游淑珠，唐食明，蔡教英，姚麗鋒，王小玉，馮家望，丁琦，符家忍

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東珠海 519000）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）為人和溫血?jiǎng)游锬c道正常棲居菌，絕大部分大腸埃希氏菌在正常棲居條件下不致病，若侵入組織或血液時(shí)可引起化膿性炎癥或敗血癥，可引發(fā)體弱或免疫力低下人群或動(dòng)物感染。有些大腸埃希氏菌為食源性致病菌，能引起人類以腹瀉癥狀為主的病癥，這些大腸埃希氏菌被統(tǒng)稱為致瀉性大腸埃希氏菌（diarrheagenic E. coli，DEC）。致瀉性大腸埃希氏菌可分為：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic E. coli，EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（enteroaggregative E. coli，EAggEC）、擴(kuò)散附著大腸埃希氏菌（diffusely adherent E. coli，DAEC）和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌為（shigatoxin-producingE. coli，STEC）六大類[1]。部分產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌屬于腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagicE. coli，EHEC）可引起人類出血性結(jié)腸炎或出血性腹瀉、溶血性尿毒綜合癥等臨床癥狀。

致瀉性大腸埃希氏菌與特定血清型有一定相關(guān)性，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》列出了已發(fā)現(xiàn)的EPEC、ETEC、EIEC、EAggEC和STEC五種致瀉大腸埃希氏菌的所有相關(guān)血清型，其中大腸埃希氏菌O145血清型與 EPEC、STEC相關(guān)[1,2]。從臨床病人和溫血?jiǎng)游镏芯蟹蛛x大腸埃希氏菌O145的致病性菌株的相關(guān)報(bào)道[3～7]，1984年日本首次報(bào)道大腸埃希氏菌O145導(dǎo)致的食源性疾病暴發(fā)事件以來，美國、德國、比利時(shí)等許多國家都報(bào)道過大腸埃希氏菌O145引起的食源性疾病暴發(fā)事件[6～8]，其中2010年美國密歇根、俄亥俄和紐約等5個(gè)州暴發(fā)的因食用被污染長葉生菜的重大食源性疾病事件的病原體也被認(rèn)定為大腸埃希氏菌O145[7]。

大腸埃希氏菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中O抗原是血清分型的基礎(chǔ)，共有一百七十多種[1]。由于分型用血清售價(jià)高、保質(zhì)期短，加上大腸埃希氏菌污染較普遍等特點(diǎn)，導(dǎo)致傳統(tǒng)分離、生化和血清分型鑒定方法存在檢測時(shí)間長、鑒定過程工作量大、檢測費(fèi)用居高不下等無法避免的缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中大大受限。O抗原由O抗原基因簇編碼，隨著對(duì)O抗原基因簇編碼基因研究的深入，以為PCR代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)新技術(shù)以其無可取代的優(yōu)勢(shì)被廣泛用于微生物檢測領(lǐng)域，也同樣被成功應(yīng)用大腸埃希氏菌O145血清型的檢測[8～11]。Taqman探針熒光PCR法是利用PCR反應(yīng)延伸過程中，Taq酶的5’核酸外切酶活性切割與靶序列結(jié)合的寡核苷酸探針，使得Taqman探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化的一種 PCR技術(shù)，與 SYBR green染料熒光 PCR法以及傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增加電泳檢測相比，Taqman探針的引入提升了反應(yīng)的特異性，該技術(shù)實(shí)行完全閉管式操作，不僅避免了傳統(tǒng)PCR開蓋引起的產(chǎn)物污染問題，減少了假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)，還避免了對(duì)環(huán)境的污染[12]，擴(kuò)增反應(yīng)全程動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)可見，是一種高特異性、高靈敏度、快速高通量的現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)，本世紀(jì)以來已被逐步推廣應(yīng)用于生物學(xué)研究、食品檢測、環(huán)境檢測、醫(yī)學(xué)檢測與診斷等行業(yè)。

本研究以大腸埃希氏菌O145為檢測對(duì)象針對(duì)其O抗原基因簇的wckD基因建立了Taqman熒光PCR檢測方法，驗(yàn)證了方法的靈敏度和特異性，并將其用于食品中大腸埃希氏菌O145的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

28株大腸埃希氏菌細(xì)菌和20株非大腸埃希氏菌細(xì)菌，分別來源于美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，英國國家典型菌株保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC），中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collection，CMCC)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡稱CCTCC)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局和珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains used in theexperiment

