夏秀芳，王 博，鄭幸子，鄧思楊，潘 男，王 浩*

20世紀初美國蛋白質(zhì)委員會首次對糖蛋白進行描述：主要是指由蛋白質(zhì)分子和除核酸外的包含碳水化合物基團的物質(zhì)共同組成的一類復合物[1-2]。在食品的加工和貯藏過程中，氨基化合物和羰基化合物之間極易發(fā)生非酶褐變反應，糖蛋白產(chǎn)物中糖鏈與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基通過共價鍵相連，形成特殊的三級、四級結構，國內(nèi)外很多研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白能夠有效地提高蛋白質(zhì)的乳化性、凝膠性和溶解性等。肖連冬等[3]以大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）與蔗糖為研究材料，在一定濃度下，經(jīng)糖基化反應得到的糖蛋白乳化性逐漸升高，增加了體系的黏稠度。劉穎等[4]以南極磷蝦為研究材料，實驗得到的南極磷蝦糖蛋白具有更好的乳化穩(wěn)定性、起泡性、溶解性等功能特性。Nakamura等[5]合成的溶菌酶-葡萄糖的共價復合物具有很好的乳化特性，同時也提高了溶菌酶的抗菌范圍。Moreno等[6]利用酪蛋白和乳糖在40 ℃下合成的糖蛋白乳化性得到了顯著的提高。因此糖蛋白作為一種食品添加劑，能夠滿足人們對蛋白質(zhì)的一些特殊需求，如今已經(jīng)廣泛地應用于食品加工等領域。

隨著對蛋白組學研究的深入，國際上很多學者對各種糖和蛋白質(zhì)反應得到的糖蛋白進行了深入的研究，結果發(fā)現(xiàn)糖蛋白的抗氧化性和抗菌性得到了不同程度的提高。陳黎洪等[7]在對金華火腿研究時，對其副產(chǎn)物酶解物與木糖反應得到的糖蛋白的抗氧化性進行測定，結果發(fā)現(xiàn)，隨著反應的深入，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率與還原能力逐漸增強。馬志玲等[8]采用不同種類氨基酸和葡萄糖進行模式美拉德反應得到的糖蛋白，反應時間越長，體系的褐變程度加深，糖蛋白的抗氧化性越強。項惠丹等[9]在研究酪蛋白和SPI與多種還原糖發(fā)生反應時發(fā)現(xiàn)，不同反應條件下的產(chǎn)物都具有較強的抗氧化性。Deepak等[10]對鱗莖中29 kDa糖蛋白的抗真菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)糖蛋白糖部分被高碘酸氧化后失去抗真菌活性，說明糖蛋白糖部分在抗真菌活性中起到重要的作用。以上研究大多集中在糖蛋白抗氧化性方面，但是關于抗氧化性提高的機理方面研究很少，本研究將以SPI和葡萄糖為原料，研究不同反應條件下糖蛋白抗氧化性的變化及機理，為深入研究大豆糖蛋白及其在食品中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂低溫豆粕 黑龍江省大自然糧油集團有限公司；β-巰基乙醇、DPPH、Tris 美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）標準分子蛋白 大連寶生物科技有限公司；三氯乙酸、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設備

DK-8B電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器 常州國華電器有限公司；AL-104型精密電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器設備有限公司；AM-1磁力攪拌器 北京鼎昊源實驗儀器有限公司；GL-21M冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Mini電泳儀 美國伯樂公司；FD-2A冷凍干燥機 北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；UT-1800紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

取200 g脫脂低溫豆粕粉與15 倍體積的去離子水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，攪拌2 h后，將其懸浮液在4 ℃條件下6 000 r/min離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.5。靜置后在4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min。取蛋白沉淀分散于5 倍體積水中并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥后測定蛋白含量，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大豆糖蛋白的制備

