顧文芬，曾凡逵，程錦春

（1.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 730030）（2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所環(huán)境材料與生態(tài)化學(xué)研究發(fā)展中心，甘肅蘭州 730000）

馬鈴薯蛋白功能特性和營養(yǎng)價(jià)值都非常高，被認(rèn)為是最好植物蛋白之一[1～5]。馬鈴薯蛋白具有良好起泡和乳化性質(zhì)[6～9]。如果回收后的馬鈴薯蛋白具有天然活性、品質(zhì)高，在食品工業(yè)當(dāng)中具有非常好應(yīng)用前景[10]。Patatin蛋白是馬鈴薯當(dāng)中的主要蛋白，大約占馬鈴薯塊莖中總蛋白的40%，具有很好的功能特性，可替代動(dòng)物蛋白作為紅酒澄清劑以降低過敏反應(yīng)[11]。Patatin蛋白的分子量為40～45 ku，它的EAAI（必需氨基酸指數(shù)）為89%，與很多動(dòng)物蛋白和植物蛋白相比都要高[12,13]。其余蛋白的分子量為19～22 ku[13,14]。從氨基酸組成來看，馬鈴薯蛋白的營養(yǎng)價(jià)值可以和雞蛋蛋白相媲美[1～3,5]。

不同的技術(shù)從馬鈴薯淀粉加工分離汁水中回收蛋白都有相關(guān)報(bào)道，如傳統(tǒng)濃縮、熱絮凝、沉淀、羧甲基纖維素離子交換、擴(kuò)張床吸附離子交換和超濾等。前四種技術(shù)蛋白質(zhì)回收率高但回收的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，因?yàn)榛厥者^程中使用了加熱和加酸[4,15～17]。熱絮凝回收馬鈴薯蛋白已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，但回收的馬鈴薯蛋白只能用作動(dòng)物飼料，因?yàn)槠湓谥行詐H條件下不溶于水[4,5,18～21]。

膜分離技術(shù)已經(jīng)非常成熟，在乳品加工行業(yè)以及商業(yè)化應(yīng)用已經(jīng)有很多年。微濾（Microfiltration，MF）、超濾（Ultrafiltration，UF）和反滲透（Reverse osmosis，RO）在乳品工業(yè)中廣泛應(yīng)用分離不同的組分如酪蛋白和乳清蛋白。UF在苜蓿蛋白分離中進(jìn)行應(yīng)用[22]，超濾對(duì)于分離糖、有毒物質(zhì)、多酚類物質(zhì)和其他小分子量物質(zhì)等雜質(zhì)的效果非常好。RO在馬鈴薯淀粉加工廢水處理方面也已經(jīng)進(jìn)行了應(yīng)用[23～25]。

本研究的目的是分析膜分離技術(shù)在馬鈴薯蛋白回收中的應(yīng)用：分析了膜通量，采用超濾膜對(duì)馬鈴薯淀粉加工分離汁水當(dāng)中的蛋白進(jìn)行分離濃縮，通過SDS-PAGE對(duì)回收蛋白的組成進(jìn)行分析，并檢測(cè)回收蛋白的胰蛋白酶抑制劑的活力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄭商薯10號(hào)馬鈴薯，由鄭州市蔬菜研究所提供；Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽，純度≥98%，Sigma，貨號(hào)：B3133-250 MG，其余化學(xué)試劑均為分析純；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SS260-A多功能食物攪拌器，佛山市沃爾姆斯電器有限公司；Exceed-Cb-20艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；5810 R離心機(jī)，S-4-104水平轉(zhuǎn)子，德國Eppendorf公司；賽多利斯超濾膜包，分子截留量分別為10000 MWCO和30000 MWCO（Molecular Weight Cut Off），德國賽多利斯公司；LongerPump BT300-2J型恒流泵，泵頭為YZ1515X，管子為LongerPump 25#。DNM9602G酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；JDG-0.2型真空冷凍干燥實(shí)驗(yàn)機(jī)，蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司。

1.3 馬鈴薯蛋白溶液制備

取3125 g鄭商薯10號(hào)馬鈴薯，洗凈切塊，用含20 mM亞硫酸氫鈉（6.503 g）和10 mM檸檬酸鈉（6 g）的RO水3125 mL勻漿和沖洗，過篩用的篩網(wǎng)為120目（孔徑0.125 mm）。馬鈴薯淀粉、蛋白和水溶性的營養(yǎng)物質(zhì)穿過篩網(wǎng)，用Eppendorf 5810 R離心機(jī)3900 r/min離心5 min分離淀粉，共得到上清液馬鈴薯蛋白溶液3410 mL，該樣品編號(hào)為1。

1.4 膜通量測(cè)定

分別用1000 mL RO水和1000 mL馬鈴薯蛋白溶液測(cè)試超濾膜在不同壓強(qiáng)下的膜通量，壓強(qiáng)分別為 1 bar、1.5 bar、2 bar、2.5 bar和 3 bar，泵 Longer Pump BT300-2J，泵頭YZ1515X，100 r/min，管子為Longer Pump 25#。

