李夢(mèng)琪， 傅 紅, 2， 張翠平， 歐陽全興， 王 琳， 葉秀云, 2

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350116)

0 引言

離子液體是指在室溫環(huán)境下呈現(xiàn)液態(tài)的、 完全由陰陽離子組成的低溫熔融鹽， 一般由有機(jī)陽離子和無機(jī)陰離子構(gòu)成. 與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比， 離子液體具有熱穩(wěn)定性高、 蒸汽壓低和對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)， 被稱為“綠色”溶劑. 近年來離子液體作為各類酶反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)備受關(guān)注[1-3]. 自Rantwijk等[4-5]在一些酶催化的酯化反應(yīng)中運(yùn)用離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑以來， 許多研究表明離子液體作為脂肪酶催化反應(yīng)的媒介， 可能影響酶分子周圍的微水相環(huán)境， 并改變酶與底物的接觸面積以及與底物間的相互影響， 從而提高脂肪酶的穩(wěn)定性和增強(qiáng)酶活力.

天然形式的深海魚油是甘油三酯型， 其EPA(eicosapentaenoic acid)和DHA(docosahexaenoic acid)的總含量一般在18%～30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下均同)左右. 通過甲乙酯化反應(yīng)及分子蒸餾技術(shù)可將產(chǎn)物甲乙酯型魚油的EPA和DHA總含量提高至70%左右. 但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明， 從人體吸收率和對(duì)甲乙醇敏感的人群而言， 甘油三酯魚油在食用安全性上比甲乙酯型魚油更具優(yōu)勢(shì)[6]， 因此提高甘油三酯型魚油中ω-3多不飽和脂肪酸含量的技術(shù)已成為研究熱點(diǎn). 目前大量學(xué)者采用在無溶劑體系或有機(jī)溶劑體系下的脂肪酶催化酯交換反應(yīng)來提高甘油三酯中EPA和DHA的質(zhì)量百分含量， 總含量大多在50%左右[7-9]. 李金章等[10]從多種脂肪酶中篩選了TLIM作為催化劑， 催化魚油甘油酯與乙酯發(fā)生酯交換反應(yīng)， 得到了EPA和DHA總含量為45.6%的甘油酯魚油. 宋詩軍等[11]在無溶劑體系下利用Novozyme435催化濃縮魚油乙酯與ω-3脂肪酸含量為43%的混合甘油酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)， 產(chǎn)物甘油酯中的EPA和DHA含量分別可達(dá)40.4%和28.6%. 但是到目前為止， 還沒有對(duì)離子液體應(yīng)用在脂肪酶催化的魚油酯交換反應(yīng)中的效果有明確的研究報(bào)道. 因此， 本研究以3種易于合成且性質(zhì)穩(wěn)定的二烷咪唑類離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM][BF4])、 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(BMIM][PF6])和1-丁基-3甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽([BMIM][Tf2N])分別作為魚油酯交換反應(yīng)的介質(zhì)[12]， 研究3種離子液體對(duì)脂肪酶催化活力和脂肪酶催化魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物ω-3脂肪酸的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與原料

甘油三酯型魚油(EPA： 19.21%； DHA： 10.81%)、 乙酯型魚油(EPA： 42.47%； DHA： 31.91%)由福建高龍海洋生物工程有限公司惠贈(zèng)； Novozyme435酶、 TLIM酶， 購(gòu)自丹麥諾維信公司； 豬胰脂酶購(gòu)自上海三杰生物技術(shù)有限公司； 離子液體[BMIM][BF4]、 [BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]， 購(gòu)自上海成捷化學(xué)有限公司， 其主要物理性質(zhì)如表1所示； 其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

表1 3種離子液體的主要物理性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚油理化性質(zhì)測(cè)定

水分及揮發(fā)物的測(cè)定參考《動(dòng)植物油脂水分及揮發(fā)物含量測(cè)定(GB/T 5528—2008)》[13]； 酸值的測(cè)定參考《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定(GB/T 5530—2005)》[14]； 皂化值的測(cè)定參考《動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定(GB/T 5534—2008)》[15]； 碘值的測(cè)定參考《動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定(GB/T 5532—2008)》[16]； 過氧化值的測(cè)定參考《動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定(GB/T 5538—2005)》[17].