SPI和葡萄糖按蛋白與糖的質(zhì)量比1∶1放于燒杯中用蒸餾水溶解，使蛋白質(zhì)量分數(shù)為8%，保鮮膜密封，將混合液分別放入70、80 ℃和90 ℃的恒溫水浴鍋中反應，分別在0、1、2、3、4、5、6 h取樣，將樣品冷凍干燥，測定樣品蛋白含量，備用。

1.3.3 還原能力測定

采用He Yuehua等[11]的方法，并稍作修改。取0.5 mL大豆糖蛋白，加入2.5 mL濃度為0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀，充分混合。將混合物在50 ℃水浴下保溫20 min，再加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3 000×g下離心10 min。取2.5 mL上層清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，在700 nm波長處測定其吸光度，以吸光度表征還原能力。

1.3.4 羥自由基清除能力測定

參照金鳴等[12]的方法，取1 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液，加入2 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液和1 mL蒸餾水，充分混勻，再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液和1 mL體積分數(shù)0.01%過氧化氫溶液，37 ℃保溫60 min，于536 nm波長處測得吸光度Ap；用1 mL蒸餾水代替1 mL過氧化氫溶液，測得吸光度AB，1 mL大豆糖蛋白溶液代替蒸餾水，測得吸光度As。采用式（1）計算大豆糖蛋白對羥自由基的清除率。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定

參照Saiga等[13]的方法，并略作修改。取大豆糖蛋白溶液0.5 mL和3.5 mL 1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液加入同一帶塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用無水乙醇作參比，于517 nm波長處測吸光度。根據(jù)公式（2）計算大豆糖蛋白對DPPH自由基的清除率。

式中：A1為加大豆糖蛋白后DPPH溶液的吸光度；A2為大豆糖蛋白溶液的吸光度；A3為未加大豆糖蛋白時DPPH溶液的吸光度。

1.3.6 游離氨基含量的測定

參照Benjakul等[14]的方法并稍作修改。取大豆糖蛋白溶液125 μL，與2.0 mL 0.212 5 mol/L、pH 8.2的磷酸鹽緩沖液混合，再加入體積分數(shù)0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液1.0 mL。充分混合后，在50 ℃水浴中避光保溫30 min。再加入2.0 mL 0.1 mol/L的Na2SO3終止反應，冷卻15 min，于420 nm波長處測定吸光度。以L-亮氨酸為標準物，重復以上步驟得出標準曲線，并計算樣品中的游離氨基含量。

1.3.7 褐變程度的測定

準確稱取25 mg大豆糖蛋白溶于5 mL水中，以水作空白樣，于420 nm波長處測定吸光度，用吸光度來表示大豆糖蛋白的褐變程度。

1.3.8 紫外吸收光譜的測定

以去離子水為空白，在室溫下測定各處理組大豆糖蛋白（1 mg/mL）的紫外吸收及其二階導數(shù)圖譜。

1.3.9 SDS-PAGE分析

參照Xia Xiufang等[15]的方法，10%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為12 μL；開始電泳時電壓為80 V，待樣品進入分離膠后改為120 V；取出膠片用考馬斯亮藍染色30 min，用甲醇-冰醋酸脫色液脫至透明。電泳膠片置于凝膠成像儀攝像，結合Tanon軟件進行分析和處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復3 次，結果表示為 ±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。采用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同反應溫度和時間制得大豆糖蛋白的還原能力

