 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于 (28 ± 1)℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，用注射器均勻添加N 200 mg/kg(NH4)2SO4溶液，并調(diào)節(jié)含水量至65%土壤持水量(water holding capacity，WHC)。然后置于 (28 ± 1)℃恒溫培養(yǎng)5周，培養(yǎng)期間每天用稱重法添加蒸餾水以保持土壤含水量。整個試驗(yàn)期采樣測定N2O濃度，第1～2周每天測定1次，第3～5周每周測定2次，采集方式為用20 mL三通閥注射性針筒在培養(yǎng)瓶密閉后0、5 h分別采集氣體樣品。

1.4 樣品分析

采用氣相色譜儀 (Agilent 7890A，上海) 測定樣品中的N2O濃度，檢測器為ECD。每個處理分別于第1、7、14、21、28和35 d破壞性取樣以測定pH、銨態(tài)氮 (NH4+-N)、硝態(tài)氮 (NO3–-N) 和amoA、nirS、nirK和nosZ基因豐度。

1.5 土壤理化性質(zhì)和功能基因豐度測定

土壤pH采用精密pH計(jì) (PHS-3C) 測定，土水比為1∶5 (m/v)；SOC含量采用重鉻酸鉀容量法測定，TN含量采用開氏法測定[23]，NH4+-N含量測定采用2 mol/L KCl浸提—靛酚藍(lán)比色法，NO3–-N含量測定采用 2 mol/L KCl浸提—紫外分光光度法。

利用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒 (MP Biomedicals)，根據(jù)操作指南提取土壤微生物總DNA。由于腐殖酸的存在影響樣品的下游分子分析，而菜地土壤中腐殖酸含量較高，因此本研究采用5.5 mol/L異硫氰酸胍 (Guanidine thiocyanate) 反復(fù)清洗DNA，除去腐殖酸，并將DNA溶解于100 μL無菌水后于零下–20℃保存待用。

土壤氨氧化細(xì)菌氨單加氧酶基因 (amoA-AOB)、氨氧化古菌 (amoA-AOA)，亞硝酸鹽還原酶基因(nirK、nirS) 和氧化亞氮還原酶基因 (nosZ) 定量PCR擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件如表1所示。定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線采用含有古菌和細(xì)菌的amoA、nirK、nirS和nosZ基因的克隆進(jìn)行制備。首先采用特定引物分別擴(kuò)增目標(biāo)基因，構(gòu)建克隆文庫后，將含有目標(biāo)基因的克隆在LB營養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒純化并測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)摩爾常數(shù)計(jì)算目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，并將質(zhì)粒連續(xù)稀釋8～10個數(shù)量級，從而獲得各目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR于CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad 公司) 上完成。定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR

表 1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件Table 1 The amplification primer and reaction condition of quantitative PCR

Green (TaKaRa 日本)10 μL、Rox DYEII 0.2 μL、DNA 模板 1 μL、上下游引物 (10 μmol/L) 各 0.4 μL、滅菌水8.0 μL。每次試驗(yàn)均設(shè)置嚴(yán)格的陰性對照，采用滅菌雙蒸水代替DNA作為反應(yīng)模板。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003和SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和圖表制作，采用JMP 9.0軟件對培養(yǎng)期間土壤理化性質(zhì) (pH、SOC、TN、和各功能基因豐度的動態(tài)變化進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，用Tukey法對田間試驗(yàn)各處理的土壤理化性質(zhì)和培養(yǎng)期間N2O累積排放量進(jìn)行多重比較(α = 0.05)，采用SigmaPlot 12.5軟件對培養(yǎng)期間各處理N2O排放速率與土壤性質(zhì)及相關(guān)功能基因豐度的動態(tài)變化進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間施用生物質(zhì)炭和氮肥對土壤理化性質(zhì)和功能基因豐度的影響

由表2可見，田間試驗(yàn)施用生物質(zhì)炭近3年后，與CK處理相比，施用氮肥 (N) 顯著降低土壤pH (P＜ 0.05)，對CEC沒有顯著影響；單施生物質(zhì)炭 (Bc) 顯著提高土壤SOC含量27.1%和TN含量8.2% (P＜ 0.05)，土壤pH則沒有顯著改變。與N處理相比，N + Bc處理顯著增加SOC含量24.4%、pH值 18.2% 和 CEC含量13.7% (P＜ 0.05)。

