李玉芬， 鄭明星， 朱 凡， 林 娟

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350116)

0 引言

膠原蛋白是生物體內(nèi)含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白， 膠原蛋白含有由3條α-肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)， 分子量較大， 難溶于水和稀堿， 部分可溶于稀酸或中性鹽溶液， 具有可成膜性、 低免疫原性等優(yōu)良特性， 在食品、 醫(yī)藥、 生物材料等領(lǐng)域具有重要地位[1-4]. 隨著人工海蜇養(yǎng)殖技術(shù)的重大突破， 海蜇的高值化利用也日益受到人們的關(guān)注[5]. 研究表明[6]， 海蜇皮的干基組分中含有84.33%膠原蛋白. 因此， 海蜇可以作為一種新型的膠原蛋白制備來源， 極具發(fā)展前景. 目前， 膠原蛋白的提取方法可以歸類為3種： 利用高壓輔助提取的物理方法[7]； 在低溫或者熱水條件下利用溶劑輔助提取的方法， 根據(jù)溶劑的類型可分為酸法[8]、 堿法[9]和鹽法[10]； 利用蛋白酶在一定的溫度和pH值條件下進(jìn)行酶解提取的酶法. 一般來說， 高壓、 高溫條件下提取的膠原蛋白都已經(jīng)變性成明膠， 只有在低溫環(huán)境下提取的膠原才有可能保持膠原蛋白本身的三螺旋結(jié)構(gòu). 本研究以海蜇加工下腳料為原料， 建立在中低溫條件下以檸檬酸為提取劑的膠原蛋白提取工藝， 并對(duì)海蜇膠原蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析， 為海蜇高值化利用提供理論基礎(chǔ)， 為膠原蛋白的制備提供新途徑， 為基于海洋來源膠原材料的構(gòu)建及其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蜇加工下腳料由福建億達(dá)食品有限公司提供.

L-羥脯氨酸購(gòu)自上海Aladdin公司； 牛皮I型膠原蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； 胃蛋白酶(1.58 U·mg-1)和胰蛋白酶(4.40 U·mg-1)購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)； 風(fēng)味蛋白酶(7.62 U·mg-1)、 木瓜蛋白酶(13.73 U·mg-1)、 中性蛋白酶(9.02 U·mg-1)和堿性蛋白酶(84.63 U·mg-1)購(gòu)自北京Solarbio公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1) 海蜇基本成分測(cè)定. 水分含量采用恒重法測(cè)定， 參照《糧食、 油料檢測(cè) 水分測(cè)定法(GB/T 5497—1985)》[11]； 灰分采用灰化法測(cè)定， 參照《糧食、 油料檢測(cè) 灰分測(cè)定法(GB/T 5505—1985)》[12]； 脂肪采用索氏抽提法測(cè)定， 參照《糧食、 油料檢驗(yàn) 粗脂肪測(cè)定法(GB/T 5512—1985)》[13]; 蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法， 參照《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定(GB/T 5009.5—2003)》[14]; 總糖采用斐林試劑滴定法測(cè)定[15]. 采用Woessner體系[16]檢測(cè)羥脯氨酸的含量， 間接計(jì)算出海蜇樣品的膠原蛋白百分比， 并通過SDS-PAGE分析膠原蛋白的結(jié)構(gòu)完整性.

2) 原料預(yù)處理. 將海蜇加工下腳料用清水沖洗， 將充分除鹽的海蜇用攪拌機(jī)攪碎至無明顯顆粒， 過濾瀝干； 添加丙酮溶液， 靜置1 d， 蒸餾水清洗至無異味， 過濾瀝干； 置于0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液中浸泡， 定期更換溶液， 蒸餾水清洗至中性， 過濾瀝干， 低溫存放備用.

3) 不同提取方法的比較. 比較熱水浸提法、 高溫酸法、 低溫酸法和酶法對(duì)膠原蛋白提取率的影響. 準(zhǔn)確稱取2.5 g海蜇勻漿于50 mL離心管， 加入5.0 mL提取劑， 于適當(dāng)溫度下提取12 h， 期間每隔2 h攪拌一次； 待反應(yīng)結(jié)束， 于4 ℃下以13 795 r·min-1離心15 min， 收集上清液用于膠原蛋白含量的測(cè)定及SDS-PAGE分析.

