吳逸璘

吉爾生化（上海）有限公司 上海 200241

植物病害經(jīng)常導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大損失?；瘜W(xué)殺菌劑在控制作物病害中起重要作用。然而，病原真菌的多樣性和可變性使得難以化學(xué)控制該疾?。淮送?，化學(xué)滅菌引起了環(huán)境污染和生態(tài)平衡的廣泛關(guān)注。因此，植物病害的生物防治受到越來越多的關(guān)注。同時(shí)，研究新型抗菌物質(zhì)在預(yù)防和治療人類和動物疾病中的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 菌株

試驗(yàn)所用菌種蠟狀芽孢桿菌，病原真菌棉花枯萎病菌、南瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、芥菜炭疽病菌、玉米小斑病菌、柑橘炭疽病菌及黑曲霉菌由西南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)研究中心提供。

1.2 主要試劑

DEAE52纖維素，Whatman產(chǎn)品；SephadexG100Pharmacia產(chǎn)品；硅膠GF254，青島海洋化工廠產(chǎn)品；胰蛋白酶，Difco進(jìn)口包裝；蛋白酶K，BM產(chǎn)品；堿性蛋白酶，無錫酶制劑廠生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

KMB培養(yǎng)基：每升20克三角蛋白，10克甘油，41.5克K2HPO，1.5克 MgSO4·7H2O，pH7.0；GPS培養(yǎng)基：每升 0.35g檸檬酸鈉，KH2PO40.7g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.1g，葡萄糖10g，蛋白胨2.5g。

1.4 抑菌物的提取與純化

粗菌提取物：過濾培養(yǎng)液后，調(diào)節(jié)pH至3.5，以5000r/min離心，用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)pH至7.0，真空干燥，加入80%甲醇至完全提取物，以4000r/min提取提取物進(jìn)行離心。加入上清液，快速攪拌2.5體積的乙醚并以4000r/min離心，濃縮所得上清液并干燥，得到粗提物。

SephadexG100色譜和DEAE52纖維素色譜：在LKB自動柱色譜系統(tǒng)上進(jìn)行。用0.05mol/LNaHCO3緩沖液（pH8.0）平衡SephadexG100，填充在柱（16mm×800mm）中，加載100mg，用平衡緩沖液洗脫，流速為18mL/h，并在275℃檢測。納米。收集級分，每管3mL，濾紙用于測量每個(gè)管的抗菌活性。將預(yù)處理的DEAE52纖維素用0.02mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.6）平衡，填充在柱（16mm×100mm）中，加載50mg，用50mL緩沖液沖洗，然后與0一起使用。用10mL/h的梯度洗脫~0.8mol/LNaCl的緩沖溶液，用濾紙盤法測定各管的抗菌活性。

硅膠薄層色譜：使用硅膠GF254制備薄層色譜板（20cm×20cm×0.25mm），將薄層在105℃下活化1小時(shí)，然后用水溶液點(diǎn)樣DEAE52層析后的S-1抗真菌物質(zhì)溶液。篩選后，選擇以下層構(gòu)建體層：乙醇：乙酸：水（100：5：20），正丁醇：乙酸：水（100：5：20），正丁醇：乙醇：乙酸：水（30：70：5：20），甲醇：丙酮：乙酸：水（75：25：5：20），在形成完成后干燥，碘著色，并測量Rf值。同時(shí)，使用黑曲霉孢子進(jìn)行生物發(fā)育。

1.5 抗真菌物質(zhì)特性研究

抗真菌物質(zhì)的溶解性：酸沉淀后的0.1g干燥粗粉分別用2mL水，甲醇，乙醇，丙酮，苯，乙醚和氯仿萃取，并將20μL萃取物施加到濾紙上并干燥。然后，將其涂布在含有黑曲霉孢子溶液的PDA雙層平板上，在28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，測定抑制區(qū)的直徑，重復(fù)4次。

抗真菌物質(zhì)的離子性質(zhì)：紙漿電泳0.1mol/L醋酸緩沖液（pH4.0）和0.05mol/L巴比妥酸鹽緩沖液（pH8.6）（新華1號濾紙，1.5cm×25cm），電壓300V，時(shí)間2h，電泳后生物發(fā)育，以黑曲霉為指示菌，測定抗真菌物質(zhì)的遷移距離，重復(fù)4次。

抗真菌物質(zhì)的特性：將硅膠色譜法后具有抗菌活性的部分刮下，用甲醇濃縮，然后進(jìn)行TLC，薄板為20cm×220cm×0.25mm，活化1小時(shí)，分層劑丁醇：乙酸：水（65：10：25），在室溫下分層。在干燥該層后，噴灑黑曲霉孢子用于生物發(fā)育，并分別使用茚三酮，縮二脲試劑，二苯胺，聯(lián)苯胺，鐵氰化鉀-氯化鐵，酪氨酸顯色劑。制作噴霧顏色。

抗真菌物質(zhì)的穩(wěn)定性：將0.2g粗粉溶于20mL無菌水中，過濾并用微孔膜（0.22μm）滅菌，并按如下方法處理：（1）高壓滅菌（1.5kg/Cm2，30min）處理；（2）30W紫外燈，24h照射 30h。將10μL上述每種處理液和未處理的對照溶液點(diǎn)在濾紙上，干燥，并連接到具有黑曲霉孢子懸浮液的PDA（20mL/皿）雙層板上。重復(fù)四次以測量抑制區(qū)的大小。