還原能力是評價天然抗氧化劑抗氧化能力的重要指標，本實驗中制得的大豆糖蛋白具有很好的還原能力，這可能是由于反應過程產(chǎn)生了大量褐色素、吡咯酮、脫氧果糖嗪類、還原酮等能夠提供氫電子的物質(zhì)，其提供的電子可將Fe3+還原為Fe2+，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應[16]。從圖1中可以看出，隨反應溫度的升高大豆糖蛋白的還原能力逐漸增強，3 個溫度制得大豆糖蛋白的還原能力變化趨基本一致，0～4 h其還原能力隨著反應時間的延長顯著提高，5 h其還原能力有所下降，反應進行6 h還原能力呈現(xiàn)上升趨勢，這可能是由于反應生成的美拉德產(chǎn)物在長時間高溫下有部分分解，造成還原力有所下降，而后又重新發(fā)生聚集使還原能力增強。此外，不同條件制得大豆糖蛋白還原能力均高于SPI，90 ℃ 6 h的大豆糖蛋白具有最高的還原能力，比SPI還原能力提高4.6 倍，說明糖基化改性后的SPI具有更好的抗氧化活性。美拉德產(chǎn)物具有還原作用，Kim等[17]對此也有研究，其發(fā)現(xiàn)甘氨酸、三甘氨酸、甘氨酰甘氨酸這3 種氨基酸與葡萄糖生成的大豆糖蛋白的還原力隨著反應時間的延長而增加。此外，其對間接誘導脂類氧化的過氧化物具有較強的消除能力，Yoshimura等[18]研究表明，葡萄糖-賴氨酸反應體系制得的大豆糖蛋白中含有焦糖化物或雜環(huán)物質(zhì)，這些化合物都能消除過氧化物，具有較強的抗氧化能力。另外，其抗氧化能力隨著加熱時間的延長而明顯增強，經(jīng)脫色處理后的大豆糖蛋白抗氧化能力顯著下降，這就一定程度上證明了褐色素物質(zhì)具有抗氧化作用。

圖1 不同反應溫度和時間制得大豆糖蛋白的還原能力Fig. 1 Reducing power of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

2.2 不同反應溫度和時間制得大豆糖蛋白的羥自由基清除能力

圖2 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的羥自由基清除能力Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

抗氧化劑可以提供氫原子與脂類的自由基反應，使自由基結合形成比較穩(wěn)定的非活性化合物，從而干擾或阻斷鏈式反應的繼續(xù)進行。蛋白質(zhì)與糖質(zhì)量比為1∶1條件下不同反應溫度和反應時間制取大豆糖蛋白的羥自由基清除能力見圖2。隨著反應時間的延長，70 ℃大豆糖蛋白的羥自由基清除能力不斷增強，最大清除率為4.71%；同時80 ℃ 0～4 h大豆糖蛋白隨反應時間延長羥自由基清除能力也呈上升趨勢，在反應時間為4 h時清除率達到最大為5.04%，5～6 h羥自由基清除能力呈現(xiàn)降低趨勢；90 ℃大豆糖蛋白在反應開始隨反應時間延長顯示出羥自由基清除能力的提高，在5 h時達到最高清除率5.87%，6 h大豆糖蛋白的羥自由基清除能力低于5 h的。從圖2還可以看出，高反應溫度制得的大豆糖蛋白具有更高的羥自由基清除能力；此外，90 ℃ 5 h的大豆糖蛋白羥自由基清除能力最高，比SPI提高了0.69 倍，說明其具有比SPI更高的羥自由基清除能力。本實驗中制得的大豆糖蛋白具有較強的羥自由基清除能力，且它的羥自由基清除能力隨反應時間的延長而增加。這是因為大豆糖蛋白在發(fā)揮抗氧化作用時，有可能是作為氫供體，其本身也是金屬螯合劑，可以螯合Fe2+，因此大豆糖蛋白擁有比較強的羥基自由基清除能力，也有可能與其具有螯合Fe2+的能力有關[19]。這與Vhangani等[20]的研究相一致，他們的研究結果表明賴氨酸與果糖的美拉德反應產(chǎn)物具有較強的羥自由基清除能力。

2.3 不同反應溫度和時間制得大豆糖蛋白的DPPH自由基清除能力

圖3 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的DPPH自由基清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

