李倩茹，胡霏，楊悅熙，劉曉云，何小維

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088）（3.廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司自檢型快速診斷國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663）

沙門氏菌(Salmonella)在自然界中分布較廣，通常能引起人和動(dòng)物的食物中毒，是人類細(xì)菌性食物中毒中最重要的病原菌之一[1,2]。在已知的2500多個(gè)血清型中，我國發(fā)現(xiàn)的約有100個(gè)。最常見的引起食物中毒的有鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，ST)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)。Kuang等[3]對我國健康活雞、豬和奶牛進(jìn)行了沙門氏菌調(diào)查，檢出率分別為12.55%、4.09%和25.12%，并且分離到的這些菌株主要屬于 B血清型的 ST。沙門氏菌能產(chǎn)生一種“多糖-類脂-蛋白質(zhì)”的內(nèi)毒素，這些毒素可導(dǎo)致腸黏膜發(fā)炎、水腫、充血，嚴(yán)重的引起敗血癥甚至死亡。為防止ST污染，消除食品安全隱患，一種簡單、快速篩查方法已成為大家共同的期待。

目前關(guān)于食源性致病菌的檢測方法，常用的有基于選擇性培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)法，基于抗原抗體反應(yīng)的酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)[4]、免疫層析法(ICA)和新型免疫傳感器檢測法等，基于核酸檢測的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[5,6]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[7,8]。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，達(dá)不到快速檢測的目的。基于核酸的檢測方法檢測靈敏度高，但所需儀器設(shè)備昂貴，且需要專業(yè)的技術(shù)人員操作[9]?；诿庖邔W(xué)的檢測方法中，ICA簡單快速，15 min內(nèi)可出檢測結(jié)果[10]。膠體金通常用作ICA標(biāo)記物，通過物理吸附作用與抗體蛋白結(jié)合。此種方法被用檢測炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)，其靈敏度為3×107CFU/mL[11]。Wang等也利用膠體金作為標(biāo)記物制備了免疫層析試紙條，檢測純牛奶中的ST，檢測靈敏度為1.25×106CFU/mL[12]。這種基于膠體金標(biāo)記的ICA，檢測的靈敏度低，且不能夠定量檢測。把熒光素包裹進(jìn)聚苯乙烯微球中而制得的 FM，其熒光由于聚苯乙烯的阻隔作用而不會(huì)受環(huán)境中各種因子的影響，熒光信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定，其表面修飾的羧基能與抗體表面的氨基通過EDC/NHS的作用而發(fā)生穩(wěn)定的結(jié)合，使其不會(huì)從抗體表面脫落。Xie等比較了FM與膠體金用于標(biāo)記檢測，結(jié)果表明FM與抗體的偶聯(lián)率和檢測的靈敏度都高于膠體金標(biāo)記[13]。然而食品中致病菌的檢測結(jié)果還受到食品基質(zhì)的影響，為了消除這種干擾，免疫磁分離技術(shù)是一種很好的方法。該方法是通過磁性微球上偶聯(lián)特異性抗體形成IMB，與食品中存在的抗原發(fā)生特異性結(jié)合后，在磁力的作用下，抗源抗體復(fù)合物與其它雜質(zhì)分離，從而達(dá)到快速富集致病菌的作用。該技術(shù)與其它檢測技術(shù)的結(jié)合可使檢測靈敏度得到大大提高[14]。本研究所采用的 FM-ICA+IMB檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法未見報(bào)道，該方法的建立對快速監(jiān)測食品中的鼠傷寒沙門氏菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，ST，ATCC 14028）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi，ST，CMCC 50071）、甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi，SP，ACMCC50093）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi，SP，BCMCC 50094）、大腸埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coli O157：H7，E.coli O57：H7，NCTC 12900）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，BT，ATCC 10792）、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurous，SA，BNCC 339952)、八疊球菌（Sarcina，CMCC 28001），大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli，CMCC 44108）接種于 LB 培養(yǎng)液中 37 ℃培養(yǎng)18 h；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM，ATCC 19115）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM，CMCC 54004）接種于腦心浸液中 37 ℃培養(yǎng) 24 h；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP，ATCC 33847）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP，ATCC 17802）接種于堿性蛋白胨水中37 ℃增菌培養(yǎng)18 h。增菌后的菌液加入0.5%的甲醛置于4 ℃冰箱中12 h滅活，然后12000 r/min離心10 min，重懸于PBS (0.1 M，pH 7.4，0.1%NaN3)中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑及儀器

