蔡振輝， 陳金梅， 陳東海， 胡圣學(xué)， 蔡鮮群， 陳勝男， 石賢愛, 2

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所， 福建 福州 350116)

0 引言

海蛾又稱海麻雀、 海燕， 其在分類學(xué)上屬輻鰭魚綱海蛾魚目海蛾魚屬， 主要分布在西太平洋及印度洋的熱帶及亞熱帶水域， 在我國主要分布在東海南部、 臺灣海峽及南海[1]. 在古代， 我國沿海地區(qū)人民就有將海蛾作為藥用的傳統(tǒng)， 現(xiàn)代《中國海洋藥用生物》、 《中國有毒魚類和藥用魚類》、 《中國動物藥》等書均相繼收載. 海蛾性味輕辛、 苦、 平， 其全身具化痰止咳、 宣肺透疹、 壯陽補骨、 消癭散結(jié)、 燥濕止瀉等功效. 我國民間所捕獲海蛾， 在去除內(nèi)臟等器官后， 用清水洗凈， 曬干， 可作為藥用治療甲狀腺腫癌淋巴結(jié)核、 小兒氣管炎、 麻疹、 腹瀉等疾病[2].

海蛾中含有天然?；撬?、 神經(jīng)酰胺、 甾醇等多種物質(zhì)， 其中牛磺酸對大鼠發(fā)生肝癌時的脂質(zhì)過氧化和膜裂解反應(yīng)的肝起保護作用， 并能對大鼠慢性酒精中毒的肝脂肪變性和脂質(zhì)過氧化提供保護、 對腸炎具有較好的療效以及能對在常壓低氧急性條件下的肝、 大腦、 心臟提供保護[3]. 唐孝禮等[4]使用氫化可的松或環(huán)磷酰胺降低老年小鼠的免疫力， 隨后使用海蛾提取物處理小鼠， 發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟和胸腺重量顯著增加， 提高了老年小鼠的免疫力水平. 海蛾提取物對小鼠免疫水平的調(diào)解， 對免疫水平正常的小鼠沒有明顯作用， 但當小鼠因衰老、 藥物抑制等原因造成免疫力下降時， 海蛾提取物可以改善機體免疫水平， 抵御病原體的侵害. 另有研究表明， 利用75%(體積分數(shù))乙醇提取海蛾獲得的提取物抗氧化作用最為明顯， 利用乙酸乙酯和正丁醇進一步萃取獲得的產(chǎn)物具有最佳活性[5-6].

由于目前缺乏海蛾活性組分的分離純化及定性定量研究數(shù)據(jù)， 致使對海蛾的深入研究和利用處于停滯狀態(tài). 相比傳統(tǒng)的硅膠柱萃取等方法， 由分析型液相色譜發(fā)展而來的制備型液相色譜能夠高效地分離純化混合有機組分， 具有更加簡便、 高效的特點[7]. 因此， 本研究使用制備型液相色譜， 在對海蛾活性成分進行分離純化的基礎(chǔ)上， 采用3D-HPLC技術(shù)同步分析多種物質(zhì)組分[8-11]， 同時結(jié)合MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)法和流式細胞術(shù)的技術(shù)優(yōu)勢[12-15]， 進行各組分的抗腫瘤活性分析， 希望為海蛾活性成分的進一步利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與儀器

1.1 材料

海蛾乙醇-水-乙酸乙酯浸提物(海蛾全魚干品購自廣州黃沙藥材批發(fā)市場)； DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司； 胎牛血清購自美國Hyclone 公司； 胰蛋白酶購自美國Amresco 公司； 二甲基亞砜( DMSO) 、 噻唑藍( MTT) 購自美國Sigma 公司; 6孔、 96 孔細胞培養(yǎng)板購自美國Costar 公司； 其他化學(xué)試劑均為色譜純， 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

人乳腺癌細胞(MCF-7)、 人肺癌細胞(A549)、 人肝癌細胞(HepG-2)、 子宮頸癌細胞(HeLa)、 人腎上皮細胞(293T)均購自中科院上海細胞所. 培養(yǎng)基均為含10%(體積分數(shù))無支原體胎牛血清和1%(體積分數(shù))雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基.