DPPH的乙醇溶液呈紫色，它是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在517 nm波長處有最大吸收。當DPPH溶液中有自由基清除劑加入時，其孤電子被配對，導致其溶液在517 nm波長處的吸光度變小。通常清除率大小表示樣品對自由基的清除能力。如圖3所示，不同反應溫度和反應時間制得的大豆糖蛋白都具有一定的DPPH自由基清除能力，其DPPH自由基清除能力隨著反應溫度的升高而增強。因為溫度高有利于美拉德反應，溫度越高在較短時間內(nèi)就能生成類黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)都具有清除DPPH自由基的能力。80 ℃大豆糖蛋白和90 ℃大豆糖蛋白的DPPH自由基清除能力呈相同趨勢，0～5 h大豆糖蛋白的DPPH自由基清除率顯著增加，在反應5 h清除率達到最高，分別為45.59%和68.55%，6 h大豆糖蛋白自由基清除能力有下降；70 ℃大豆糖蛋白DPPH自由基清除能力隨反應時間的延長總體呈現(xiàn)上升趨勢。另外，最高的大豆糖蛋白自由基清除率比SPI提高了2.68 倍。這是因為美拉德反應達到一定程度時，美拉德反應終產(chǎn)物類黑精形成，其是美拉德中間產(chǎn)物與與氨基化合物反應而成，而且其短肽含有抗氧化活性的支鏈氨基酸。在產(chǎn)生類黑精的同時，有一系列的美拉德反應中間體——還原酮類物質(zhì)及雜環(huán)類化合物生成，這些產(chǎn)物也具有抗氧化等活性[8]。

2.4 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的游離氨基含量

圖4 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的游離氨基含量Fig. 4 Free amino group contents of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

游離氨基含量的變化關系著美拉德反應程度，游離氨基減少越多，反應進行的程度就越大[21]。由圖4可以看出，反應過程中隨著加熱時間的延長游離氨基含量顯著降低（P＜0.05），70、80、90 ℃ 大豆糖蛋白的游離氨基含量由6.79 mmol/L分別降到6.14、5.93、5.68 mmol/L，這是因為隨著反應的進行葡萄糖和SPI的—NH2聚合成高分子質(zhì)量的大豆糖蛋白，從而使游離氨基含量逐漸降低。另外，隨著反應溫度的提高游離氨基含量降低幅度增大，說明溫度的提高有利于美拉德反應產(chǎn)物的生成，在美拉德反應過程中，游離氨基含量隨著美拉德反應的進行消耗的越多，其游離氨基含量的變化一定程度上反映美拉德反應的進程。Naranjo等[22]研究了酪蛋白與還原糖進行美拉德反應，結果發(fā)現(xiàn)隨著反應時間的延長，氨基酸含量也逐漸降低。這個結果表明，當加熱進行時，蛋白質(zhì)或氨基酸的α-或ε-NH2基團更大程度地與糖共價結合形成糖基化蛋白，同時，大豆糖蛋白重新排列成一個更穩(wěn)定的酮胺或Amadori產(chǎn)物。

2.5 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的褐變程度

表1 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的褐變程度Table 1 Effect of different reaction temperatures and time on browning degree of soy glycoprotein