大腸埃希氏菌 A T C C 4 3 8 9 3 O 1 2 4 金黃色葡萄球菌 C M C C(B)2 6 0 0 3 /大腸埃希氏菌 A T C C 3 5 1 5 0 O 1 5 7 表皮葡萄球菌 C M C C(B)2 6 0 6 9 /大腸埃希氏菌 A T C C 7 0 0 0 7 8 / 藤黃微球菌 C M C C(B)2 8 0 0 1 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 0 7 9 8 / 銅綠假單孢菌 C C T C C A B 9 1 0 9 5 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 3 7 0 6 / 肺炎克雷伯氏菌 C M C C 4 6 1 0 1 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 5 5 9 7 / 腸炎沙門氏菌 C C T C C A B 9 4 0 1 8 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 1 2 2 9 / 福氏志賀氏菌 C M C C 5 1 5 7 1 /大腸埃希氏菌 N C T C 1 2 9 0 0 O 1 5 7 宋內(nèi)氏志賀氏菌 C M C C 5 1 3 3 4 /大腸埃希氏菌 C C T C C A B 2 0 0 0 5 1 O 1 5 7 副溶血性弧菌 A T C C 1 7 8 0 2 /大腸埃希氏菌 C C T C C A B 2 0 0 0 6 8 / 乙型溶血性鏈球菌 C M C C(B) 3 2 2 1 0 /大腸埃希氏菌 C M C C(B)4 4 1 0 2 / 枯草芽孢桿菌 C M C C(B)6 3 5 0 1 /大腸埃希氏菌 E C O 4 O 4 產(chǎn)氣莢膜梭菌 A T C C 1 3 1 2 4 /大腸埃希氏菌 E C O 1 0 4 O 1 0 4 糞腸球菌 C M C C(B) 3 2 2 2 0 /大腸埃希氏菌 E C O 1 5 7-1 O 1 5 7 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 C M C C(B) 5 2 2 0 4 /大腸埃希氏菌 E C O 1 5 7-2 O 1 5 7 變形桿菌 C M C C(B) 4 9 0 2 7 /

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑與溶液

離子柱型DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；DEPC水：生工生物工程（上海）股份有限公司；EC肉湯：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒、DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；DNA裂解液：珠?？频巧锕こ逃邢薰尽?/p>

1.1.3 引物和探針

在NCBI網(wǎng)站上檢索的不同菌株來源的大腸埃希氏菌O145的O抗原基因簇序列（GenBank序列號(hào)：AY863412、AY647260、 JN850039～JN850044），DNAMAN軟件比對(duì)，根據(jù)wckD基因高保守區(qū)的基因序列，通過Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)引物、Taqman探針。上游引物：5′-CTGTGATTCAGAACTAGAAG-3′；下游引物：5′-GCCACTACTACATTGTCA-3′；探針：5′-FAM-TCACGAATAACTACAGAACCAGAACCABHQ1-3′：上海英濰捷基公司合成。引物對(duì)和探針分別用DEPC水稀釋至儲(chǔ)備濃度100 μmol/L，-20 ℃保存，臨用時(shí)用DEPC水稀釋至工作濃度10 μmol/L。

1.1.4 食品樣品

畜肉196份、水產(chǎn)品46份、禽產(chǎn)品43份、可生食蔬菜54份：部分購自珠海本地集貿(mào)市場、超市；部分為本單位受理的委托檢驗(yàn)樣品。

1.2 主要儀器設(shè)備

NanoDropND-1000核酸濃度測定儀：美國賽默飛世爾公司；Minispin Plus離心機(jī)：德國艾本德公司；7500Fast熒光PCR儀：美國美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；AES easyMIX拍擊式均質(zhì)器：法國生物梅里埃公司；1565-2E恒溫培養(yǎng)箱，美國SHELLAB公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌 DNA模板的制備、濃度和純度測定

各菌株指數(shù)生長期新鮮培養(yǎng)物，用DNA提取試劑盒并按其說明提取制備DNA模板。核酸濃度測定儀測定出 DNA濃度與純度，OD260/OD280比值在1.6～1.9之間表明DNA純度較高，可用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：總體積 25 μL：Premix（2×）12.5 μL、引物對(duì)（10 μmol/L）1 μL、探針（10 μmol/L）1 μL、50×ROX Reference Dye I（I50×）0.5 μL、DEPC水8 μL、模板2 μL。每個(gè)反應(yīng)管均設(shè)置雙平行管?？瞻讓?duì)照以DEPC水代替模板。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，收集熒光，40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 特異性試驗(yàn)

各菌株DNA模板均按1.3.2進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證熒光PCR方法的特異性。

1.3.4 靈敏度試驗(yàn)

將大腸埃希氏菌O145的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7濃度，將DNA原液和核酸梯度稀釋液相同條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，確定熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.5 食品樣品的檢測

1.3.5.1 樣品制備和均質(zhì)

無菌稱取樣品25 g至有濾網(wǎng)的拍擊式均質(zhì)袋，加入225 mL無菌EC肉湯，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min。