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(NUAIR 550， 美國Nuaire公司)； 熒光全自動酶標儀(SH-1000， 日本Corona公司)； 超純水器(GZY-P10-Y， 湖南科爾頓公司)； 超聲波清洗器(2200， 昆山超聲儀器公司)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(XMTF-6000， 上海申生公司)； 真空干燥箱(DZF-6020， 上海精宏公司)； 高效液相色譜(分析型： BREEZE系列， 1525二元泵， 2996檢測器， 美國Waters公司)； 高相液相色譜(半制備型： BREEZE系列， 1525EF二元泵， 2998檢測器， 美國Waters公司)； 液相色譜超高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Exactive Plus， 美國賽默飛世爾公司)； 超導(dǎo)核磁共振波譜儀(AVANCE III 400 MHz， 瑞士布魯克公司)； 傅里葉變換紅外光譜系統(tǒng)(Nicolet iS50， 美國賽默飛世爾公司).

2 方法

1) 色譜條件. 色譜柱： 分析柱(SinoChrom ODS-BP， 4.6 mm×250 mm， 大連依利特公司)； 半制備柱(SinoChrom ODS-BP， 20.0 mm×250 mm， 大連依利特公司). 流動相： 甲醇(A), 超純水(B)； 梯度洗脫(0～30 min， 60%～100%(體積分數(shù))A； 30～60 min， 100%A). 分析條件： 流速1.0 mL·min-1， 檢測波長202 nm， 柱溫25 ℃； 進樣量15 μL， 采樣時間60 min. 制備條件： 流速10.0 mL·min-1， 檢測波202 nm， 柱溫25 ℃； 進樣量3～4 mL， 采樣時間60 min.

2) 樣品處理. 稱取0.1 g海蛾乙酸乙酯提取物， 溶解于2 mL純甲醇溶液， 用有機濾膜過濾除去雜質(zhì)后進行分析.

3) 保留時間重現(xiàn)性驗證. 取海蛾乙酸乙酯樣品， 平均分成5份， 進行5次平行試驗， 分別記錄下A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6等組分出峰時的保留時間， 計算平均值及相對標準偏差，

4) 制備方法. 稱取2 g海蛾乙酸乙酯提取物， 溶解于50 mL純甲醇溶液， 置于超聲波清洗器中使樣品充分溶解. 隨后將樣品通過有機濾膜過濾除去雜質(zhì)， 設(shè)置半制備液相色譜各項參數(shù)后， 進樣3 mL， 按洗脫出峰時間順序依次收集組分， 分別命名為A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6.

5) 基于HPLC的單組分鑒定. 依據(jù)色譜條件， 設(shè)置分析型HPLC參數(shù)， 進樣針吸取20 μL A1樣品進樣， A2、 A3、 A4、 A5、 A6等樣品依次進樣， 記錄HPLC色譜圖以及3D-HPLC色譜圖進行純度驗證.

6) MTT法檢測各組分對腫瘤細胞增殖影響. 在37 ℃， 5%(體積分數(shù))CO2環(huán)境下， 將人乳腺癌細胞MCF-7、 人肺癌細胞A549、 人肝癌細胞HepG-2、 子宮頸癌細胞HeLa和正常細胞系人腎上皮細胞293T 培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期， 隨后消化計數(shù)， 分別接種至96孔板( 細胞數(shù)2 × 104個·mL-1). 每種細胞分別設(shè)置6組濃度梯度， 并設(shè)5 個復(fù)孔， 繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h. 待細胞貼壁后， 第1梯度加入10 μL PBS 作為空白對照， 第2～6 梯度分別加入質(zhì)量濃度為4.0、 2.0、 1.0、 0.5、 0.25 mg·mL-1的樣品組分10 μL， 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后， 每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL， 孵育48 h后棄上清， 并添加100 μL DMSO， 輕輕搖動， 設(shè)置酶標儀參數(shù)， 于510 nm測定吸光度值(A). 計算細胞抑制率.