蛋白質(zhì)與糖接枝反應往往伴隨著褐變現(xiàn)象，反應后期形成一種大分子質(zhì)量的棕褐色聚合產(chǎn)物，這一類物質(zhì)統(tǒng)稱為類黑精。美拉德反應的末期階段，SPI和葡萄糖片段縮合成大分子的褐色素類黑精，類黑精在420 nm波長處有明顯吸收，420 nm波長處吸光度越高說明褐色素類黑精的生成量越多，反應體系溶液顏色越深。隨著反應時間的延長，形成色素物質(zhì)越來越多，反應產(chǎn)物的褐變程度也隨之加深。反應褐變程度對大豆糖蛋白的抗氧化活性也有影響[23]，本研究通過測定反應液在420 nm波長處的吸光度表示褐變程度，反映類黑精的生成量。由表1可以看到，同一溫度下隨著反應時間的延長，褐變程度逐漸增大且差異性顯著（P＜0.05），5 h大豆糖蛋白在420 nm波長處吸光度有所降低，到6 h褐變程度又顯示出升高趨勢，這與其還原能力的變化一致。這可能是由于美拉德反應的初始階段，還原糖和氨基酸反應可生成不穩(wěn)定的無色氨基還原酮，反應后期形成褐色物質(zhì)類黑精。主要有3 種結構的類黑精：蛋白質(zhì)與低分子質(zhì)量著色化合物交聯(lián)產(chǎn)生的以蛋白質(zhì)為基本成分的類黑精；由呋喃或吡咯重復單元組成的類黑精聚合物；醇醛縮合形成糖降解產(chǎn)物中的以碳水化合物為基礎的類黑精。在類黑精混合體中，類黑精是一種以短肽和色素相結合的混合體，其短肽的氨基酸序列結構具有抗氧化肽的特征。所以類黑精類物質(zhì)具有相同顯著的抗氧化和消除活性氧等性能，其抗氧化強度可與食品中常用的抗氧化劑相當[24]。Murakami等[25]指出早期階段產(chǎn)生的無色產(chǎn)物的自由基清除活性比有色產(chǎn)物的自由基清除活性小，隨著反應加熱時間過長反應產(chǎn)物裂解退化為前期產(chǎn)物。這也是隨著反應時間的延長大豆糖蛋白的還原能力變化的原因。另外，隨著反應溫度的升高，褐變程度不斷增大且具有顯著性差異（P＜0.05），可能是因為溫度越高越有利于美拉德反應高級階段的進行。

2.6 不同溫度和反應時間制得大豆糖蛋白紫外光譜二階導數(shù)分析結果

圖5 不同溫度、反應時間制得大豆糖蛋白的紫外光譜二階導數(shù)分析Fig. 5 Secondary derivative UV spectral analysis of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

蛋白質(zhì)中苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸這些芳香族氨基酸能產(chǎn)生紫外吸收光譜，這3 種氨基酸殘基的側鏈基團在280 nm波長處都有特征吸收峰，由于譜峰的信號疊加很難分辨出峰的具體特征。因此對紫外吸收光譜進行求導得到其二階導數(shù)光譜，用于分析近紫外區(qū)域復雜的蛋白譜圖遷移信息和描述3 種芳香族氨基酸的結構變化[26]。SPI在250～300 nm范圍內(nèi)存在兩個正吸收峰（269 nm和296 nm）和兩個負吸收峰（259 nm和279 nm）。296 nm波長處的正峰被認為是色氨酸的貢獻[16]。如圖5所示，相對于SPI，大豆糖蛋白的色氨酸吸收峰發(fā)生不同程度的紅移，即原來蛋白分子表面的芳香族氨基酸減少。70 ℃大豆糖蛋白色氨酸吸收峰紅移不明顯，80 ℃和90 ℃大豆糖蛋白的色氨酸吸收峰紅移程度變大，且90 ℃條件下制得的大豆糖蛋白色氨酸吸收峰紅移程度大于80 ℃反應體系，這可能是隨著糖基化的進行，暴露的色氨酸吲哚結構中的—NH基團發(fā)生美拉德反應而導致其含量降低，有研究報道美拉德反應的蛋白側鏈芳香族氨基酸殘基是較強的自由基清除劑，因為它們可提供氫原子給自由基，達到猝滅自由基的效果，同時通過共振結構保持自身穩(wěn)定[27]，大豆蛋白與葡萄糖反應產(chǎn)生的大豆糖蛋白結構不同，導致自由基清除能力有差異。

2.7 不同反應溫度和時間制得大豆糖蛋白的SDS-PAGE結果

圖6 不同反應溫度和反應時間制得大豆糖蛋白的SDS-PAGEFig. 6 SDS-PAGE analysis of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