鼠傷寒沙門氏菌多克隆抗體為廣州萬孚生物抗體實(shí)驗(yàn)室自制；鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體購自臺(tái)灣Abnova公司；羊抗兔IgG（GAR）、兔IgG、羊抗鼠IgG (GAM)購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；羧基磁珠xMag購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司；熒光微球購自美國 Merck公司；乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫-20、一水嗎啉乙磺酸（MES）購自美國Sigma公司；硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊、PVC板購自美國Millipore公司；熒光微球稀釋液、標(biāo)記A液、C液、S系統(tǒng)及包被緩沖液等由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司提供。

噴膜機(jī)(IsoFlow)，美國 Biodot公司；切條機(jī)(HGS201)，杭州峰航科技有限公司；熒光檢測儀(飛測)，廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司；多功能磁性分離器(MS-12)，上海奧潤微納科技有限公司；超純水機(jī)(Milli-Q)，美國 Millipore公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器(2HWY-21029型)，上海智誠分析儀器制造。

1.2 方法

1.2.1 磁性微球與抗體偶聯(lián)

采用 EDC/NHS偶聯(lián)法[15]，磁性微球(0.5 mg)用MEST (10 mM，pH 6.0，0.05% Tween-20)清洗3次，加入新鮮配制的 50 μL EDC (5 mg/mL)和 50 μL NHS(5 mg/mL)反應(yīng)30 min活化磁性微球表面的羧基基團(tuán)，磁分離去除未反應(yīng)的EDC和NHS，加入250 μL MES緩沖液(含抗-ST多克隆抗體80 μg)懸浮磁性微球，置于恒溫振蕩器中混勻反應(yīng)3 h；磁分離去除未偶聯(lián)的抗體，然后加入PBST (含1% BSA)于37 ℃反應(yīng)30 min，封閉磁珠表面的自由基團(tuán)；最后加入250 μL PBST緩沖液（pH 7.4、含0.02% NaN3及0.5% BSA）懸浮磁珠，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。偶?lián)率用磁性微球與抗體偶聯(lián)前后的蛋白濃度來計(jì)算，用Micro BCA檢測試劑盒測定偶聯(lián)液中的抗體濃度。

1.2.2 熒光微球與抗體偶聯(lián)

取2.5 mg熒光微球于稀釋液中洗滌2次，然后加入活化緩沖液(A液)新鮮配制的Sulfo-NHS和EDC溶液各250 μL (10 mg/mL)，超聲混勻，置于振蕩器上閉光反應(yīng)20 min，然后12000 r/min離心10 min，去除多余的EDC和NHS并洗滌3次得到活化的熒光微球；加入偶聯(lián)緩沖液(C液)稀釋的抗體超聲分散后閉光震蕩反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后，洗滌3次，去除未偶聯(lián)的抗體，然后再加入1 mL 0.5% BSA封閉未偶聯(lián)的羧基基團(tuán)，然后保存于S系統(tǒng)中備用。

1.2.3 免疫層析試紙條的制備及條件優(yōu)化

免疫層析試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組成，樣品墊預(yù)先用PBS (10 mM，pH 7.2，0.05%吐溫-20，2% BSA，3%蔗糖，0.05% NaN3)處理，硝酸纖維素膜上的分別設(shè)置檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，兩線間間隔4 mm，把抗-ST抗體和羊抗鼠IgG(GAM)稀釋至一定濃度，分別以2 μL/cm的量噴到T線和C線上，置于50 ℃烘箱中干燥48 h。然后按順序把處理過的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相互搭接在聚氯乙烯（PVC）板上，用切條機(jī)切割成 4 mm寬的試紙條。試紙條裝入檢測卡中待用。測試時(shí)把熒光微球標(biāo)記的抗-ST抗體和鼠IgG進(jìn)行稀釋，然后加入到待檢樣本中，混合反應(yīng) 1 min，形成抗原抗體免疫復(fù)合物，然后取75 μL滴加于免疫層析試紙條的加樣孔中，層析15 min后用熒光定量檢測儀檢測T線和C線的熒光值。

T線和C線包被濃度的確定：用包被液稀釋抗-ST多克隆抗體至終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL，GAM稀釋至終濃度為0.1、0.2、0.5、1 mg/mL；并分別噴到對應(yīng)的T線和C線上，然后進(jìn)行熒光檢測。