4) 不同蛋白酶種類的比較. 以膠原蛋白提取率為指標(biāo)， 在4 ℃、 蛋白酶添加量1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下同)、 料液比1∶2.0(w∶V， 以下均同)和提取時(shí)間24 h條件下， 比較6種不同蛋白酶在其最適pH值條件下對(duì)海蜇膠原蛋白的提取效果.

5) 不同酸種類的比較. 在4 ℃、 胃蛋白酶添加量1.0%、 酸濃度0.05 mol·L-1、 料液比1∶2.0和提取時(shí)間24 h條件下， 比較冰乙酸、 鹽酸、 檸檬酸和乳酸溶液對(duì)膠原蛋白提取效果的影響.

6) 不同提取溫度的比較. 選取上述最優(yōu)酸種類， 在胃蛋白酶添加量1.0%、 酸濃度0.05 mol·L-1、 料液比1∶2.0和提取時(shí)間12 h條件下， 比較不同溫度(4、 10、 15、 20、 25和30 ℃)對(duì)膠原蛋白提取效果的影響.

7) 酶法制備膠原蛋白的單因素實(shí)驗(yàn). 通過對(duì)酸濃度(胃蛋白酶添加量1.0%、 料液比1∶2.0和提取時(shí)間6 h條件下)、 提取時(shí)間(胃蛋白酶添加量1.0%、 檸檬酸濃度0.05 mol·L-1和料液比1∶2.0條件下)、 胃蛋白酶添加量(檸檬酸濃度0.05 mol·L-1、 料液比1∶2.0和提取時(shí)間8 h條件下)、 料液比(胃蛋白酶添加量1.0%、 檸檬酸濃度0.05 mol·L-1和提取時(shí)間8 h條件下)等5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)， 研究各因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響.

8) 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì). 以檸檬酸濃度(因素A)、 提取時(shí)間(因素B)、 料液比(因素C)和加酶量(因素D)為考察因素， 選取合適的3個(gè)水平， 以膠原蛋白提取率為目標(biāo)函數(shù)， 選用正交表L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)， 確定海蜇膠原蛋白酶法最優(yōu)提取工藝.

9) 海蜇膠原蛋白的分離純化. 向上述膠原蛋白粗提液中添加NaCl至終濃度為2.0 mol·L-1， 攪拌過夜； 離心取沉淀重溶于0.01 mol·L-1檸檬酸溶液中， 轉(zhuǎn)入40 ku的透析袋， 置于0.02 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液中透析完全； 離心取沉淀重溶于0.01 mol·L-1檸檬酸溶液， 再用蒸餾水透析完全； 離心取沉淀冷凍干燥后即為膠原蛋白海綿狀干品.

10) 海蜇膠原蛋白的理化性質(zhì)分析. 采用SDS-PAGE分析膠原蛋白類型及單鏈分子量； 采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定膠原蛋白的氨基酸組成； 采用傅里葉紅外光譜(掃描波數(shù)4 000～400 cm-1)分析膠原蛋白的吸收帶特征； 將海蜇膠原蛋白在200～400 nm近紫外光區(qū)進(jìn)行掃描， 分析其對(duì)近紫外光的吸收特性； 考察溫度、 pH值和濃度對(duì)膠原蛋白黏度的影響， 將動(dòng)力黏度變化50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度定義為膠原蛋白的熱變性溫度； 考察pH值和NaCl質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白溶解性的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 海蜇基本成分分析

海蜇加工下腳料中水分占68.80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下均同)， 鹽分占24.20%， 干基組分為7.00%. 在海蜇干基中， 蛋白質(zhì)含量最高， 占總組分的91.40%， 其中膠原蛋白占總干基組分的44.91%， 是海蜇的主要蛋白組成； 海蜇干基的總糖含量相對(duì)較高, 占7.48%， 這可能是無脊椎動(dòng)物中膠原蛋白糖化率較高的緣故[17]； 雖然海蜇干基的脂肪含量相對(duì)較少， 僅占1.12%， 但由于脂肪能夠交聯(lián)膠原蛋白纖維， 從而影響膠原蛋白的提取[18]， 需要采取丙酮脫脂處理.