1.2.2 離子液體中酶活的測(cè)定方法

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《脂肪酶制劑(GB/T 23535—2009)》[18]， 用恒電位自動(dòng)滴定法測(cè)定脂肪酶在離子液體中催化橄欖油的水解活性. 將40 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL橄欖油的混合溶液(空白對(duì)照樣品)， 或40 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL橄欖油的混合溶液及定量的離子液體加入到100 mL燒杯中(TLIM酶不加磷酸緩沖液)， 放入30 ℃恒溫水浴中預(yù)熱30 min. 預(yù)熱完成后， 用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0后， 加入準(zhǔn)備好的酶液2 mL， 用0.1 mol·L-1NaOH開始滴定， pH值恒定不變， 記錄15 min內(nèi)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(V，mL)， 以同樣方法滴定空白溶液， 消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積作為空白值(V0，mL). 測(cè)定條件下每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶活性為1個(gè)酶活力單位. 酶活力 (μmol·min-1) 按照式(1)計(jì)算， 相對(duì)酶活力(%)按照式(2)計(jì)算[19].

(1)

(2)

1.2.3 酯交換反應(yīng)及產(chǎn)物分離

將5 g乙酯型魚油與5 g甘油三酯型魚油攪拌混勻， 混勻的底物裝入已經(jīng)設(shè)置為52 ℃的超級(jí)恒溫水浴鍋中的雙層燒杯中， 加入底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%(0.3 g)的脂肪酶及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、 2%、 4%、 6%、 8%和10%)的離子液體， 密封避光， 待反應(yīng)24 h后終止反應(yīng). 過濾反應(yīng)產(chǎn)物， 除去脂肪酶固體， 離心分層， 上層液體即為混合魚油. 將產(chǎn)物點(diǎn)樣至層析板上進(jìn)行層析[7]， 顯色后刮下甘油三酯部分的層析硅膠， 待甲酯化反應(yīng)使用.

1.2.4 甲酯化及氣相色譜分析

取經(jīng)硅膠層析分離出的魚油樣品(甘油三酯)， 裝在50 mL容量瓶中， 加入10 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鈉-甲醇溶液， 在65 ℃的恒溫水浴中皂化20 min使油珠完全溶解， 然后冷卻； 再加入甲醇-三氟化硼乙醚溶液(三氟化硼-乙醚溶液與無水甲醇以1∶3(體積比)配制而成， 現(xiàn)配現(xiàn)用)， 將混合物在70 ℃恒溫水浴中沸騰20 min； 取出冷卻后， 加入10 mL正己烷， 并充分振蕩[20]， 使脂肪酸甲酯溶于正己烷溶劑中； 再加入飽和NaCl溶液， 至距離容量瓶口大約2 cm處， 此時(shí)， 容量瓶上層液體即為正己烷， 用注射器抽出上層溶液， 放入試管中， 用氮吹儀將溶劑除去， 收集甲酯化樣品供分析之用.

采用GC7890氣相色譜儀， Agilent 112-88A7 HP-88毛細(xì)管色譜柱， 其規(guī)格為100 m×250 μm×0.20 μm. 檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(FID)， 載氣為純氮?dú)猓?其流速為1.0 mL·min-1， 氫氣流速為35.0 mL·min-1， 空氣流速為350 mL·min-1. 進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃， 檢測(cè)器溫度設(shè)為280 ℃. 程序升溫： 柱溫140 ℃保持5 min， 以4 ℃·min-1程序升溫至220 ℃， 持續(xù)保持35 min； 尾吹氣為氮?dú)猓?流速45 mL·min-1； 進(jìn)樣量1 μL， 進(jìn)樣方式： 分流， 分流比20∶1(體積比)[21].

平行試驗(yàn)3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 原料魚油理化性質(zhì)

脂肪酶酶解反應(yīng)的底物甘油三酯型魚油及乙酯型魚油， 其理化性質(zhì)指標(biāo)如表2所示. 研究所選用的作為反應(yīng)底物的原料魚油各項(xiàng)理化性質(zhì)指標(biāo)都符合國(guó)家對(duì)魚油食用標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[22].