與CK處理相比，N處理均顯著降低amoAAOA和amoA-AOB豐度，增加nirK、nirS和nosZ豐度。Bc處理顯著增加nosZ豐度 (P＜ 0.05)，amoA-AOA、nirK和nirS豐度則均沒有改變。與N處理相比，N + Bc處理均顯著增加amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS和nosZ豐度，增幅分別為68.1%、39.3%、21.1%、19.8%、48.4% (P＜ 0.05)。N + Bc處理的 (nirS+nirK)/nosZ比值顯著低于N處理 (P＜ 0.05)。

2.2 室內(nèi)培養(yǎng)期間各處理N2O排放動態(tài)變化及累積排放量

采集前述田間試驗(yàn)處理土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，在初始添加 (NH4)2SO4溶液后，CK和Bc處理培養(yǎng)期間未出現(xiàn)明顯的N2O排放峰；在第14～21 d，N2O排放量略高于培養(yǎng)前期 (0～14 d)(圖1)。而N和N + Bc處理的N2O排放速率顯著增加，在1～5 d出現(xiàn)N2O排放峰，排放速率分別為N 1.70 × 103和1.76 × 103ng /(kg·h)，但 N 和 N + Bc處理的排放速率差異不顯著 (P＞ 0.05)；在7～15 d，N和N + Bc處理N2O排放速率迅速降低，且此階段N處理N2O排放速率顯著高于N + Bc處理 (P＜ 0.05)。方差分析表明，培養(yǎng)時(shí)間、處理以及其交互作用均顯著影響培養(yǎng)期間N2O排放速率 (P＜ 0.01)。

培養(yǎng)期內(nèi)CK和Bc處理N2O累積排放量顯著低于N和N + Bc處理，且二者之間沒有顯著差異；N處理N2O累積排放量顯著高于CK處理 (P＜ 0.001)，

表 2 田間施用生物質(zhì)炭3年后土壤基本性質(zhì)Table 2 Soil physicochemical properties after 3 years of field treatment with N fertilizer and biochar application in the acidic vegetable field

圖 1 室內(nèi)培養(yǎng)各處理N2O排放的動態(tài)變化及累積排放量Fig. 1 Dynamics of N2O fluxes and cumulative N2O emissions during the 35-day incubation

是CK處理的6.7倍 (圖1)；與N處理相比，N +Bc處理顯著降低N2O累積排放量33.3% (P＜ 0.001)。雙因子方差分析結(jié)果顯示，氮肥和生物質(zhì)炭對N2O累積排放量的影響具有顯著的交互作用 (P＜ 0.001)。

2.3 室內(nèi)培養(yǎng)各處理土壤pH和無機(jī)氮含量的動態(tài)變化及方差分析

采集前述田間試驗(yàn)處理土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，在初始加入 (NH4)2SO4溶液后，各處理土壤pH值都呈現(xiàn)降低的趨勢 (圖2a)；N處理土壤pH值在7 d后則呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢；整個培養(yǎng)期間N處理的pH值均顯著低于N + Bc處理 (P＜ 0.05)。

N和N + Bc處理土壤NH4+-N含量在初始加入(NH4)2SO4溶液后，迅速上升后則呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢，CK和Bc處理土壤NH4+-N含量降幅更加顯著(圖2b)。整個培養(yǎng)期間N處理的NH4+-N含量顯著高于N + Bc處理，且顯著高于CK和Bc處理 (P＜ 0.05)；CK和Bc處理之間土壤NH4+-N含量差異不顯著。

CK和Bc處理土壤NO3–含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，施用氮肥的N和N + Bc處理培養(yǎng)期內(nèi)土壤NO3–含量呈現(xiàn)降低趨勢 (圖2c)。整個培養(yǎng)期間，施用氮肥的N和N + Bc處理土壤NO3–-N含量基礎(chǔ)值顯著高于CK處理 (P＜ 0.05)；N + Bc處理的NO3–-N含量均顯著高于N處理 (P＜ 0.05)；除第28 d外，CK和Bc處理的土壤NO3–含量沒有顯著差異。方差分析表明，培養(yǎng)時(shí)間、處理以及其交互作用均顯著影響土壤含量 (P＜ 0.01)。