2.2 不同提取方法的比較

由于膠原蛋白纖維交聯(lián)程度的差異， 一般不同方法獲得的膠原蛋白提取率差異很大[19]. 目前常用的提取方法有： 熱水浸提法、 高溫酸法、 低溫酸法和酶法(胃蛋白酶)， 其中高溫酸法和酶法的膠原蛋白提取率較高， 分別為93.52%和49.51%.

圖1 不同方法提取的海蜇膠原蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of collagen prepared from jellyfish by different extraction methods

對(duì)不同提取方法獲得的膠原蛋白粗提液進(jìn)行SDS-PAGE分析， 結(jié)果見圖1. 泳道b的蛋白條帶在濃縮膠和分離膠之間， 這是因?yàn)樗崛苄阅z原蛋白擁有完整的結(jié)構(gòu)[20]， 不易與SDS結(jié)合， 而且其相對(duì)分子質(zhì)量在300 ku以上， 難以穿過凝膠孔隙； 泳道c的條帶主要集中在130 ku左右， 這是由于酶促溶性膠原蛋白雖然保留了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)， 但其端肽已被切除[21]， 在高溫及SDS的作用下易發(fā)生解旋， 生成相對(duì)分子質(zhì)量約為130 ku的肽鏈； 泳道d顯示出3條明亮條帶， 這可能是在高溫下膠原蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞， 3條肽鏈發(fā)生不規(guī)則離散， 但其單鏈保留了較為完好的端肽[22]， 故相對(duì)分子質(zhì)量略大于泳道c的主要條帶； 泳道e上未有明顯蛋白條帶， 這是由于在高溫和酸的作用下， 膠原蛋白變性為明膠， 并被酸解為多肽片段[23]. 因此酶法是海蜇膠原蛋白的最佳提取方法.

2.3 不同蛋白酶提取效果的比較

在特定蛋白酶作用下， 被切去未交聯(lián)端肽的膠原蛋白易溶于水或稀酸溶液[24]. 目前較為常用的提取用酶為胃蛋白酶[25]、 中性蛋白酶[26]、 堿性蛋白酶[27]和胰蛋白酶[28]等. 考察不同蛋白酶對(duì)膠原蛋白提取率的影響， 結(jié)果顯示胃蛋白酶促溶性膠原蛋白的含量明顯高于其他蛋白酶， 其提取率可達(dá)84.55%. 因此確定胃蛋白酶作為海蜇膠原蛋白的酶法提取用酶.

2.4 酶法提取海蜇膠原蛋白工藝優(yōu)化

2.4.1 最佳酸種類的選擇

不同酸種類對(duì)膠原蛋白提取效果的促進(jìn)作用差異很大[29]. 在相同濃度下， 以鹽酸為提取劑的膠原蛋白提取率最高， 達(dá)93.84%； 檸檬酸次之(91.11%)， 乳酸為63.75%， 冰醋酸最低, 為4.40%.

圖2 不同酸種類提取的海蜇膠原蛋白的SDS-PAGE分析 Fig.2 SDS-PAGE analysis of collagen prepared from jellyfish by different acids

進(jìn)一步對(duì)鹽酸和檸檬酸提取的粗膠原蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE分析， 結(jié)果如圖2所示. 鹽酸提取的粗膠原蛋白在130 ku以下的蛋白條帶呈均勻分布， 在200 ku以上沒有明顯粗條帶， 說明鹽酸促溶性膠原蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到一定程度的破壞， 相比之下， 同濃度檸檬酸提取得到的膠原蛋白在構(gòu)象上更為穩(wěn)定， 因此確定檸檬酸作為下一步實(shí)驗(yàn)用酸.

2.4.2 最適提取溫度的確定

有研究表明[30]， 不同溫度下提取的膠原蛋白的成纖維能力和熱變性溫度具有一定差異. 綜合比較不同提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響， 如表1所示， 膠原蛋白提取率隨提取溫度的升高而升高， 溫度大于15 ℃時(shí)膠原蛋白提取率相差不大， 均大于90%.