通過抗真菌物質(zhì)抑制真菌孢子萌發(fā)：孢子萌發(fā)試驗(yàn)是指Broekaert等人的實(shí)驗(yàn)方法，將測試孢子懸浮在含有不同濃度的純化抗真菌物質(zhì)的GPS培養(yǎng)基中，孢子濃度約為3-4×103/m。試管的直徑為16mm，每管300μL，并在25℃下保濕和培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)，并且不使用抗真菌物質(zhì)的處理用作對照。

表1 APS對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 APS對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明，在沒有APS培養(yǎng)基（最終孢子密度為3×106/ml）的情況下，黑曲霉孢子的萌發(fā)可分為三個(gè)階段：培養(yǎng)6小時(shí)，孢子開始擴(kuò)展成圓形孢子；并培養(yǎng)7-8小時(shí)。孢子球開始發(fā)芽，胚芽管形成并生長；培養(yǎng)9-10小時(shí)后，菌絲在胚芽管頂端生長，菌絲體不斷生長。在含有不同濃度APS的YPG培養(yǎng)基中，當(dāng)APS濃度≤2.5μg·ml-1時(shí)，大多數(shù)孢子進(jìn)入萌發(fā)期I.隨著處理濃度的增加，孢子形成的概率逐漸增加；當(dāng)APS濃度≥7.5μg·ml-1時(shí)，擴(kuò)大的孢子球以編織形狀變形，變成不規(guī)則的孢子球（表1）。胚芽管的萌發(fā)與孢子球的膨脹正相關(guān)。隨著抗菌物質(zhì)濃度的增加，發(fā)芽率急劇下降，胚芽管的長度變短?？梢钥闯?，APS對黑曲霉孢子萌發(fā)的三個(gè)階段具有強(qiáng)烈的抑制作用。用不含YPS的YPG液體培養(yǎng)基洗滌孢。

結(jié)果表明，當(dāng)處理濃度為 5.0，10.0，15.0μg·ml-1時(shí)，抑制性孢子恢復(fù)正常的比例逐漸降低，分別為94.8%，82.1%和45.0%，表明孢子活性。經(jīng)過APS處理孢子有一定程度的減少。

2.2 抗真菌物質(zhì)的特性

溶解特性：抗真菌物質(zhì)在甲醇，乙醇和水中的溶解度最高，其次是丙酮，脂溶性溶劑醚，苯和氯仿的抗菌活性，表明抗菌物質(zhì)是水溶性和酒精-易溶。溶劑極性強(qiáng)，溶解度也大。

吸收光譜：掃描結(jié)果表明，抗真菌物質(zhì)的純化產(chǎn)物在275nm處具有吸收峰，這與典型的蛋白質(zhì)吸收峰相同。

離子特性：紙電泳結(jié)果表明，pH4.0緩沖液中S-1抗真菌物質(zhì)的遷移距離為0.0cm，而pH8.6的緩沖液中遷移距離為4.6cm。拮抗物質(zhì)呈弱酸性。

對水解蛋白酶的敏感性：抗真菌物質(zhì)對不同的蛋白酶具有不同的敏感性。用胰蛋白酶，蛋白酶K和堿性蛋白酶處理后，它們的活性分別為未處理對照的82%，75%和71%。該結(jié)果表明該物質(zhì)對上述蛋白酶具有一定的耐受性并具有環(huán)肽的特征。

APS-1的氨基酸組成：APS-1的氨基酸組成分析表明它由10個(gè)氨基酸組成，包括未知的異常氨基酸。在鑒定的9種氨基酸中，酸性氨基酸（Glu和Asp）的相對含量為47.49%，極性氨基酸（Glu，Asp，Tyr，Ser，Thr）為76.28%，缺乏堿性氨基酸。氨基酸組合物與APS-1呈弱酸性，并且與極性溶劑相容。

3 結(jié)語

芽孢桿菌可以產(chǎn)生肽抗生素。這些抗生素的肽鏈大多是封閉的，幾乎沒有游離氨基和羧基，這可以耐受蛋白酶的作用。由蠟狀芽孢桿菌S-1菌株產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)APS-1在275nm處具有吸收峰，縮二脲反應(yīng)為陽性，并且茚三酮反應(yīng)為陰性，但在酸水解后，茚三酮反應(yīng)為陽性[1]。水解蛋白酶具有一定的耐受性，這些特征與報(bào)道的芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)肽抗生素一致。APS-1水解產(chǎn)物的氨基酸組成分析證實(shí)它由9種常見氨基酸和一種異常氨基酸組成，并且推斷出APS-1是環(huán)狀多肽。

在芽孢桿菌產(chǎn)生的抗微生物肽中，大多數(shù)對細(xì)菌具有抗性，只有少數(shù)是抗真菌的。在報(bào)道的芽孢桿菌抗真菌多肽抗生素中，大多數(shù)抗菌活性不強(qiáng)，抗菌譜較窄，同時(shí)不能抑制絲狀真菌和酵母菌等。從蠟狀芽孢桿菌中純化出抗真菌環(huán)肽Mycocerin，具有廣譜抑制作用和強(qiáng)活性，同時(shí)可作用于絲狀真菌和酵母，具有良好的耐熱性和穩(wěn)定性。從蠟狀芽孢桿菌S-1菌株分離和純化的抗真菌多肽APS-1也具有上述特征，但氨基酸組成明顯不同。