圖 2 室內(nèi)培養(yǎng)中土壤pH、NH4+-N content和NO3–-N變化趨勢Fig. 2 Dynamics of soil pH, NH4+-N and NO3–-N content during incubation of four treatments with (NH4)2SO4 addition

2.4 室內(nèi)培養(yǎng)各處理微生物功能基因豐度的動態(tài)變化及方差分析

采集前述田間試驗(yàn)處理土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，在初始加入 (NH4)2SO4溶液后，CK和Bc處理土壤amoA-AOB和amoA-AOA功能豐度均迅速上升，amoA-AOB豐度在第1 d達(dá)到峰值，分別為24.3 ×107(CK)、20.3 × 107(Bc) 拷貝數(shù) g–1d.w.s，之后逐漸下降；而amoA-AOA豐度在第14 d達(dá)到峰值，分別為 19.1 × 105(CK)、18.7 × 105(Bc) 拷貝數(shù) g–1d.w.s，14～21 d迅速下降，之后趨于平緩 (圖3a, 3b)。N處理土壤在整個培養(yǎng)期間amoA-AOB和amoA-AOA豐度均呈緩慢上升，但其amoA-AOB和amoA-AOA豐度均顯著低于CK處理 (P＜ 0.05)。N + Bc處理的amoA-AOB和amoA-AOA豐度在第1 d顯著降低，但降幅不同；隨后amoA-AOB豐度緩慢上升，amoA-AOA豐度呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢。

培養(yǎng)期間各處理土壤nirK、nirS豐度顯著增加，之后均呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢 (圖3c，圖3d)；CK和Bc處理土壤nirK、nirS豐度沒有顯著差異 (除第14 d，Bc處理的nirS基因豐度顯著高于CK處理)。N處理土壤nirK、nirS功能基因豐度均顯著高于 CK處理 (P＜ 0.05)，N + Bc處理土壤nirK、nirS基因豐度均顯著高于N處理 (P＜ 0.05)。

培養(yǎng)期間CK和Bc處理土壤nosZ功能基因豐度呈現(xiàn)上下波動趨勢，波動幅度不大 (圖3e)；N和N +Bc處理土壤nosZ基因豐度迅速上升，在第14天達(dá)到峰值，14～35 d迅速下降；N和N + Bc處理土壤nosZ基因豐度均顯著高于CK處理。除第1、28和35 d外，N + Bc處理的nosZ功能基因豐度均顯著高于 N 處理 (P＜ 0.05)。

方差分析表明，培養(yǎng)時(shí)間、處理以及其交互作用均顯著影響amoA-AOA和nosZ(P＜ 0.01)，而該交互作用對nirK、nirS豐度沒有顯著影響。

2.5 菜地土壤室內(nèi)培養(yǎng)各處理N2O排放與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系

菜地各處理土壤室內(nèi)培養(yǎng)期間，amoA-AOB、amoA-AOA基因豐度與pH呈顯著正相關(guān) (r分別為0.85、0.78，P＜ 0.01)(表 3)，與 NO3–-N呈顯著負(fù)相關(guān) (r分別為–0.58、–0.68，P ＜ 0.01)，nosZ 基因豐度與呈顯著正相關(guān) (r = 0.60，P ＜ 0.01)，nirS基因豐度與pH呈顯著正相關(guān) (r = 0.45，P ＜0.05)。 N2O排放速率與氧化亞氮還原酶的標(biāo)記基因nosZ基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān) (r = 0.45，P ＜ 0.05)，與含量也呈現(xiàn)顯著正相關(guān) (r = 0.54，P ＜0.01)，與 pH 則呈顯著負(fù)相關(guān) (r = –0.54，P ＜ 0.01)。

圖 3 室內(nèi)培養(yǎng)中不同處理amoA-AOB、amoA-AOA、nirK、nirS 和nosZ 基因豐度變化趨勢Fig. 3 Dynamics in the abundance of amoA-AOB, amoA-AOA, nirK,nirS, nosZ genes during incubation under four treatments based on qPCR analysis