表1 不同提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

圖3 不同溫度提取的海蜇膠原蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of collagen prepared from jellyfish at different temperatures

對(duì)不同溫度下獲得的粗膠原蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE分析， 結(jié)果如圖3所示. 在4～20 ℃下獲得的電泳條帶無明顯差別， 膠原蛋白仍然保留了完整的結(jié)構(gòu)； 在25 ℃及以上溫度下提取的膠原蛋白已經(jīng)變性成明膠， 且被胃蛋白酶進(jìn)一步水解為多肽.

綜上所述， 海蜇膠原蛋白的熱變性溫度在20～25 ℃之間， 在保證膠原蛋白結(jié)構(gòu)完整性的前提下， 為獲得更高的提取率， 最終確定15 ℃作為海蜇膠原蛋白的提取溫度.

2.4.3 單因素試驗(yàn)

前期酶解制備膠原蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為： 檸檬酸濃度為0.05 mol·L-1， 提取時(shí)間為8 h， 料液比為1∶2.0， 加酶量為1.50%.

2.4.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果， 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(34)， 考察各個(gè)因素的協(xié)同作用， 并確定海蜇膠原蛋白的最佳提取工藝條件. 正交試驗(yàn)因素水平見表2， 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表3、 4.

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

從極差分析結(jié)果可知， 4個(gè)因素的最優(yōu)理論水平組合為A3B3C2D3， 即提取時(shí)間8 h、 加酶量1.50%、 檸檬酸濃度0.05 mol·L-1和料液比1∶2.0， 在該條件下， 進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)， 所得膠原蛋白提取率為97.41%.

從極差分析結(jié)果可知， 各因素對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的主次影響為： 提取時(shí)間>加酶量>檸檬酸濃度>料液比. 其中， 料液比對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的影響最小， 因此對(duì)檸檬酸濃度、 提取時(shí)間、 加酶量進(jìn)行方差分析， 結(jié)果見表4. 從結(jié)果可知， 檸檬酸濃度、 提取時(shí)間、 加酶量對(duì)膠原蛋白的提取率影響不顯著.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

注： “-”表示對(duì)膠原蛋白提取率影響不顯著

2.5 海蜇膠原蛋白的理化性質(zhì)研究

圖4 海蜇膠原蛋白與牛皮I型膠原蛋白成分比較(SDS-PAGE)Fig.4 SDS-PAGE analysis of collagen compare the collagen prepared from jellyfish with collagen-I prepared from bovine skin

2.5.1 膠原蛋白類型及其相對(duì)分子質(zhì)量

將純化獲得的海蜇膠原蛋白同牛皮I型膠原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析， 結(jié)果如圖4所示. 從該電泳圖譜可以看出， 提取的海蜇膠原蛋白純度較高， 主要含有α鏈， 還含有少量的二聚體β鏈和三聚體γ鏈， 其單體α鏈相對(duì)分子質(zhì)量與牛皮I型膠原蛋白的α1鏈相近， 約為124 ku； 未見α2鏈， 判斷其膠原蛋白的可能結(jié)構(gòu)為[α1]3.

2.5.2 氨基酸組成及質(zhì)量百分含量

海蜇膠原蛋白的氨基酸組成與牛皮I型膠原蛋白類似(見表5)； Gly的質(zhì)量百分含量最高， 占氨基酸總量的25.16%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下同)； 所含氨基酸種類齊全， 人體必需的多種氨基酸占總氨基酸的21.46%； 未檢測(cè)到Try和Cys的存在； 海蜇膠原蛋白的Hyp和Pro占總量的16.93%， 低于牛皮I型膠原蛋白， 與其他水產(chǎn)來源膠原蛋白的特征類似[18].