1.3.5.2 樣品增菌

36 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3.5.3 樣品核酸提取

拍擊式均質(zhì)袋中取1 mL增菌液的濾過液，12000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加50 μL DNA裂解液，100 ℃金屬浴5 min，冷卻，12000 r/min離心5 min，上清用于熒光PCR檢測。

1.3.5.4 樣品熒光PCR檢測

同1.3.2中的條件進(jìn)行熒光PCR檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 Taqman探針熒光PCR檢測方法的建立

圖1 大腸埃希氏菌O145擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification plot of Escherichia coli O145

選擇大腸埃希氏菌O145的O抗原基因簇中wckD基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)引物、探針，通過反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了大腸埃希氏菌 O145的 Taqman探針熒光PCR檢測方法，大腸埃希氏菌O145菌株呈現(xiàn)出典型的熒光PCR擴(kuò)增曲線（見圖1），表明該反應(yīng)體系適用于大腸埃希氏菌O145的擴(kuò)增。

2.2 特異性試驗(yàn)

圖2 大腸埃希氏菌O145特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plot of specificity test of Escherichia coli O145

表1所列菌株用建立的Taqman探針熒光PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證方法的特異性，驗(yàn)證結(jié)果表明，僅大腸埃希氏菌O145菌株呈現(xiàn)出典型的熒光PCR擴(kuò)增曲線（見圖2），其它27株大腸埃希氏菌和20株非大腸埃希氏菌菌株的DNA樣本的檢測結(jié)果均為陰性。據(jù)此可判斷，本研究中針對(duì)大腸埃希氏菌O145的引物和Taqman探針特異性良好。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

圖3 大腸埃希氏菌O145靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification plot of sensitivity test of Escherichia coli O145

核酸濃度測定儀測定大腸埃希氏菌O145菌株的DNA濃度為33 ng/μL，菌株DNA原液和10倍遞增稀釋液擴(kuò)增曲線見圖3，每個(gè)反應(yīng)模板加入量為2 μL，圖中可見大腸埃希氏菌O145菌株的DNA原液（66 ng/反應(yīng)）、10-1稀釋液（6.6 ng/反應(yīng)）、10-2稀釋液（660 pg/反應(yīng)）、10-3稀釋液（66 pg/反應(yīng)）、10-4稀釋液（6.6 pg/反應(yīng)）、10-5稀釋液（0.66 pg/反應(yīng)）均有明顯擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，且各稀釋度平行試驗(yàn)重復(fù)性良好，因此可計(jì)算、判斷本方法檢測靈敏度為0.66 pg/反應(yīng)，大腸埃希氏菌基因組為0.004 pg/拷貝，靈敏度折算即165拷貝/反應(yīng)。

2.4 食品樣品污染調(diào)查

所檢339份食品樣品中檢出大腸埃希氏菌 O145陽性31份，陽性率9.1%，各類型樣品陽性率見表2。由表2結(jié)合樣品來源分析可知，生畜肉均為購自市場和超市的生豬肉和生牛肉，未經(jīng)過食品深加工，196份樣品檢出樣品大腸埃希氏菌O145陽性樣品27份，陽性率最高達(dá)13.8%；水產(chǎn)品、禽產(chǎn)品和可生食蔬菜多數(shù)為經(jīng)過加工的產(chǎn)品，特別是部分水產(chǎn)品和禽產(chǎn)品為深度加工的鮮、凍產(chǎn)品，陽性率較低，46份水產(chǎn)品、禽產(chǎn)品43份各檢出樣品大腸埃希氏菌O145陽性1份，陽性率分別為2.2%和2.3%；54份可生食蔬菜檢出大腸埃希氏菌O145陽性2份，陽性率為3.7%。檢測結(jié)果表，食品基質(zhì)營養(yǎng)越豐富、未經(jīng)過加工或只經(jīng)過初加工的產(chǎn)品陽性率相對(duì)較高，經(jīng)深加工的產(chǎn)品陽性率相對(duì)較低，樣品檢出陽性率與食品基質(zhì)類型及其加工程度存在一定相關(guān)性。

表2 食品樣品污染調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statisticsanalysis of food samples pollution survey

3 結(jié)論

3.1 Taqman探針熒光PCR技術(shù)具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，與SYBR green染料熒光PCR法以及傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增加電泳檢測相比，Taqman探針的引入提升了反應(yīng)的特異性，使其特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高，擴(kuò)增反應(yīng)全程動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)可見，PCR擴(kuò)增過程無需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，完全閉管式操作，可有效解決PCR產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性等問題，已成為檢測領(lǐng)域重要的快速高通量檢測手段。

