劉建鑫 ，尚海霞 ，楊 弘 ，魏麗慧 ，2，彭 軍 ，2，莊群川 ，2，林久茂 ，2?

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，每年約有100萬新診斷患者和約74萬胃癌患者死亡［1］。大多數(shù)胃癌患者在首診時已是晚期階段同時還伴有遠端轉(zhuǎn)移或局部浸潤［2］。事實上，大部分癌癥患者不是因為原位癌而死亡，而是轉(zhuǎn)移癌。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的典型特征之一，顯著增加了癌癥相關(guān)死亡率［3］。在晚期胃癌患者治療中，放化療仍然是首選方法，常見化療藥物包括奧沙利鉑、5-FU、司莫司汀等［4］。雖然還有越來越多的新藥被研發(fā)出來并逐步推廣，但胃癌患者的5 a生存率卻不容樂觀，只有 23%～32%［5］，因此，治療胃癌需要更加有效的藥物。

八寶丹源自1555年宮廷秘方，至今已有460余年歷史，組方包括麝香、羚羊角、牛黃、蛇膽、三七、珍珠6味名貴中藥材［6］，具有清利濕熱、活血解毒、去黃止痛的功效，兼有輔助抗菌、調(diào)節(jié)機體免疫功能作用，長期服用可以減輕化療藥物的毒副作用，除肝膽疾病、泌尿系統(tǒng)疾病外，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病以及其他疑難雜癥的治療方面也取得了良好的效果［6］。但是八寶丹對胃癌細胞的抑制作用及其分子機制尚不明確，因此，本文通過探討八寶丹對胃癌細胞遷移能力的影響，為八寶丹的臨床應(yīng)用提供進一步的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物和細胞株 八寶丹購自廈門中藥廠股份有限公司（0.3 g／粒；生產(chǎn)批號：150930）；人胃癌細胞株AGS和MGC803購自中科院上海細胞生物研究所，保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心液氮中。

1.2 試劑與耗材 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）、二甲亞砜（DMSO）購自美國 Gibco 公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉（北京索萊寶科技有限公司公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司。

1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；CO2培養(yǎng)箱、-80℃冰箱（美國 Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；Countes?全自動細胞計數(shù)儀（美國 Life公司）；全自動酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）。

2 方 法

2.1 BBD溶液制備 將八寶丹粉末，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成 25 mg／mL的溶液，超聲溶解后高壓滅菌，于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng) 將胃癌細胞株AGS、MGC803置于含 10%滅活胎牛血清（FBS）、100 U／mL青霉素和100 μg／mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分成對照組（0 mg／mL）、低劑量組（0.25 mg／mL）、中劑量組（0.5mg／mL）、高劑量組（0.75 mg／mL），各組給予相應(yīng)劑量的BBD干預(yù)24 h。

2.3 MTT檢測分析 取對數(shù)生長期的AGS和MGC803以0.8×105個／mL接于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，置 37℃含 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細胞匯合度達到50%～60%，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入含不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）培養(yǎng)液100 μL；培養(yǎng) 24 h 后每孔加入 MTT（0.5 mg／mL）100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后吸棄液體并加入DMSO 100 μL／孔，室溫放置 10 min，于全自動酶標(biāo)儀 570 nm測定各組吸光度值（A值），并計算：

細胞生長抑制率／%＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。

2.4 劃痕實驗分析 取對數(shù)生長期的AGS和MGC803細胞以2×105個／mL密度接種于6孔板，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細胞匯合度達到80%～90%時，進行劃痕，并于不同時間點（0、6、12、24 h）進行拍照（×100）。不同濃度藥物干預(yù)24 h后，以細胞劃痕的愈合程度來判斷BBD對腫瘤細胞遷移能力的影響。

