林士森， 劉瑋潔， 林靖穎， 楊楠楠， 劉樹(shù)滔

(福州大學(xué)生物工程研究所， 福建 福州 350002)

0 引言

胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase， EC-SOD)是一類(lèi)含Cu、 Zn原子的SOD酶類(lèi), 可高效催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2與O2, 能夠清除體內(nèi)多余的氧自由基[1]， 在組織損傷修復(fù)、 口腔癌、 肺損傷等方面的治療有明顯效果[2-4]， 具有較高潛在價(jià)值. 但EC-SOD在生物體內(nèi)的含量遠(yuǎn)低于其它SOD同工酶， 目前主要從動(dòng)物主動(dòng)脈和肺部中提取， 提取工藝繁瑣且最終獲取量較低， 不利于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用[5-6]. 工業(yè)生產(chǎn)中為了解決產(chǎn)量少的問(wèn)題， 通常利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)菌株， 便于制備大量EC-SOD投入于生產(chǎn)應(yīng)用. 但在許多表達(dá)系統(tǒng)中， 如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)， 存在無(wú)法對(duì)真核蛋白進(jìn)行正確的加工處理、 表達(dá)蛋白常以包涵體形式存在等一系列問(wèn)題[7-8]； 在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中， 其表達(dá)重組蛋白結(jié)構(gòu)與天然蛋白高度相似但表達(dá)量較低[9]. 因此采用甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)體系， 表達(dá)的目的蛋白能夠分泌至胞外， 有利于工業(yè)上的分離純化， 其表達(dá)的蛋白能夠形成二硫鍵、 糖基化修飾等高級(jí)結(jié)構(gòu)， 且表達(dá)量高， 與天然蛋白相似， 為人源EC-SOD的獲取提供了極大的便利[10].

目前已有構(gòu)建EC-SOD表達(dá)菌株的少量報(bào)道， 在酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究中[11]， 其發(fā)酵液通過(guò)超濾濃縮后， EC-SOD表達(dá)量也僅有0.45 mg·mL-1， 酶活力為760 U·mg-1， 可見(jiàn)其構(gòu)建的表達(dá)菌株并不能滿(mǎn)足工業(yè)化需求， 并且N端存在多余氨基酸(谷氨酸、 苯丙氨酸)， 使重組蛋白與天然EC-SOD的N端結(jié)構(gòu)存在一定差異. 本研究在前人基礎(chǔ)上， 致力于改善酶活較低， N端非天然產(chǎn)物等問(wèn)題， 以人源EC-SOD基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)， 對(duì)比畢赤酵母最適密碼子并對(duì)其修改， 以期顯著提高畢赤酵母的表達(dá)水平， 且與天然EC-SOD結(jié)構(gòu)更加相似. 研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建EC-SOD畢赤酵母表達(dá)菌株， 并對(duì)其表達(dá)的EC-SOD進(jìn)行性質(zhì)分析與酶活力測(cè)定.

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

pUC57由上海生工公司合成； 擴(kuò)增菌株JM109、 表達(dá)菌株P(guān)ichiapastorisX33及表達(dá)載體pPICZαA購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司.

1.2 主要藥品與試劑

DNA marker DL5000、 DL2000， 限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、SacI、XhoI、SalI、 PCR mix等購(gòu)自日本Takara公司； UNIQ-10柱離心式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、 瓊脂糖膠回收試劑盒、 Protein Molecular Weight Marker等購(gòu)自上海生工生物工程公司、 美國(guó)Thermo Fish公司； 酵母提取物及胰蛋白胨等為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品； DEAE離子交換樹(shù)脂為日本TOSOH公司產(chǎn)品； 其余試劑藥品均為分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

由上海生工公司合成的含有人源EC-SOD密碼子優(yōu)化后基因(687 bp)的pUC57質(zhì)粒， 質(zhì)粒設(shè)計(jì)中在基因前后加入XhoⅠ(上游)和EcoRⅠ(下游)兩個(gè)酶切位點(diǎn)， 同時(shí)引入2個(gè)堿性氨基酸Lys 和Arg以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的胞外分泌. 最終確定引物上游為CTCGAGAAAAGATGGACTGGTGA及下游引物為GAATTCTTAAGCAGCCTTACATTCAG.

將pPICZαA質(zhì)粒用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切切開(kāi)， 并從pUC57質(zhì)粒上使用相同切下含有目的片段的序列(使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切后序列大于目的基因序列， 但由于在設(shè)計(jì)基因序列中尾端含有終止密碼子， 所以多余序列不影響表達(dá))連接至pPICZαA載體上， 篩選重組質(zhì)粒pPICZαA-EC-SOD， 轉(zhuǎn)E.coli.(JM109)， 篩選表達(dá)菌株JM109-EC-SOD提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切并PCR驗(yàn)證篩選出目的菌株， 進(jìn)一步使用SacⅠ線性化重組質(zhì)粒進(jìn)入畢赤酵母X33， 提取酵母基因組DNA經(jīng)驗(yàn)證篩出目的菌株.