表5 海蜇膠原蛋白的氨基酸組成

注：“ND"表示未檢測(cè)到

2.5.3 傅里葉紅外光譜分析

圖5 海蜇膠原蛋白紅外掃描圖譜Fig.5 FTIR spectrogram of collagen from jellyfish

天然膠原蛋白含有獨(dú)特的右手三螺旋構(gòu)型， 在紅外光譜的酰胺A帶、 酰胺I帶和酰胺III帶具有明顯吸收特征[31]. 圖5為海蜇膠原蛋白和牛皮I型膠原蛋白的傅里葉紅外掃描圖譜， 其對(duì)應(yīng)譜峰指認(rèn)見表6. 海蜇膠原蛋白在3 416 cm-1處強(qiáng)且寬的吸收峰是酰胺A帶的N—H伸縮振動(dòng)， 與牛皮I型膠原蛋白類似， 具有明顯的結(jié)構(gòu)特征. 酰胺I帶通常不受肽鏈側(cè)基影響， 其振動(dòng)頻率取決于肽鏈構(gòu)型， 與膠原蛋白的有序程度有關(guān)， 對(duì)三螺旋結(jié)構(gòu)的變化非常敏感. 酰胺II帶一般由異相N—H內(nèi)彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)引起， 與酰胺I帶一樣也是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的吸收區(qū)域， 對(duì)三螺旋結(jié)構(gòu)的變化不敏感. 膠原蛋白在酰胺III帶的吸收與脯氨酸側(cè)鏈和特征羥脯氨酸環(huán)狀C—C的伸縮振動(dòng)有關(guān)， 變性膠原蛋白在酰胺III帶的吸收峰會(huì)發(fā)生偏移現(xiàn)象； 海蜇膠原蛋白與牛皮I型膠原蛋白都在615 cm-1處出現(xiàn)了Hyp的特征峰.

表6 海蜇膠原蛋白的紅外光譜帶指認(rèn)

注： “+”表示敏感， “-”表示不敏感

2.5.4 近紫外掃描光譜分析

圖6 海蜇膠原蛋白的近紫外吸收光譜 Fig.6 Ultraviolet absorption of collagen from jellyfish

在200～400 nm的近紫外光區(qū)對(duì)海蜇膠原蛋白進(jìn)行掃描， 其光譜圖如圖6所示. 結(jié)果顯示， 海蜇膠原蛋白含酪氨酸殘基， 其分子內(nèi)部存在著共軛雙鍵， 在275 nm處有吸收峰； 海蜇膠原蛋白的最大吸收峰在238 nm處， 這主要是蛋白質(zhì)肽鏈彎曲作用導(dǎo)致由肽鍵C=O引起的吸收峰發(fā)生紅移的緣故， 與其他來源的水產(chǎn)膠原蛋白的近紫外吸收特征一致.

2.5.5 黏度特性及熱變性溫度

不同溫度下膠原蛋白的黏度隨時(shí)間變化情況如圖7所示. 當(dāng)溫度在15 ℃及以下時(shí)， 膠原蛋白溶液的黏度隨時(shí)間變化不明顯， 說明海蜇膠原蛋白在不超過15 ℃的溫度條件下結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定； 當(dāng)溫度超過24 ℃時(shí)， 膠原蛋白的黏度在10 min內(nèi)迅速下降， 這是由于膠原蛋白在達(dá)到或超過其熱變性溫度時(shí)， 膠原蛋白主鏈開始解旋變性生成明膠， 導(dǎo)致黏度下降.

熱變性溫度是表征膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞的重要溫度節(jié)點(diǎn). 將30 min內(nèi)黏度變化50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度定義為熱變性溫度， 如圖8所示， 海蜇膠原蛋白的熱變性溫度為22.7 ℃， 低于陸生膠原蛋白.

圖7 不同溫度下海蜇膠原蛋白黏度變化曲線Fig.7 Changes of viscosity of collagen from jellyfishat different temperatures

圖8 海蜇膠原蛋白熱變性溫度測(cè)定Fig.8 Thermal denaturation temperature of collagen from jellyfish

在15 ℃條件下測(cè)定不同pH值對(duì)膠原蛋白黏度的影響， 結(jié)果如圖9所示. 海蜇膠原蛋白黏度隨pH值的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)， 當(dāng) pH值在6～9之間， 溶液黏度無明顯變化， 表明海蜇膠原蛋白的等電點(diǎn)pI值在6～9之間， 在該pH值范圍內(nèi)膠原蛋白分子呈中性， 整個(gè)分子趨于卷曲狀態(tài)， 因此表現(xiàn)出較低的黏度值.

圖10為海蜇膠原蛋白質(zhì)量濃度對(duì)其黏度的影響曲線， 當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg·mL-1時(shí)， 溶液的黏度達(dá)到最大值， 之后隨濃度的繼續(xù)升高再無明顯變化， 這是由于膠原蛋白作為聚電解質(zhì)， 相對(duì)分子質(zhì)量較大， 溶液中含有大量多聚體， 分子鏈之間的締合作用和水合作用較大， 造成了低濃度時(shí)較小濃度的增大引起黏度較大的變化.