7) 流式細胞儀分析結(jié)果. 懸浮細胞離心(2 000 r·min-1離心5 min)收集， 貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化30～60 s； 用PBS洗滌細胞兩次， 離心(2 000 r·min-1離心5 min)， 收集1～5×105個細胞； 加入500 mL Binding Buffer懸浮細胞、 5 μL Annexin-V-FITC以及5 μL propidium Iodide， 輕輕混勻； 室溫、 避光反應(yīng)5～15 min， 在1 h內(nèi)進行流式細胞儀的檢測和觀察. 同時以不加Annexin V-FITC 及PI的一管作為陰性對照. 設(shè)置流式細胞儀參數(shù)為激發(fā)波長λEx=488 nm， 發(fā)射波長λEm=530 nm； Annexin V-EGFP的綠色熒光以FITC通道(FL1)檢測； PI紅色熒光以PI通道(FL3)檢測.

8) 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析. 制備各分離單組分， 進行核磁共振檢測， 溶劑為氘代氯仿； 質(zhì)譜測定， 電離模式ESI； 液相紅外光譜測定， 溶劑為甲醇.

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品分離結(jié)果

圖1 乙酸乙酯提取物各組分保留時間Fig.1 Retention time of components from ethyl acetate extract

對海蛾乙酸乙酯提取物進行分析發(fā)現(xiàn)， 樣品中主要有6個組分， 按順序分別編號為A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6(見圖1). 使用半制備型HPLC進行各組分的收集， 結(jié)合3D-HPLC對獲得的組分進行全波長掃描， 判定6種組分為單組分(見圖2).

圖2 A1～A6組分的3D-HPLC分析圖Fig.2 3D-HPLC chromatograms of the sub-component A1 to A6

3.2 組分的抗腫瘤活性

根據(jù)MTT實驗結(jié)果， A1組分對人乳腺癌細胞MCF-7具有輕微抑制作用， 促進子宮頸癌細胞HeLa的生長， 而對人肺癌細胞A549、 人肝癌細胞HepG-2、 人腎上皮細胞293T并無明顯抑制作用(多種藥物質(zhì)量濃度對細胞抑制率均小于50%)； A2、 A3組分對人乳腺癌細胞MCF-7、 人肝癌細胞HepG-2、 人腎上皮細胞293T等均具有較強的抑制作用， 并對人腎上皮細胞293T的抑制較為明顯(IC50值分別為(203±3.45)、 (168±3.67)μg·mL-1)； A4組分對各種細胞均有很強的抑制作用， 但對人肺癌細胞A549、 人乳腺癌細胞MCF-7、 人腎上皮細胞293T的IC50均不同程度小于人肝癌細胞HepG-2(IC50值(288±4.58)μg·mL-1)、 子宮頸癌細胞HeLa(IC50值(311±8.96) μg·mL-1)， 見圖3. 以此判斷以上4種組分對多種癌細胞抑制作用較弱， 或抑制正常細胞的生長， 故不作為后續(xù)研究對象.

相較而言， A5、 A6既能抑制腫瘤細胞的生長， 又對人腎上皮細胞293T僅有較低的抑制率. 其中， 組分A5能抑制多種腫瘤細胞生長： 對子宮頸癌細胞HeLa 的生長抑制作用相對較強， IC50值為(302.4±2.33) μg·mL-1； 對人乳腺癌細胞MCF-7、 人肺癌細胞A549也顯示出了較強的抑制作用； 但對人腎上皮細胞293T抑制較弱(IC50值大于400 μg·mL-1). 組分A6對人腎上皮細胞293T抑制較弱， 但對多種腫瘤細胞具有抑制作用， 且該抑制作用具有劑量依賴性. 其中組分A6對子宮頸癌細胞HeLa 的生長抑制作用最強， IC50值為(50.98±3.43) μg·mL-1， 400 μg·mL-1濃度下抑制率達到88.8%， 與此同時， 藥物人對腎上皮細胞293T的抑制率始終未超過50%. 比較A5、 A6與5-氟尿嘧啶對人宮頸癌細胞HeLa 的抑制作用， 在相同實驗條件下二者較5-氟尿嘧啶(IC50值(415.4±0.82) μg·mL-1)均具有不同程度降低， 因而抑制作用更強， 表明A5、 A6具有潛在的研究價值， 故選用A5、 A6進行下一步研究.