2.5 Transwell實驗 取對數(shù)生長期的AGS和MGC 803以2×105個／mL接種于6孔板中，每孔2 mL，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細胞匯合度達到50%～60%，吸棄孔內(nèi)溶液，分別加含有不同濃度 BBD（終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL；干預(yù)24 h后，吸棄各孔溶液，各孔分別進行消化，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞；按5×104個／孔接種于Tranwell的上室（內(nèi)室），下室于實驗前2 h加0.7 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基（置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中）；12 h后用棉簽擦去Tranwell內(nèi)室上層的細胞，其下層用結(jié)晶紫染色15 min，最后在倒置顯微鏡拍照（×100）。

2.6 粘附實驗分析 取對數(shù)生長期的AGS和MGC803以2×105個／mL接種于6孔板中，每孔2 mL，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細胞匯合度達到50%～60%，吸棄孔內(nèi)溶液，分別加含有不同濃度 BBD（終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL；干預(yù)24 h后，吸棄各孔溶液，各孔分別進行消化，重懸，調(diào)整細胞密度為2×104個／mL，重新接種于6孔板中；培養(yǎng) 4 h后，吸棄各孔溶液，用PBS洗兩遍，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，最后在倒置顯微鏡下拍照（×200）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 BBD對AGS和MGC803細胞活力的抑制率與對照組比較，BBD具有抑制AGS和MGC803細胞活力的作用，并呈劑量依賴性。見表1。

表1 BBD對AGS和MGC803細胞活動的抑制率（x±s）%

3.2 BBD對AGS和MGC803細胞損傷修復(fù)能力的影響 劃痕結(jié)果顯示：給藥24 h后，對照組劃痕距離明顯縮短，而不同濃度BBD干預(yù)后能抑制劃痕距離的縮短，即抑制細胞劃痕愈合程度，并呈劑量依賴性。見圖1、圖2。

圖1 BBD對AGS細胞損傷修復(fù)能力的影響（×100）

3.3 BBD對AGS和MGC803細胞遷移能力的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示：在藥物干預(yù)24 h后，對照組有較多的細胞穿過小孔膜，而不同濃度BBD干預(yù)后穿過小孔的細胞數(shù)量逐漸減少，呈劑量依賴性。見圖3。

3.4 BBD對AGS和MGC803細胞粘附能力的影響 與對照組比較，不同濃度BBD干預(yù)后細胞的數(shù)目逐漸較少，并呈劑量依賴性。見圖4。

4 討 論

圖3 BBD對MGC803細胞損傷修復(fù)能力的影響（×100）

圖4 BBD對AGS和MGC803細胞遷移能力的影響（×100）

圖5 BBD對AGS和MGC803細胞粘附能力的影響（×200）

目前胃癌仍以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療、生物治療和中醫(yī)藥治療等綜合治療［4，5］。但相關(guān)研究表明：局部進展期胃癌術(shù)后發(fā)病率為40%～70%，2次術(shù)后的5 a生存率不足25%［7］，很多復(fù)發(fā)患者伴有遠端轉(zhuǎn)移和局部浸潤，轉(zhuǎn)移顯著增加了癌癥相關(guān)死亡率［2-3］。因此，尋找更加有效防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療藥物成為亟待解決的重要問題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療胃癌等惡性腫瘤的局限性使得臨床療效確切、毒副作用少的中藥復(fù)方日益受到國內(nèi)外研究者的重視。

八寶丹對包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤具有明顯的療效，與放化療聯(lián)合使用可以起到減輕病人疼痛、改善臨床癥狀、降低放化療的毒副作用，延長患者生存期［8］。另外，基礎(chǔ)研究表明八寶丹具有輔助抗菌、抗炎和調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用［6］。但八寶丹對胃癌遷移和侵襲方面的藥效作用及其作用機制尚不清楚。

在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細胞的生長活力、遷移能力、粘附能力等起了至關(guān)重要的作用。因此，本文觀察八寶丹對腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，來研究八寶丹抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBD能抑制AGS和MGC803細胞的活力，抑制細胞的損傷修復(fù)能力，抑制細胞的遷移能力，抑制細胞的粘附能力，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用，提示BBD具有抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的作用。本研究為BBD臨床治療胃癌及防治胃癌細胞轉(zhuǎn)移提供新的實驗依據(jù)。

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