表 3 N2O排放速率與氨氧化古菌基因、氨氧化細(xì)菌、以及亞硝酸鹽還原酶基因、氧化亞氮還原酶基因與土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系 (r)Table 3 Correlation coefficients among N2O emission rate, soil physiochemical properties and ammonia-oxidizing archaea (amoA-AOA), ammonia-oxidizing bacteria (amoA-AOB), abundance of nitrite reductase (nirK, nirS) gene,N2O reductase (nosZ) gene during incubation

3 討論

3.1 氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用對菜地土壤N2O排放的影響

微生物主導(dǎo)的N2O產(chǎn)生包括多種過程，如硝化作用、硝化細(xì)菌反硝化作用、反硝化作用、聯(lián)合反硝化及硝酸鹽異化還原過程[30]，受土壤pH、無機(jī)氮含量、SOC含量等眾多因素的影響。本研究CK和Bc處理的N2O累積排放量很低 (圖1)，培養(yǎng)期間土壤NH4

+-N含量迅速下降，NO3–-N含量相應(yīng)地迅速上升，具有較強(qiáng)的硝化作用，同時(shí)反硝化作用較弱，推測硝化作用并不是該菜地土壤N2O產(chǎn)生的主要來源。CK和Bc處理反硝化作用弱，N2O排放量也很低 (圖 1)。

大量研究表明，氮肥施用是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)N2O排放的重要來源[1]，施用氮肥能夠顯著增加酸性土壤N2O排放[31–33]。本研究添加外源氮肥后，與CK和Bc處理相比，N和N + Bc處理顯著刺激土壤的N2O排放 (圖1)。這可能是由于：1) 長期施用N肥顯著增加土壤SOC含量 (表2，P ＜ 0.05)，為反硝化微生物的生長提供充足的碳源[34]；2) 較高的NO3–含量為反硝化微生物提供充足的底物[35](表2)。培養(yǎng)期間N和N + Bc處理與含量變化不成比例 (圖2)；添加外源氮肥后，各施氮處理土壤濃度維持較高水平，被明顯消耗，濃度維持在較低水平，表明該菜地施氮處理土壤硝化作用較弱，反硝化作用較強(qiáng)，因此推測N和N +Bc處理土壤N2O排放主要來源于反硝化過程。前人研究也表明，酸性菜地土壤中硝化作用較弱[36]。

施用生物質(zhì)炭能夠減緩N2O排放[37–39]。本研究中施用生物質(zhì)炭顯著減少培養(yǎng)期間菜地土壤N2O累積排放量 (圖1)，與該地區(qū)施用相同生物質(zhì)炭的大田試驗(yàn)結(jié)果一致[31,40]。在本研究中，施用生物質(zhì)炭提高了土壤pH (表2)，因此土壤pH增加可能是減少酸性菜地土壤N2O排放的原因之一[6]。Cayuela等[11]分析發(fā)現(xiàn)，施用生物質(zhì)炭平均降低54%農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)N2O的排放，推測主要是由于生物質(zhì)炭的“石灰效應(yīng)”影響土壤理化性質(zhì)和微生物數(shù)量，進(jìn)而影響N2O排放。

3.2 氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用對菜地土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度的影響

肥施用顯著降低

amoA

-AOB的豐度，可能是由于長期的氮肥施用導(dǎo)致土壤酸化，從而超出了細(xì)菌生長的閾值。Geisseler等研究表明，

amoA

-AOB生長的最適pH是5.5

[45]

。本研究相關(guān)分析表明

amoA

-AOA豐度與pH呈正相關(guān) (

r

= 0.97，

P

＜ 0.05)，說明

amoA

-AOA拷貝數(shù)隨土壤的酸化而顯著降低。Nicol等對pH梯度為4.9～7.5的草地土壤進(jìn)行的研究則發(fā)現(xiàn)

amoA

-AOA數(shù)量隨土壤pH降低而明顯升高

[46]

，與本研究結(jié)果相反，可能與供試土壤養(yǎng)分濃度有關(guān)。此外，

amoA

-AOB豐度與

呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(

P

＜ 0.01，表3)，因此推測土壤中較高

含量會對

amoA

-AOB造成不利的影響

[45]

。

表 3 水稻生育期和稻田休閑期土壤微生物量碳 (MBC)、氮 (MBN) 含量Table 3 Soil MBC and MBN contents during the rice growth and fallow periods