3.2 本研究中設(shè)計(jì)的引物和Taqman探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸埃希氏菌 O145菌株的特異性擴(kuò)增，其它 27株非O145大腸埃希氏菌和20株非大腸埃希氏菌細(xì)菌菌株均無擴(kuò)增，說明引物和探針具有高度特異性。為確定該方法檢測靈敏度，對(duì)已知濃度的大腸埃希氏菌O145核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，結(jié)果顯示，原始菌液稀釋至10-5時(shí)仍能檢出，表明本方法對(duì)檢測靈敏度為0.66 pg/反應(yīng)（即165拷貝/反應(yīng)）。

3.3 食品中食源性致病菌往往含量不高，食品樣品采用EC肉湯增菌培養(yǎng)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行檢測，其原理是利用細(xì)菌在指數(shù)增長期遵循的數(shù)學(xué)指數(shù)模型以提高檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度和可靠性，便于簡化DNA提取步驟、減少非活致病菌的干擾，避免死的目標(biāo)菌導(dǎo)致的假陽性產(chǎn)生，樣品增菌并用增菌液的濾過液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測可避免肉類等復(fù)雜基質(zhì)可能導(dǎo)致的假陰性產(chǎn)生。食品樣品DNA的提取采用的熱裂解法操作簡便、快速、經(jīng)濟(jì)節(jié)約，便于大批量樣品的檢測。

3.4 本研究建立的Taqman探針熒光PCR方法全過程（包括樣品增菌、核酸提取、熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)和結(jié)果分析）用于食品中大腸埃希氏菌O145的檢測僅需約28 h，樣品增菌后的核酸提取和檢測所需時(shí)間僅2 h～3 h，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法增菌后分離、生化和血清鑒定至少需3 d～7 d相比顯著縮短了檢測時(shí)間。綜上所述，方法的特異性、靈敏度和實(shí)際樣品污染調(diào)查試驗(yàn)表明，本研究建立的熒光PCR快速檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、操作簡便，可用于食品中大腸埃希氏菌O145的快速檢測。

[1]Don J Brenner, Noel R Krieg, James T Staley, et al. Bergey's Manual? of Systematic Bacteriology：Volume2：The Proteobacteria, PartB：The Gammaproteobacteria [M]. New York：Springer, 2005

[2]GB 4789.6-2016,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)[S]GB 4789.6-2016, National Food safety Standard Microbiological Examination of Food-Examination of Diarrheogenic Escherichia coli. [S]

[3]Kaftyreva L A, Makarova M A, Konovalova T A, et al.Characteristics of enterohemorrhagic Escherichia coli O145：H28 isolated from a patient with hemolytic-uremic syndrome [J]. Zhurnal Mikrobiologii Epidemiologii I Immunobiologii, 2013, 5：100-104

[4]Rumi M V, Irino K, Deza N, et al. First isolation in Argentina of a highly virulent Shiga toxin-producing Escherichia coli O145：NM from a domestic cat [J]. Journal of Infection in Developing Countries, 2012, 6(4)：358-363

[5]Sonntag A K, Prager R, Bielaszewska M, et al. Phenotypic and genotypic analyses of enterohemorrhagic Escherichia coli O145 strains from patients in Germany [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(3)：954-962

[6]De Schrijver K, G Buvens, B Posse, et al. Outbreak of verocytotoxin-producing E. coli O145 and O26 infections associated with the consumption of icecream produced at a farm, Belgium [J]. Euro. Surveillance, 2008, 13(7)：61-64

[7]Taylor E V, Nguyen T A, Machesky K D, et al. Multistate outbreak of Escherichia coli O145 infections associated with romaine lettuce consumption, 2010 [J]. Journal of Protection,2013, 76(6)：939-944

[8]Fratamico P M, Deb Roy C, Miyamoto T, et al. PCR detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O145 in food by targeting genes in the E.coli O145 O-antigen gene cluster and the shiga toxin 1 and shiga toxin 2 genes [J].Foodborne Pathogens & Disease, 2009, 6(5)：605-611

[9]Cooper K K, Mandrell R E, Louie J W. Comparative genomics of enterohemorrhagic Escherichia coli O145：H28 demonstrates a common evolutionary lineage with Escherichia coli O157：H7 [J]. BMC Genomics, 2014, 15：17

[10]Perelle S, Dilasser F, Grout J, et al. Development of a 5'-nuclease PCR assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli O145 based on the identification of an'O-island 29' homologue [J]. Journal of Apply Microbiology,2003, 94(4)：587-594

[11]Feng L, Senchenkova S N, Tao J, et al. Structural and genetic characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O145O antigen and development of an O145 serogroupspecific PCR assay [J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(2)：758-764

[12]姜文燦,岳素文,江洪,等.TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用和研究進(jìn)展.[J]臨床檢驗(yàn)雜志,2015,4(1)：797-805 JIANG Wen-can, YUE Su-wen, JIANG Hong, et al.Applicationand research progressof TaqMan probe real time PCR [J]. Clinical Laboratory Journal, 2015, 4(1)：797-805