標(biāo)記濃度的篩選：將抗-ST MAb濃度調(diào)整至終濃度0.2、0.4、0.5、1.0 mg/mL，并與熒光微球進(jìn)行偶聯(lián)。標(biāo)記后GAM稀釋比例為1：800，標(biāo)記后ST MAb稀釋比例為設(shè)置為 1：50、1：75、1：100、1：150、1：200，然后與樣品以2：3比例混合，加樣80 μL檢測T/C值。

1.2.4 FM-ICA性能評價(jià)

1.2.4.1 敏感性

用 PBS緩沖液將已知濃度的 ST菌液稀釋至1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、2×109、5×109、8×109、5×1010CFU/mL，每個(gè)濃度用FM-ICA重復(fù)測定三次，以菌液濃度對數(shù)值[LG(CFU/mL)]為橫坐標(biāo)，以T/C值為縱坐標(biāo)，繪制濟(jì)量反應(yīng)曲線，確定檢測的線性范圍。20份陰性樣本(20 PBS)的T/C值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差即為CUT-OFF值，通過CUT-OFF值求出最低檢測限(Limit of Detection，LOD)，定量限的計(jì)算是通過20份陰性樣本的平均值加上10倍標(biāo)準(zhǔn)差而求出。測定的T/C值大于或等于CUT-OFF值則為陽性，小于CUT-OFF值則為陰性。

1.2.4.2 特異性

對13株非目標(biāo)菌的高濃度菌懸液(109)進(jìn)行測試，如果所得T/C值高于CUT-OFF值則判斷有交叉反應(yīng)。

1.2.4.3 回收率

通過向PBS緩沖液中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)ST菌液制得已知濃度的菌懸液，然后取不同批次制作的試紙條進(jìn)行測試?；厥章适峭ㄟ^檢測值與實(shí)際添加量的百分比，每個(gè)濃度測定5個(gè)平行，回收率越高，該檢測方法越準(zhǔn)確。

1.2.4.4 精密度

板內(nèi)精密度的測定：通過選取同一張PVC板制作的試紙條對5個(gè)ST菌液進(jìn)行檢測，每個(gè)菌液濃度測10次；板間精密度的測定：選取不同的PVC板進(jìn)行測試，每個(gè)濃度測10次。

1.2.5 IMB+FM-ICA對模擬樣本的檢測

從市場上購買雞蛋、鮮豬肉和西紅柿三種常見食物作為模擬樣本。分別根據(jù)國家食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：蛋與蛋制品檢驗(yàn)、肉與肉制品檢驗(yàn)，對蛋、鮮肉進(jìn)行預(yù)處理得到10倍稀釋的蛋清液、10倍稀釋的蛋黃液；西紅柿用勻質(zhì)機(jī)勻質(zhì)，將其搗爛分別提取西紅柿汁及過濾后西紅柿汁。然后分別向1 mL樣液中添加 ST 至終濃度為 1×107、3×106、1×105CFU/mL，然后向3×106、1×105CFU/mL兩個(gè)濃度中加入0.5 mg制備好的免疫磁珠，于37 ℃ 190 r/min混合30 min，磁分離后去上清，再加入磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 2.6，0.2 M)進(jìn)行洗脫，分離ST和IMB，上清液加入Tris-HCl調(diào)pH至7.0左右，然后取80 μL加入熒光檢測卡中進(jìn)行測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 FM-ICA制備