表 4 水稻生育期和稻田休閑期土壤各形態(tài)活性碳、氮組分比例Table 4 The contents and ratios of different active carbon and nitrogen during the rice cultivation and fallow periods

表 5 稻田休閑期土壤活性碳、氮與土壤養(yǎng)分及環(huán)境因子的相關(guān)分析 (n = 144)Table 5 Correlation between soil active organic carbon, nitrogen and SOC, TN contents and main affecting factors during the fallow period (n = 144)

本研究結(jié)果表明，生物質(zhì)炭田間施用近3年后顯著增加amoA-AOA和amoA-AOB豐度 (表2)，培養(yǎng)期間二者差異不顯著 (圖3)。Ducey等[22]研究也表明，培養(yǎng)6個月后，生物質(zhì)炭顯著增加了amoA-AOB豐度；也有研究表明，生物質(zhì)炭同時(shí)顯著增加amoAAOA和amoA-AOB豐度[47]。生物質(zhì)炭添加對硝化作用amoA-AOA、amoA-AOB豐度和反硝化作用nirS、nirK、nosZ豐度的影響不一致[11,22,47]。本研究通過近3年田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，N + Bc處理顯著提高土壤nirK、nirS、nosZ型反硝化功能基因豐度(表2，P＜ 0.05)，這可能是由于N + Bc顯著增加

–和SOC含量 (P＜ 0.05，表2)，為反硝化微生物提供充足底物，刺激反硝化微生物生長。因此，一方面生物質(zhì)炭對nirK和nirS基因豐度的增加促進(jìn)了土壤反硝化作用進(jìn)程，并促進(jìn)反硝化作用產(chǎn)生N2O；另一方面提高nosZ基因豐度，加速N2O還原為N2釋放到大氣中，促進(jìn)土壤反硝化作用完全進(jìn)行[11,46]。重復(fù)方差分析表明，N2O排放具有顯著的培養(yǎng)時(shí)間效應(yīng) (P＜ 0.01，表3)。本研究中N2O排放主要集中在培養(yǎng)前期，推測主要是生物質(zhì)炭中含有的溶解性有機(jī)碳刺激反硝化微生物。已有研究表明，當(dāng)土壤中溶解性有機(jī)碳的含量增加時(shí)，N2O排放增加，這可能是由于溶解性有機(jī)碳為反硝化菌的活動提供了能量[48–49]。Jones等研究表明，生物質(zhì)炭添加增加土壤溶解性有機(jī)碳濃度，本身含有的溶解性有機(jī)碳在培養(yǎng)36 h以內(nèi)就會被土壤微生物分解[50]。本研究中生物質(zhì)炭施用在一定程度上改變了反硝化微生物的組成，顯著增加nosZ型反硝化基因豐度 (圖3e)，降低土壤 (nirS+nirK)/nosZ比值，使得N2O消耗多于產(chǎn)生，最終降低其排放量，與前人研究結(jié)果一致[51]。這可能是生物質(zhì)炭能夠減少菜地土壤N2O排放的重要原因。Cayuela等[11]研究了15種農(nóng)業(yè)土壤后也指出，生物質(zhì)炭作為反硝化微生物的電子受體實(shí)現(xiàn)“電子穿梭”，把電子轉(zhuǎn)化到土壤反硝化微生物基團(tuán)中，促進(jìn)N2O還原為N2，降低N2O/(N2O + N2) 的比例，表明生物質(zhì)炭促進(jìn)反硝化作用的最后一步。另外生物質(zhì)炭的酸性緩沖能力和較大的比表面積以及電子轉(zhuǎn)移特性，促進(jìn)N2O還原為N2[52–53]。本研究中 N +Bc處理的反硝化基因 (nirK、nirS、nosZ) 豐度最高，說明其反硝化作用較強(qiáng)；相關(guān)分析也表明， (nirS +nirK)/nosZ比值與pH值呈顯著負(fù)相關(guān) (r= –0.99，P＜0.01)，表明生物質(zhì)炭在酸性土壤中是通過增加土壤pH、改變反硝化的產(chǎn)物比[6]，進(jìn)而減緩N2O排放。