1.3.2 畢赤酵母的誘導(dǎo)與表達(dá)

目的蛋白的實(shí)驗(yàn)參考Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)說(shuō)明書(shū). 重組菌株P(guān)ichia.(X33) 置于YPD 培養(yǎng)基中， 30 ℃搖培24 h后， 按1%的接種量轉(zhuǎn)接至不含葡萄糖的YP培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 待OD600= 3.0～5.0開(kāi)始誘導(dǎo)(誘導(dǎo)前取樣)， 按1%(體積分?jǐn)?shù))的誘導(dǎo)劑量添加甲醇， 每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為1%并取樣1 mL測(cè)酶活， 在誘導(dǎo)第6天和第7天后酶活趨于穩(wěn)定， 無(wú)明顯增加， 因此只需誘導(dǎo)5 d.

1.3.3 EC-SOD初步分離純化

由于目的蛋白理論等電點(diǎn)為6.4左右， 在pH值為8的條件下， 能使雜蛋白吸附到DEAE弱陰離子交換樹(shù)脂上， 目的蛋白不能被吸附， 從而起到分離的作用. 因此將發(fā)酵液離心后， 取上清3 L進(jìn)行硫酸銨沉淀， 用30 mL pH值為8的緩沖液溶解沉淀， 并用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 u隔夜透析. 使用柱體積30 cm×φ1 cm的層析柱， 以1 mL·min-1流速上樣5 mL樣品， 收集穿透峰并用OD280檢測(cè)及酶活測(cè)定， 驗(yàn)證其中含有重組蛋白EC-SOD.

1.3.4 EC-SOD活性定性檢測(cè)

對(duì)發(fā)酵液12 000 r·min-1離心10 min， 收集上清， SDS-PAGE 觀察分析. 上清液與初步分離純化樣品采用鹽酸羥胺法測(cè)定SOD酶活力[12]， NBT活性電泳染色[13].

2 結(jié)果分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

以pPICZαA質(zhì)粒為真核表達(dá)載體， 構(gòu)建EC-SOD基因畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒， 經(jīng)EcoRⅠ，XhoⅠ雙酶切(見(jiàn)圖1)及PCR驗(yàn)證(見(jiàn)圖2). 箭號(hào)處為目的基因， 且重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)含有目的基因， 這些結(jié)果均表明目的片段已成功連接至表達(dá)載體上.

隨后將重組質(zhì)粒使用SacⅠ線性化后， 電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33中， 在Zeocin抗性平板挑取單菌落培養(yǎng)并提取酵母基因組DNA， 進(jìn)行PCR驗(yàn)證(見(jiàn)圖3).

圖1 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR identification of the recombinant

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切Fig.2 Enzyme digestion identification of the recombinant

圖3 酵母基因組PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.3 PCR identification of the chromosome of Pichia pastoris

2.2 rcEC-SOD誘導(dǎo)與表達(dá)及活力鑒定

25 mL培養(yǎng)基在100 mL三角瓶中培養(yǎng)并誘導(dǎo)5 d， 收集每日菌液離心取上清， 進(jìn)行SDS-PAGE分析(見(jiàn)圖4)， 并使用鹽酸羥胺法測(cè)定SOD酶活. 結(jié)果表明， 最終活力為178 U·mL-1， 比活為508 U·mg-1， 酶活隨誘導(dǎo)天數(shù)增加而升高(見(jiàn)圖5).

圖4為畢赤酵母X33重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖. 電泳結(jié)果顯示， 在相對(duì)分子質(zhì)量為17與40 ku處， 誘導(dǎo)前未表達(dá)EC-SOD， 誘導(dǎo)后出現(xiàn)EC-SOD的蛋白條帶(見(jiàn)圖4上下箭頭部分)， 且蛋白質(zhì)條帶伴隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而逐漸加深.

圖4 畢赤酵母EC-SOD-X33發(fā)酵液上清電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the supernatant from Pichia pastoris

圖5 畢赤酵母誘導(dǎo)過(guò)程中酶活變化趨勢(shì)圖Fig.5 Activity change trend of EC-SOD during the induction of Pichia pastoris for 5 days

2.3 rcEC-SOD初步分離純化

發(fā)酵液上清經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀， 透析后使用DEAE弱陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行初步分離純化， 在pH=8.0時(shí)上樣收集穿透峰， 用1 mol·L-1NaCl溶液洗脫雜蛋白. 純化結(jié)果如圖6所示， 箭頭處為穿透峰， 經(jīng)酶活測(cè)定穿透峰中含有大量EC-SOD， 洗脫峰中未檢測(cè)到酶活性， 說(shuō)明其中不含有EC-SOD. 收集穿透峰進(jìn)行SDS-PAGE， 結(jié)果如圖7所示， 穿透樣品在17與40 ku處出現(xiàn)EC-SOD的蛋白條帶， 進(jìn)一步證實(shí)EC-SOD富集在穿透峰.