圖1 FM-ICA試紙條優(yōu)化Fig.1 Optimization of FM-ICA test strip

抗體的標(biāo)記濃度直接影響檢測的熒光信號(hào)，理論上隨著抗體濃度的增加，更多的抗體可以結(jié)合到熒光微球上，從而增加捕獲抗原機(jī)會(huì)，然而，當(dāng)標(biāo)記濃度過高時(shí)，可能會(huì)造成抗體表面抗原表位的空間位阻效應(yīng)，從而阻碣了抗原抗體的結(jié)合。C線和T線上抗體的包被量也直接影響熒光信號(hào)值，陽性/陰性的熒光信號(hào)值隨著包被抗體濃度的升高而出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，而且C線上抗體濃度過高，T/C值便會(huì)減小，過小的T/C值影響檢測的敏感性；標(biāo)記抗體的量與待測抗原的量也影響檢測的敏感性。因此，F(xiàn)M-ICA制備的最優(yōu)條件需要從熒光信號(hào)強(qiáng)度、T/C值、SD值、線性范圍、成本節(jié)約及變異系數(shù)等方面進(jìn)行篩選。通過一系列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)確定C線包被濃度為0.5 mg/mL(圖 1a)，在此包被濃度下，T/C值較大，對不同濃度菌液的敏感性較高，且C線的熒光信號(hào)較強(qiáng)；T線包被抗體的濃度越高，T/C值越大，但當(dāng)包被濃度為1 mg/mL時(shí)的T/C值不再增大，幾乎與2 mg/mL時(shí)的 T/C值一樣(圖 1b)，說明 T線的包被濃度為 1 mg/mL時(shí)，檢測的敏感性最高；在GAM的標(biāo)記濃度為0.5 mg/mL并稀釋800倍的條件下，ST MAb標(biāo)記濃度為0.5 mg/mL時(shí)T/C值最大，稀釋100倍后用于檢測不同菌液濃度的T/C值最高(圖1c和d)，敏感性最好，因此選擇0.5 mg/mL作為最佳標(biāo)記濃度。

2.2 FM-ICA敏感性

圖2 熒光強(qiáng)度隨菌液濃度的變化(a)及對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)Fig.2 Changes of fluorescence intensity with the concentration of bacteria (a) and the corresponding standard curve (b)

免疫層析過程容易受很多因素的影響，如樣品的基質(zhì)、樣品的粘度、環(huán)境溫度、空氣濕度以及硝酸纖維素膜的材質(zhì)及孔徑大小等，即使同一樣品不同批次檢測熒光信號(hào)值也會(huì)有差異。為了消除這些差異帶來的影響，采用檢測線與質(zhì)控線的比值（T/C值）校正上述因素引起的誤差，使結(jié)果更穩(wěn)定。在最優(yōu)條件下，試紙條的熒光強(qiáng)度隨菌液濃度的增加而增大，檢測的線性范圍為 3.2×106～2×109CFU/mL(圖 2a)。曲線擬合得三次曲線 y=0.62x3-12.96x2+90.63x-210.56，R2=0.9997(圖2b)。對20份空白樣品測得的T/C值，分別為0.83和0.89，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出檢測限為3.2×106CFU/mL，定量限為4.1×106CFU/mL。本實(shí)驗(yàn)所測得的檢測限值與其他學(xué)者的研究結(jié)果相比，相對偏高，筆者認(rèn)為這可能與不同的抗體材料、不同檢測儀器的敏感性有關(guān)。

2.3 回收率

添加回收實(shí)驗(yàn)一般用來評價(jià)試紙條定量檢測的準(zhǔn)確度，回收率是指檢測值與添加量的百分比，回收率越高檢測越接近真實(shí)值，準(zhǔn)確度越高。本實(shí)驗(yàn)通過在樣品中添加已知濃度菌液，然后用3個(gè)批次的檢測卡進(jìn)行模擬檢測，結(jié)果如表1，從表1中可以看出，三個(gè)批次的回收率都差不多，不同批次的檢測卡對檢測結(jié)果的影響不大。

但添加菌液濃度為106CFU/mL時(shí)，回收率相對較低，三個(gè)批次分別為73.69%、69.67%和68.38%，但當(dāng)檢測較高濃度菌液時(shí)，回收率均在80%～120%之間。

表1 FM-ICA對不同濃度菌液的回收率Table 1 Recoveries of FM-ICA for different bacterial concentrations

2.4 精密度

精密度是指重復(fù)測定同一均勻樣品所得結(jié)果的一致程度，它表示了分析方法的可重復(fù)性及測量系統(tǒng)隨機(jī)誤差的大小[16]。本實(shí)驗(yàn)采用變異系數(shù)法（CV值）來評價(jià)試紙條的精密度大小，變異系數(shù)越小，則分析方法的精密度越高。4個(gè)菌液濃度10次重復(fù)測定結(jié)果如表2，從表2中可以看出，不同的菌液濃度所測得的T/C值變異系數(shù)均小于5%。