表2 反應(yīng)底物甘油三酯及乙酯型魚油的理化性質(zhì)

2.2 離子液體對(duì)脂肪酶活力的影響

特異性脂肪酶TLIM、 豬胰酯酶和非特異性脂肪酶Novozyme435是在魚油酯交換反應(yīng)中最常用且效果較好的3種脂肪酶[7, 23]. 分別在親水性離子液體[BMIM][BF4]、 兩種疏水性離子液體[BMIM][PF6]及[BMIM][Tf2N]中對(duì)上述脂肪酶的催化活性進(jìn)行測(cè)定， 相對(duì)不加離子液體的酶活力結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知， 與不含離子液體的磷酸鹽反應(yīng)體系相比， 3種脂肪酶在不同離子液體介質(zhì)中的酶活力均顯著增加. 其中， 在親水性離子液體[BMIM][BF4]中達(dá)到最大相對(duì)酶活， TLIM、 豬胰脂酶及Novozyme435對(duì)應(yīng)的[BMIM][BF4]最適質(zhì)量濃度均為45 g·L-1左右， 最大相對(duì)酶活力分別為1 030%， 1 090%和687%. 此外， 結(jié)果還表明3種脂肪酶在兩種疏水性離子液體[BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]中的酶活變化趨勢(shì)大致相同， 達(dá)到最大相對(duì)酶活力時(shí)的離子液體質(zhì)量濃度均為30 g·L-1左右. 相關(guān)研究[4, 19]表明這3種離子液體可大幅度提高脂肪酶活力， 可能是由于離子液體對(duì)油水混合體系的乳化效果更好， 離子液體的加入可有效增大底物的溶解度從而增大底物和酶接觸機(jī)會(huì)[24]， 為脂肪酶的催化反應(yīng)提供一個(gè)更加緊湊適宜的微環(huán)境[25].

圖1 3種離子液體對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.1 Effect of the three ionic liquids on lipase activity

由圖1還可知， 脂肪酶在離子液體中的相對(duì)酶活力隨離子液體濃度的增加均呈先增后減的趨勢(shì)， 這可能是由于隨著離子液體添加量的增加， 反應(yīng)底物濃度及反應(yīng)速率降低了， 不利于反應(yīng)的正向進(jìn)行； 同時(shí)， 與有機(jī)溶劑及甘油三酯相比， 離子液體的黏度較大， 導(dǎo)致反應(yīng)體系的黏度隨離子液體添加量的增大而增大， 當(dāng)黏度增大到一定程度， 反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力增大[1, 26]， 阻礙底物與酶分子的相互作用， 不利于反應(yīng)進(jìn)行.

2.3 離子液體對(duì)脂肪酶催化魚油酯交換反應(yīng)的影響

圖1的結(jié)果表明離子液體可大幅提高脂肪酶活力， 因此將3種離子液體應(yīng)用在以甘油三酯型魚油和乙酯型魚油為底物的魚油酯交換反應(yīng)中， 其中甘油三酯型魚油的ω-3脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.02%， 乙酯型魚油的ω-3脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.38%. 考察離子液體添加量對(duì)產(chǎn)物甘油三酯魚油中EPA和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響， 結(jié)果如圖2所示.

圖2 3種離子液體添加量對(duì)魚油酯交換反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of the three ionic liquids additive amount on transesterification of fish oil

由圖2可知， 離子液體使魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯EPA和DHA的平均得率提高了20%以上. 其中， 當(dāng)使用特異性脂肪酶TLIM和豬胰脂酶， 并以疏水性離子液體[BMIM][Tf2N]或[BMIM][PF6]作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)， 產(chǎn)物甘油三酯魚油中ω-3脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高. 當(dāng)[BMIM][Tf2N]添加量為4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下同)時(shí)， TLIM催化魚油酯交換產(chǎn)物甘油三酯的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了63.65%， 較不加離子液體的空白對(duì)照樣提高了11.79 %.