圖6 EC-SOD-X33 DEAE弱陰離子交換樹(shù)脂初步分離Fig.6 Purification of EC-SOD in DEAE resin

圖7 EC-SOD-X33 DEAE弱陰離子交換樹(shù)脂初步分離Fig.7 Preliminary preparation with DEAE resin

2.4 rcEC-SOD活性電泳染色

為進(jìn)一步驗(yàn)證純化后蛋白活性， 進(jìn)行氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法活性定性檢測(cè). 取發(fā)酵液上清與過(guò)DEAE弱陰離子樹(shù)脂初步分離純化液進(jìn)行Native-Page凝膠電泳后， 利用NBT法對(duì)PAGE膠進(jìn)行活性定性檢測(cè). 結(jié)果如圖8、 9所示， 在沒(méi)有EC-SOD的位置為藍(lán)紫色背景， 發(fā)白位置出現(xiàn)清晰透明的SOD活性染色條帶， 證實(shí)純化的蛋白具有SOD酶活性.

圖8 發(fā)酵上清液NBT活性染色Fig.8 Supernatant in native-page and stain with NBT

圖9 初步分離純化蛋白活性染色Fig.9 Preliminary preparation in native-page and stain with NBT

3 討論

實(shí)驗(yàn)在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中， 成功構(gòu)建重組pPICZαA質(zhì)粒， 并在Pichiapastoris中成功胞外分泌表達(dá)， 分泌出的EC-SOD蛋白具有活性高、 易分離純化、 與天然蛋白相似的特點(diǎn).

在畢赤酵母構(gòu)建EC-SOD表達(dá)菌株的相關(guān)研究中， 已經(jīng)有學(xué)者做過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)[11]， 將發(fā)酵液濃縮后進(jìn)行性質(zhì)分析， 濃縮后比活約為760 U·mg-1， 該實(shí)驗(yàn)采用ELISA法定量出EC-SOD的蛋白含量， 所以比活相當(dāng)于純化后的蛋白比活. 但該研究未對(duì)EC-SOD基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化， N端存在多余的氨基酸(谷氨酸、 苯丙氨酸)， 因此表達(dá)量與結(jié)構(gòu)特性等方面有待提高.

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)， 首先對(duì)天然EC-SOD的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化， 從理論上能夠提高酵母的表達(dá)水平， 并刪去N端信號(hào)肽， 直接連接畢赤酵母中的KEX2水解酶. 其次在序列設(shè)計(jì)中， 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的蛋白序列與天然的EC-SOD一致， 擁有極其相似的生理活性. 經(jīng)酶活與蛋白量測(cè)定， 在25 mL搖瓶上清液的比活約為508 U·mg-1， EC-SOD蛋白表達(dá)量為0.19 mg·mL-1， 5 L發(fā)酵罐中比活約909 U·mg-1， 經(jīng)DEAE初步純化后， 比活約為1 700 U·mg-1. 因此， 本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵上清液(未濃縮)的蛋白表達(dá)量和酶活都與前人實(shí)驗(yàn)中濃縮后的結(jié)果相近， 甚至更好. 由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的EC-SOD的N端序列與天然一致， 因此在比活力上得到顯著提升. 通過(guò)NBT染色實(shí)驗(yàn)， 進(jìn)一步驗(yàn)證重組菌株表達(dá)出具有活性的EC-SOD蛋白.

在實(shí)驗(yàn)的最終發(fā)酵產(chǎn)物中， 發(fā)現(xiàn)可能視為單體(17 ku)與二聚體(40 ku)的重組蛋白同時(shí)存在， 也可能是雜蛋白形式存在， 但并未對(duì)其作出驗(yàn)證， 需通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析. 通過(guò)文獻(xiàn)查閱得知， 天然的EC-SOD主要是以四亞基形式存在， 亞基之間是靠疏水作用結(jié)合[14-15]， 因此在SDS-PAGE僅能打斷分子間的二硫鍵. 相關(guān)研究也表明重組表達(dá)的EC-SOD具有單體與二聚體結(jié)構(gòu)共存的現(xiàn)象， 并且在Cu/Zn SOD中也存在類(lèi)似單體與二聚體共存的情況[16]， 由此可推斷EC-SOD在溶液中可能存在多聚體結(jié)構(gòu).

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