圖9 pH值對(duì)膠原蛋白黏度的影響Fig.9 Effect of pH value on viscosity of collagenfrom jellyfish

圖10 質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白黏度的影響Fig.10 Effect of mass concentration on viscosity of collagen from jellyfish

2.5.6 溶解性特征

圖11為NaCl質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白溶解性的影響， 由圖11可知， 在NaCl質(zhì)量濃度低于0.7 mg·mL-1時(shí)， 海蜇膠原蛋白的溶解度較為穩(wěn)定； 當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度大于0.8 mg·mL-1時(shí)， 溶解度隨NaCl質(zhì)量濃度的升高急劇下降， 在NaCl質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)基本析出. 這是由于在低質(zhì)量濃度下， Na+與膠原蛋白締合， 使膠原蛋白所帶正電荷數(shù)增加， 分子間斥力增大， 從而具有較大的溶解度； 當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度較高時(shí)， 鹽離子又破壞了膠原蛋白周圍的水化層， 使之發(fā)生鹽析現(xiàn)象.

圖12 為pH值對(duì)膠原蛋白溶解度的影響， 從圖12可知， 在pH值為3～4時(shí)， 海蜇膠原蛋白的溶解度最高； 當(dāng)pH值大于5時(shí)， 其溶解度隨pH值升高急劇下降， 在pH值為6～9范圍內(nèi)， 膠原蛋白的溶解度最低； 當(dāng)pH值為10時(shí)， 溶解度又有明顯的上升趨勢(shì). 這可能是高濃度的堿對(duì)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定程度破壞， 使得部分膠原蛋白變性形成明膠溶于溶劑中， 從而表現(xiàn)出溶解度上升的假象.

圖11 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白溶解性的影響Fig.11 Effect of NaCl mass concentration on solubility of collagen from jellyfish

圖12 pH值對(duì)膠原蛋白溶解度的影響Fig.12 Effect of pH value on solubility of collagen from jellyfish

3 結(jié)語

研究利用海蜇加工下腳料制備膠原蛋白， 建立海蜇膠原蛋白的提取工藝， 并對(duì)獲得的海蜇膠原蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析， 得到以下結(jié)果.

1) 通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定海蜇膠原蛋白的提取工藝參數(shù)為: 提取溫度15 ℃、 檸檬酸濃度0.05 mol·L-1、 胃蛋白酶添加量1.5%、 料液比1∶2.0和提取時(shí)間8 h， 膠原蛋白提取率可達(dá)97.41%. SDS-PAGE電泳圖譜顯示： 海蜇膠原蛋白主要含相對(duì)分子質(zhì)量約為124 ku的α1鏈， 還有少量二聚體β鏈和三聚體γ鏈， 初步判斷其結(jié)構(gòu)為[α1]3.

2) 海蜇膠原蛋白的氨基酸組成分析表明， 其Gly質(zhì)量百分含量最高， 占氨基酸總量的25.16%， Pro和Hyp的質(zhì)量百分含量分別為7.62%和9.32%， 人體必須氨基酸總量占總氨基酸的21.46%， 未檢測(cè)到Cys和Try； 傅里葉紅外光譜及近紫外光區(qū)掃描結(jié)果表明： 提取的海蜇膠原蛋白保留了較為完整的三螺旋結(jié)構(gòu).

3)海蜇膠原蛋白的黏度及溶解性特征顯示： 在pH≤1和pH≥10的范圍內(nèi)， 其結(jié)構(gòu)開始趨于不穩(wěn)定， 表觀黏度下降， 表觀溶解度上升； 在pH值3～4范圍內(nèi)， 黏度和溶解度最大， 在pH值6～9范圍內(nèi)， 黏度和溶解度最小， 表明其等電點(diǎn)pI值在6～9之間； 黏度隨溫度的升高而下降， 其熱變性溫度為22.7 ℃； 黏度還隨其質(zhì)量濃度的增加而升高， 在6 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定； 在大于1.0 mg·mL-1的NaCl溶液中海蜇膠原蛋白基本析出.

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