本實驗采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量的組成。經(jīng)過SDS處理后的蛋白質(zhì)分子的二級結構、三級結構和四級結構都被破壞；同時，蛋白質(zhì)分子二硫鍵被疏基乙醇破壞導致鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵被還原。蛋白質(zhì)因為這兩種因素而發(fā)生變性，變性蛋白多肽鏈與SDS以質(zhì)量比1∶4結合，形成SDS-蛋白質(zhì)混合物，使蛋白質(zhì)所帶負電荷的量遠超過其本身所帶有的電荷，這種情況下，SDS-蛋白質(zhì)的電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小，而不取決于蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)。大分子物質(zhì)在凝膠網(wǎng)絡結構中移動時受到較大的阻力，因此滯留在凝膠的上方，較小的分子則具有較大的遷移率，分布在凝膠的下方。通過電泳分析糖基化改性對蛋白的降解或聚合作用。圖6很清晰地顯示出未經(jīng)處理的SPI的各亞基條帶，其中α’、α和β為大豆β-伴球蛋白的3 個亞基，A和B分別是大豆球蛋白的酸性多肽鏈和堿性多肽鏈。隨著反應時間的延長大豆糖蛋白的α’和α亞基條帶逐漸變淺，最終幾乎消失，這說明了糖基化溫度為90 ℃時糖基化反應速度快，生成的糖基化SPI多。這與Diftis等[28]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)SPI與羧甲基纖維素的接枝物中，7S亞基完全消失不見。同時，還可以看出，80 ℃和90 ℃反應生成的大豆糖蛋白在凝膠頂部存在的一些顏色較暗的條帶，很可能就是SPI中的亞基與葡萄糖發(fā)生了聚合作用，形成了大分子聚合物，這種聚合物可能是類黑素，它們的分子質(zhì)量過大，不能穿過凝膠網(wǎng)絡，因此堆積在膠的頂部，而70 ℃反應生成的大豆糖蛋白在濃縮膠與分離膠接縫處基本沒有條帶，推測70 ℃條件下制得的大豆糖蛋白起抗氧化作用的主要物質(zhì)可能為還原酮或揮發(fā)性雜環(huán)化合物。從大豆糖蛋白的電泳圖中也不難看出，大豆糖蛋白均隨著溫度的升高，亞基譜帶減少，特別是90 ℃、6 h制得的大豆糖蛋白的電泳圖譜上基本看不到亞基的條帶，這是因為考馬斯亮藍通常情況下在酸性環(huán)境中通過靜電等非共價作用與蛋白質(zhì)分子上的自由氨基等活性基團結合，從而呈現(xiàn)顏色反應，隨著反應溫度的升高和反應時間的延長，SPI和葡萄糖進行更加充分的糖基化作用，使得蛋白質(zhì)中自由氨基含量減少，同時考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)分子的結合也就相應地減少，使大豆糖蛋白的電泳凝膠用考馬斯亮藍染色時顏色變淡或消失。同時發(fā)現(xiàn)在濃縮膠和分離膠的接縫處新條帶的生成，并且該化合物分子質(zhì)量大于200 kDa，這說明SPI經(jīng)過美拉德反應后生成了大分子化合物。

3 結 論

大豆糖蛋白的抗氧化性隨著反應溫度的升高逐漸增強，同時，隨著反應時間的延長，大豆糖蛋白的抗氧化性也會相應提高，當達到一定反應時間時，大豆糖蛋白中的抗氧化成分發(fā)生裂解導致抗氧化能力降低。隨著反應的進行，大豆糖蛋白的游離氨基含量都明顯下降，反應溫度越高、反應時間越長，其游離氨基含量下降越多。同時，大豆糖蛋白溶液顏色均有不同程度的加深且差異顯著（P＜0.05），且溫度越高大豆糖蛋白的褐變程度越大，即其中類黑精含量越高。另外，通過其紫外光譜二階導數(shù)分析可知，經(jīng)過反應后蛋白中色氨酸發(fā)生偏移，芳香族氨基酸暴露出來，導致大豆糖蛋白的結構發(fā)生變化，而從SDS-PAGE的分析中也看出蛋白與糖發(fā)生聚合。物質(zhì)的結構決定性質(zhì)，大豆糖蛋白的抗氧化性和其結構存在著密切聯(lián)系，由于美拉德反應的復雜性，需要考慮多重因素，對大豆糖蛋白的抗氧化機理有待于更深入的研究。

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