對(duì)于魚油酯交換反應(yīng)而言， 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果有兩個(gè)顯著特征， 一是具有位置特異性的脂肪酶TLIM和豬胰脂酶反應(yīng)效果優(yōu)于非特異性脂肪酶Novozyme435； 二是疏水性離子液體效果優(yōu)于親水性離子液體. 究其原因， 可能和反應(yīng)體系特征密切相關(guān). 研究表明， EPA和DHA等多不飽和脂肪酸大部分連接在甘油三酯的2位[27]， 而Sn-1, 3特異性脂肪酶選擇性水解魚油時(shí)， 可以更多地作用于甘油酯1和3位置上的脂肪酸進(jìn)行酯交換反應(yīng)， 從而最大程度地使甘油酯2位置上的脂肪酸保留下來， 最終提高反應(yīng)產(chǎn)物中ω-3脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù). 另一方面， 雖然由前述離子液體對(duì)脂肪酶活力的影響效果來說， 3種脂肪酶在親水性離子液體[BMIM][BF4]中酶活較高， 但是其對(duì)應(yīng)的酶活測(cè)定體系是含有磷酸緩沖液的含水體系， 酶活指標(biāo)反映的主要是脂肪酸的水解得率， 因此和無水溶劑的酯交換反應(yīng)有所不同. 由于魚油酯交換反應(yīng)在非水溶劑體系下進(jìn)行， 而疏水性離子液體在非水相體系下， 可最大程度地增加底物與酶的接觸機(jī)會(huì)， 使得酶外圍的水分子層的介電常數(shù)比離子液體更高， 導(dǎo)致酶與水分子結(jié)合牢固， 空間形態(tài)結(jié)構(gòu)不易改變， 因此酶的催化活性能夠得以維持， 有利反應(yīng)進(jìn)行. 另外PF6-、 Tf2N-的負(fù)電荷比較分散， 形成氫鍵的能力較弱， 對(duì)酶的分子結(jié)構(gòu)影響較小[4]. 這可能是在非水環(huán)境下魚油酶法酯交換反應(yīng)中疏水性離子液體效果要好于親水性離子液體的主要原因.

2.4 產(chǎn)物脂肪酸成分分析

為了考察離子液體對(duì)魚油酶法酯交換產(chǎn)物脂肪酸的影響效果， 研究以TLIM脂肪酶為例， 分別對(duì)不添加離子液體及[BMIM][Tf2N]為最佳添加量(4%)時(shí)， 酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯的脂肪酸成分及脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行對(duì)比分析， 結(jié)果如表3所示.

表3 離子液體[BMIM][Tf2N]為介質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯脂肪酸組成及含量

注： TG代表甘油三酯； EE代表乙酯

由此可見， 離子液體體系下產(chǎn)物甘油三酯型魚油的EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.31%， DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.34%， 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了63.65%， 遠(yuǎn)高于底物甘油三酯型魚油的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.02%， 同時(shí)也顯著高于非離子液體體系下的脂肪酶TLIM催化反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)51.86 %. 因此， 以離子液體為介質(zhì)可以提高脂肪酶催化魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯中EPA和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù). 酯交換反應(yīng)主要是甘油三酯型底物魚油中的C14∶0、 C16∶0、 C16∶1和C18∶1與乙酯型底物魚油中的EPA和DHA進(jìn)行了交換， 從而提高了產(chǎn)物甘油三酯魚油中EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

3 結(jié)語

離子液體作為一種新型“綠色”溶劑， 已替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑作為各種酶促反應(yīng)的介質(zhì). 研究表明TLIM、 Novozyme435及豬胰脂酶3種脂肪酶在離子液體[BMIM][BF4]、 [BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]中的酶活均有提升. 其中， 當(dāng)[BMIM][BF4]質(zhì)量濃度為45 g·L-1時(shí)， 豬胰脂酶的相對(duì)酶活力達(dá)到1 090%. 將離子液體加入魚油酯交換反應(yīng)中作為反應(yīng)介質(zhì)后， 魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯EPA和DHA的平均得率提高了20%以上， 且疏水性離子液體效果好于親水性離子液體. 當(dāng)[BMIM][Tf2N]添加量為4%時(shí)， TLIM催化魚油酯交換產(chǎn)物甘油三酯的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了63.65%， 較不加離子液體提高了11.79%.

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