表2 FM-ICA精密度分析Table 2 Precision analysis of FM-ICA

2.5 特異性

圖3 FM-ICA的特異性分析Fig.3 Specificity analysis of FM-ICA

由于沙門氏菌屬內(nèi)的菌株會(huì)有相同抗原的存在，當(dāng)用5×108CFU/mL菌液進(jìn)行檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌檢測的T/C值高于CUT-OFF值，顯示陽性信號(hào)，結(jié)果見圖3。但當(dāng)菌液濃度低于1×108CFU/mL，非目標(biāo)菌(包括沙門氏屬內(nèi)菌株)的檢測結(jié)果呈陰性，特異性較好。

2.6 FM-ICA+IMB對模擬樣本檢測

圖4 不同食品基質(zhì)對回收率的影響Fig.4 Effects of different food matrices on recoveries

經(jīng)過均質(zhì)后的三種樣本稀釋液分別接種已知濃度的鼠傷寒沙門氏菌至終濃度為1×107、3×106和1×105CFU/mL，對3×106、1×105CFU/mL的模擬樣本加磁珠富集10倍和100倍后再用FM-ICA進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4。從圖中可看出，不加磁珠富集的模擬樣本，回收率為 71%～169.8%，雞蛋(無論是蛋清還是蛋黃)中的回收率遠(yuǎn)超出實(shí)際添加量，分別達(dá)到 147.94%和169.83%，西紅柿汁和西紅柿濾液中的回收率最接近真實(shí)值，都達(dá)到80%以上，肉汁中的回收率最低，說明不同的食品基質(zhì)對FM-ICA檢測結(jié)果影響較大。加磁珠富集后，模擬樣本的回收率為38%～55%，遠(yuǎn)低于不加磁珠的模擬樣本，但靈敏度可達(dá)1×105CFU/mL，較單一FM-ICA檢測至少提高了30倍。

結(jié)果表明，無論單一方法檢測或聯(lián)合檢測，西紅柿汁和西紅柿汁濾液作為基質(zhì)樣本時(shí)檢測回收率均高于蛋清、蛋黃和肉汁樣本，西紅柿作為檢測基質(zhì)對信號(hào)值的影響最小，其余兩種樣本對熒光信號(hào)值影響較大。本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)國家食源性致病菌檢測標(biāo)準(zhǔn)對樣本進(jìn)行10倍稀釋處理，所得回收率出現(xiàn)偏高和偏低的情況，這可能與食品基質(zhì)的稀釋倍數(shù)有關(guān)[17]。免疫磁珠用于捕獲食源性致病菌是一種快速富集的方法，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的增菌培養(yǎng)而節(jié)約檢測所需的時(shí)間，理論上磁珠富集后所得的回收率應(yīng)該與添加量相當(dāng)，然而，本方法中磁珠富集到的致病菌需進(jìn)行洗脫才能進(jìn)行檢測，在洗脫的過程中，可能造成了菌體表面抗原的破壞而使回收率降低，另外，洗脫的過程本身也造成了細(xì)菌的損失。因此，如何提高磁珠捕獲后的洗脫率及如何防止細(xì)菌表面抗原遭到破壞將作進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

3.1 本研究采用熒光微球作標(biāo)記物，建立了FM-ICA快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法，并篩選出 FM-ICA的最佳制備工藝為：C線包被濃度為 0.5 mg/mL、T線包被濃度為1 mg/mL、鼠傷寒沙門氏菌MAb標(biāo)記濃度為0.5 mg/mL并稀釋100倍，GAM的標(biāo)記濃度為0.5 mg/mL并稀釋800倍。

3.2 FM-ICA用于檢測鼠傷寒沙門氏菌純培養(yǎng)時(shí)其最低檢測限為3.16×106CFU/mL，最低定量限為4.08×106CFU/mL，對高濃度菌液的回收率均在 80%～120%之間，板內(nèi)和板間變異系數(shù)均小于 5%，該方法可用于鼠傷寒沙門氏菌快速定量，準(zhǔn)確度高。當(dāng)菌液濃度低于1×108CFU/mL，與同屬沙門氏菌無交叉反應(yīng)信號(hào)，特異性較好。

3.3 食品基質(zhì)影響FM-ICA+IMB聯(lián)合檢測的回收率，但使用IMB富集能使檢測的靈敏度提高30倍，最低檢測限為105CFU/mL，并在2 h內(nèi)完成檢測過程。本研究所制備的FM-ICA+IMB是一種快速、靈敏、特異的檢測方法，能用于食品加工過程的快速篩查鼠傷寒沙門氏菌，但捕獲后的洗脫過程有待進(jìn)一步研究。