圖3 A1～A6處理48 h對5種細胞的生長抑制曲線Fig.3 Growth inhibition curves of 5 kinds of cells after treatment with components A1～A6 for 48 h

3.3 組分誘導(dǎo)細胞凋亡的研究

根據(jù)MTT實驗結(jié)果， 可知A6的抑制腫瘤活性明顯高于A5， 結(jié)合抑制曲線， 設(shè)定A5藥物質(zhì)量濃度梯度為100、 200、 300、 400 μg·mL-1， A6藥物質(zhì)量濃度梯度為50、 100、 150、 200 μg·mL-1. 通過流式細胞儀對A5、 A6組分誘導(dǎo)細胞凋亡進行研究(見圖4). 結(jié)果顯示， 隨著藥物質(zhì)量濃度的增加， HeLa 細胞的凋亡程度均有不同程度增加. 其中， A5在質(zhì)量濃度為400 μg·mL-1時進入凋亡早期的細胞為76.4%， 進入凋亡晚期或死亡的細胞為24.7%； A6在質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1時進入凋亡早期的細胞為86.4%， 進入凋亡晚期或死亡的細胞為13.3%. 相比A5組分， A6組分更易促進細胞向凋亡晚期轉(zhuǎn)變或死亡， 證實組分A5、 A6對HeLa細胞的增殖抑制作用通過誘導(dǎo)HeLa凋亡途徑實現(xiàn).

圖4 Annexin V/PI 雙染法檢測組分A5、A6對HeLa 細胞的誘導(dǎo)凋亡作用Fig.4 Determination of induced-apoptotic effect of components A5 and A6 on HeLa cells through AnnexinV/PI dual stainting assay

3.4 組分A5、 A6化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

對A5、 A6進行質(zhì)譜分析， 利用MS測定結(jié)果， 推測組分A5的相對分子質(zhì)量為284， 核磁共振測試結(jié)果：1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.56, 7.54, 7.38, 7.29, 7.16, 7.15, 7.14, 7.13, 5.49, 5.47, 5.43, 5.41, 5.39, 5.38, 5.36, 5.32, 5.29, 2.38, 2.36, 2.04, 2.02, 1.65, 1.63, 1.35, 1.32, 1.30, 1.28, 0.94, 0.91, 0.90, 0.88；1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.55 (d,J=8.6 Hz, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 7.15 (dd,J=8.6, 2.3 Hz, 1 H), 5.52～5.26 (m, 3 H), 2.37(d,J=7.5 Hz, 7 H), 2.03(d,J=5.7 Hz, 5 H), 1.64(d,J=6.6 Hz, 7 H), 1.60～1.58(m, 1 H), 1.31(dd,J=18.3, 12.4 Hz, 83 H), 0.91(dd,J=15.5, 9.2 Hz, 24 H). A6組分的相對分子質(zhì)量為773， 核磁共振測試結(jié)果：1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.29, 5.73, 5.35, 4.19, 4.16, 4.14, 4.12, 4.10, 4.09, 4.08, 3.55, 3.53, 3.52, 3.51, 3.50, 2.38, 2.36, 2.35, 2.32, 2.29, 2.27, 2.24, 2.03, 2.02, 2.00, 1.95, 1.85, 1.83, 1.56, 1.54, 1.52, 1.51, 1.50, 1.34, 1.30, 1.26, 1.19, 1.12, 1.11, 1.05, 1.01, 0.93, 0.91, 0.88, 0.86, 0.72, 0.68；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ5.73(s, 4 H), 5.35(s, 19 H), 4.22～4.05(m, 11 H), 3.57～3.31(m, 18 H), 2.24(s, 1 H), 2.07(dd,J=48.7, 45.9 Hz, 41 H), 1.81(dd,J=73.8, 63.6 Hz, 69 H), 1.60～1.47(m, 61 H), 1.36～1.20(m, 199 H), 1.19(s, 26 H), 1.12(d,J=6.7 Hz, 35 H), 0.88(ddd,J=77.8, 60.4, 14.7 Hz, 325 H), 0.70(d,J=12.5 Hz, 54 H), 0.70(d,J=12.5 Hz, 47 H).