本研究結(jié)果表明，生物質(zhì)炭顯著影響反硝化微生物的功能基因豐度 (nirK、nirS、nosZ)，對硝化過程中氨氧化微生物功能基因沒有顯著影響 (amoAAOA、amoA-AOB)。因此推測生物質(zhì)炭主要是通過促進(jìn)反硝化作用最后一步，實(shí)現(xiàn)減緩酸性菜地土壤的N2O排放。

4 結(jié)論

在蔬菜生態(tài)系統(tǒng)中氮肥和生物質(zhì)炭聯(lián)合施用可以有效緩解菜地土壤酸化，提高土壤質(zhì)量，減少菜地土壤N2O排放，這主要?dú)w因于酸性土壤反硝化作用中的nosZ基因豐度增加，菜地土壤中 (nirS+nirK)/nosZ比值降低，反硝化作用進(jìn)行完全，促進(jìn)N2O還原為N2。但是土壤中N2O排放是物理、化學(xué)、生物學(xué)等多方面因素綜合作用的結(jié)果，生物質(zhì)炭對菜地土壤微生物的影響機(jī)制，尤其是田間長期效應(yīng)及影響機(jī)制仍需深入研究。

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Effects of biochar application on N2O emissions and abundance of nitrogen related functional genes in an acidic vegetable soil

LI Shuang-shuang, CHEN Chen, DUAN Peng-peng, XU Xin, XIONG Zheng-qin*
(College of Resources of Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

【Objectives】Amendment of biochar significantly affected soil nitrous oxide (N2O) emission. It is still unclear about the underlying microbial mechanism for N2O emission, particularly in the acidic vegetable soil.By integrating the field experiments with indoor incubations and using real-time quantitative PCR technology, the microbial mechanism for effects of biochar on N2O emissions from an intensive vegetable field was investigated.【Methods】Soil samples were collected from a three-years’ field treatment with 22factorial design at N rates of 0 and 1.25 × 103kg/hm2and biochar rates of 0 and 40 t/hm2, namely control (CK), N fertilizer(N), biochar (Bc) and N fertilizer with biochar (N + Bc). The functional genes of ammonia oxidizing archaea(amoA-AOA), ammonia oxidizing bacteria (amoA-AOB), nitrite reductase (nirK,nirS) and nitrous oxide reductase(nosZ), soil pH, inorganic N concentration, in conjunction with soil N2O emissions were measured periodically.【Results】Compared with CK, biochar application significantly increased the concentration of SOC by 27.1%and TN by 8.2%, significantly decreased the copy numbers ofamoA-AOB and increased thenosZgenes by 11.0%and 21.2%, and had no significant effects on N2O emissions. Applying nitrogen fertilizer significantly reduced soil pH, increased N2O cumulative emissions, increased the content of inorganic nitrogen andnirK,nirS,nosZgene copy numbers (P＜ 05), compared with CK treatment. Compared with N treatment, biochar and nitrogen fertilizer combined application (N + Bc) significantly increased the abundance ofamoA-AOA,amoA-AOB,nirK,nirSandnosZgene copy numbers by 68.1%, 39.3%, 21.1%, 19.8% and 48.4%, respectively (P＜ 0.05), decreased the (nirK+nirS)/nosZratio, and reduced N2O emissions by 33.3%. The N2O emission peak appeard at 1–5 d during the indoor incubation, and the emission rate reached N 1.70 × 103and 1.76 × 103ng/(kg·h) for the N and N + Bc treatment, respectively. Correlation analysis indicated that N2O emission showed significant positive correlation with thenosZgene copy numbers (P＜ 0.05) and the content of NH4+-N (P＜ 0.01), while significant negative correlation with pH (P＜ 0.01) during the incubation.【Conclusions】The amendment of biochar could decrease N2O emissions from the acidic vegetable soil, which is mainly due to the accelerated N2O reduction via decreasing the ratio of (nirK+nirS)/nosZ.

vegetable soil; N2O emission; biochar; functional genes of nitrifiers ; functional genes of denitrifiers

2017–07–21 接受日期：2017–10–13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41471192）；公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科研專項(xiàng)（201503106）；國家科技支撐計(jì)劃（2013BAD11B01）資助。

聯(lián)系方式：李雙雙 E-mail：2016103088@ njau.edu.cn； *

熊正琴 E-mail：zqxiong@njau.edu.cn