[1]Kotova A L, S A Kondratskaya, I M Yasutis. Salmonella carrier state and biological characteristics of the infectious agent [J]. Journal of Hygiene Epidemiology Microbiology &Immunology, 1988, 32(1)：71

[2]Callejón R M, M I Rodrígueznaranjo, C Ubeda, et al.Reported foodborne outbreaks due to fresh produce in the United States and European Union：trends and causes [J].Foodborne Pathogens & Disease, 2015, 12(1)：32-38

[3]Kuang X, H Hao, M Dai, et al. Serotypes and antimicrobial susceptibility of Salmonella spp. isolated from farm animals in China [J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6：602

[4]Wu X, W Wang, L Liu, et al. Monoclonal antibody-based cross-reactive sandwich ELISA for the detection of Salmonella spp. in milk samples [J]. Analytical Methods,2015, 7(21)：9047-9053

[5]宮強(qiáng),李戰(zhàn)麗,牛明福,等.鼠傷寒沙門氏菌 ompc基因 PCR的檢測方法[J].食品科學(xué),2015,36(16)：251-254 GONG Qiang, LI Zhan-li, NIU Ming-fu, et al. Establishment of PCR detection method for Salmonella typhimurium based on ompc gene [J]. Food Science, 2015, 36(16)：251-254

[6]Mcguinness S, E Mccabe, E O'Regan, et al. Development and validation of a rapid real-time PCR based method for the specific detection of Salmonella on fresh meat [J]. Meat Science, 2009, 83(3)：555-562

[7]黃文宇,柳陳堅(jiān).食源性沙門氏菌檢測方法的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2009,9(3)：95-97 HUANG Wen-yu, LIU Chen-jian. Research progress of detection methods of foodborne Salmonella [J].Biotechnology, 2009, 19(3)：95-97

[8]Ravan H, M Amandadi, N Sanadgol. A highly specific and sensitive loop-mediated isothermal amplification method for the detection of Escherichia coli O157：H7 [J]. Microbial Pathogenesis, 2016, 91：161-165

[9]Law J W F, N S Ab Mutalib, K G Chan, et al. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens：principles,applications, advantages and limitations [J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 5：770

[10]Yeni F, S Acar, ? G Polat, et al. Rapid and standardized methods for detection of foodborne pathogens and mycotoxins on fresh produce [J]. Food Control, 2014, 40：359-367

[11]Fisher M, Y Atiya-Nasagi, I Simon, et al. A combined immunomagnetic separation and lateral flow method for a sensitive on-site detection of Bacillus anthracis spores-assessment in water and dairy products [J]. Letters in Applied Microbiology, 2009, 48(4)：413-418

[12]Wang W, L Liu, S Song, et al. A highly sensitive ELISA and Immunochromatographic strip for the detection of Salmonella typhimurium in milk samples [J]. Sensors, 2015,15(3)：5281-5292

[13]Xie Q Y, Y H Wu, Q R Xiong, et al. Advantages of fluorescent microspheres compared with colloidal gold as a label in immunochromatographic lateral flow assays [J].Biosensors & Bioelectronics, 2014, 54：262-265

[14]Zhang X, J Zhou, C D Zhang, et al. Rapid detection of Enterobacter cloacae by immunomagnetic separation and a colloidal gold-based immunochromatographic assay [J]. Rsc Advances, 2016, 6(2)：1279-1287

[15]張賽,何小維,劉曉云,等.熒光免疫層析法結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)快速檢測單增李斯特菌[J].現(xiàn)代食品科技,2014,11：229-234 ZHANG Sai, HE Xiao-wei, LIU Xiao-yun, et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes using a fluorescence immunochromatographic assay combined with immunomagnetic bead separation [J]. Modern Food Science and Technology, 2014, 11：229-234

[16]L?nnberg M, J Carlsson. Quantitative detection in the attomole range for immunochromatographic tests by means of a flatbed scanner [J]. Analytical Biochemistry, 2001, 293(2)：224

[17]Wu X, M Huang, S Yu, et al. Rapid and quantitative detection of 4(5)-methylimidazole in caramel colours：a novel fluorescent-based immunochromatographic assay [J]. Food Chemistry, 2016, 190：843-7