由于樣品相對分子質(zhì)量較大， 需較多樣品量進行核磁共振測試， 加之前期原料來源較少， 在經(jīng)過分離純化步驟后大多已消耗完畢， 樣品濃縮過程中也似乎降低樣品純度， 致使核磁共振圖譜分析難度加大， 因而難以準確分析出化合物化學(xué)結(jié)構(gòu). 對于A5， 結(jié)合紅外圖譜在1 050 cm-1處存在很大透過率， 推測A5為相對分子質(zhì)量約284的芳香族類有機小分子化合物； 組分A6， 其核磁共振圖譜中位于高場的氫較多， 聯(lián)系紅外譜圖， 推測該化合物為相對分子質(zhì)量為773的甾體類或萜類有機化合物.

4 結(jié)語

通過對海蛾乙酸乙酯提取物的分離純化及其抗腫瘤活性實驗， 表明海蛾作為傳統(tǒng)治療藥物確有功效， 本實驗可為海蛾作為抗腫瘤藥物的研究提供參考.

參考文獻：

[1] 項輝, 黃海. 海蛾的藥用價值及有效成分[J]. 中藥材， 2004， 27(5): 318-320.

[2] 李瑞聲, 許實波. 海洋藥物海蛾(PegasuslaternariusCuvier)化學(xué)成份的研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1993(3): 46-52.

[3] 劉文惠, 項輝, 張穗屏, 等. 海蛾甲醇提取物對小鼠腦脂質(zhì)過氧化及抗氧化酶的影響[J]. 中藥材, 2001， 24(9): 668-670.

[4] 唐孝禮, 顏光美, 許實波. 海蛾提取物對小鼠免疫器官重量和抗應(yīng)激能力的影響[J]. 中藥材, 1999， 22(6): 300-303.

[5] 李坤龍, 陶華明, 周雪峰. 海蛾提取物的抗氧化活性及其化學(xué)成分[J]. 海洋漁業(yè), 2015, 37(6): 565-569.

[6] DELGADO-ANDRADE C, RUFIAN-HENARES J A, MORALES F J. Assessing the antioxidant activity of melanoidins from coffee brews by different antioxidant methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(20): 7832-7836.

（三）茶旅融合不緊。長期以來，永川茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展偏重于茶葉基地建設(shè)和一般的生產(chǎn)、加工、營銷，對特色茶旅游產(chǎn)品開發(fā)和茶文化的挖掘、培育、宣傳亟待加強。游客對永川旅游的認知仍停留在“走馬觀花”的表淺旅游，參與互動式旅游和深度文化體驗等旅游形式和項目開發(fā)不足。兩年一屆的茶旅節(jié)，基本成為以招商為主的商貿(mào)洽談會。茶旅融合度低，直接導(dǎo)致茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展一直徘徊在最基礎(chǔ)的第一產(chǎn)業(yè)層次，附加值遠遠未得到提升。

[7] 徐皓. HPLC法測定不同產(chǎn)地元胡藥材中5種生物堿含量[J]. 藥物分析雜志, 2015, 132(8): 1403-1407.

[8] BHANDARI P, KUMAR N, SINGH B,etal. Simultaneous determination of sugars and picrosides inPicrorhizaspecies using ultrasonic extraction and high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1194(2): 257-261.

[9] HUO L, JIANG Z, LI H,etal. Simultaneous determination of seven major diterpenoids inSiegesbeckiapubescensMakino by high-performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection[J]. Journal of Separation Science, 2012, 35(19): 2585-2591.

[10] LEE J, YANG D H, SUH J H,etal. Species discrimination ofRadixBupleurithrough the simultaneous determination of ten saikosaponins by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection and electrospray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2011, 879(32): 3887-3895.

[11] WANG S, YANG F Q, FENG K,etal. Simultaneous determination of nucleosides, myriocin, and carbohydrates inCordycepsby HPLC coupled with diode array detection and evaporative light scattering detection[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32(23/24): 4069-4076.

[12] BURTON J D. The MTT assay to evaluate chemosensitivity[J]. Methods Mol Med, 2005, 110: 69-78.

[13] 陳新峰, 楊菁. 用MTT法進行白血病體外藥物敏感性檢測的臨床意義[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2009, 43(2): 169-171.

[14] 張銀霞. 腫瘤藥敏試驗方法及臨床應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2003, 9(1): 34-35.

[15] 傅揚, 黃平, 胡勁松. 活體流式細胞術(shù)在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中的應(yīng)用[J]. 健康導(dǎo)報(醫(yī)學(xué)版), 2015(8): 43.