1.5 超濾濃縮

取500 mL馬鈴薯汁水（樣品1），分別用兩個(gè)不同的超濾膜包進(jìn)行濃縮，將馬鈴薯粗蛋白溶液濃縮到100 mL（透過液為 400 mL），泵 Longer Pump BT300-2J，泵頭YZ1515X，100 r/min，管子為Longer Pump 25#。10000 MWCO膜包的濃縮液記為樣品2，透過液記為樣品3，添加400 mL水重復(fù)濃縮至100 mL的透過液記為樣品4，再一次添加400 mL水濃縮至100 mL的透過液記為樣品5，最終濃縮液即為樣品6。30000 MWCO膜包的濃縮液記為樣品7，透過液記為樣品8，添加400 mL水重復(fù)濃縮至100 mL的透過液記為樣品9，再一次添加400 mL水濃縮至100 mL的透過液記為樣品10，最終濃縮液即為樣品11。

1.6 膜包清洗與保存

先用1000 mL RO水清洗超濾膜，再用1000 mL 20 mM NaOH溶液循環(huán)清洗超濾膜30 min，然后用2000 mL RO水將膜包里的NaOH溶液清洗出來。在膜通量下降時(shí)采用該方法清洗，保存前同樣需要按照上述步驟清洗并灌滿20%的酒精，防止霉菌生長。

1.7 蛋白濃度測(cè)定

用 BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行分析，將 2000 μg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋成1000、500、250和125 μg/mL。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50：1）配制適量BCA工作液。將25 μL標(biāo)準(zhǔn)品和合適濃度范圍的樣品分別加入96孔板的微孔中，各加200 μL BCA工作液，充分混勻，37 ℃孵育30 min后550 nm測(cè)定吸光值。

1.8 胰蛋白酶抑制劑活力測(cè)定

參考曾凡逵等[26]報(bào)道的方法對(duì)馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑活力進(jìn)行測(cè)定，通過抑制劑抑制胰蛋白酶活力的測(cè)定，采用化學(xué)合成物質(zhì)Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽做底物，該底物被胰蛋白酶水解以后會(huì)生成黃顏色的對(duì)硝基苯胺，因此可以采用分光光度計(jì)測(cè)定，檢測(cè)波長為410 nm。胰蛋白酶抑制劑的活力檢測(cè)結(jié)果表達(dá)成被抑制的胰蛋白酶活力單位，一個(gè)蛋白酶活力單位定義為在檢測(cè)條件下吸光值每增加0.01。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用Microsoft Office Excel 2007數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行處理，并進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜通量分析

膜通量（或稱透過速率）是膜分離過程的一個(gè)重要工藝運(yùn)行參數(shù)，是指單位時(shí)間內(nèi)通過單位膜面積上的流體量，一般以m3/(m2·s)或L/(m2·h)表示。本文采用的膜通量單位為 L/m2·h·bar。

表1 兩個(gè)超濾膜包膜通量測(cè)試結(jié)果（L/m2·h·bar）Table 1 Membrane flux test results of the two ultrafiltration membrane packs (L/m2·h·bar)

Sartoruis VIVAFLOW200兩個(gè)超濾膜包的膜通量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，不管是10000 MWCO還是30000 MWCO，RO水的膜通量都比馬鈴薯汁水的膜通量高。膜通量隨著壓力升高是增加的，但由于采用的膜通量單位為 L/m2·h·bar，所以表1當(dāng)中看起來膜通量隨著壓力升高反而降低。另外還可以非常容易看出，不管在哪個(gè)壓力下，30000 MWCO的膜包膜通量比10000 MWCO的高，這是由于分子截留量大的膜包孔徑比較大，水和小分子量物質(zhì)更容易穿透。

在實(shí)際濃縮操作過程中，當(dāng)使用膜對(duì)蛋白溶液進(jìn)行濃縮時(shí)，隨著運(yùn)行時(shí)間延長，膜會(huì)發(fā)生污染，部分膜孔被堵塞，導(dǎo)致膜通量降低，因此發(fā)現(xiàn)膜通量明顯降低時(shí)，需要對(duì)膜進(jìn)行清洗以恢復(fù)膜通量。

2.2 蛋白含量測(cè)定結(jié)果

圖1 蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration

96孔板法BCA蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，125、250、500、1000和2000 μg/mL牛血清白蛋白濃度與對(duì)應(yīng)的 OD550吸光值相關(guān)性非常好，y=0.0002x+0.1565，R2=0.9991。

通過計(jì)算，初始馬鈴薯蛋白溶液（樣品 1）的蛋白濃度為16.05 mg/mL，膜包10000 MWCO濃縮液（樣品2）的蛋白濃度為69.88 mg/mL，蛋白質(zhì)的回收率為87.08%。濃縮比為5的情況下，分子截留量為10000 MWCO的超濾膜包的濃縮液蛋白濃度增加到原來的4.35倍。再經(jīng)過2次滲濾，最終濃縮液（樣品6）的蛋白濃度為27.13 mg/mL（體積調(diào)整成為200 mL），蛋白質(zhì)的回收率為67.61%。10000 MWCO膜包三次透過液（樣品3、4和5）的蛋白濃度分別為5.87、0.94和0.22 mg/mL，呈下降趨勢(shì)，說明超濾膜包性能良好，蛋白檢測(cè)方法可靠。

膜包30000 MWCO濃縮液（樣品7）的蛋白濃度為62.63 mg/mL，蛋白質(zhì)的回收率為78.04%。濃縮比為5的情況下，分子截留量為30000 MWCO的超濾膜包的濃縮液蛋白濃度增加到原來的3.90倍?；厥章氏鄬?duì)于膜包10000 MWCO稍低，這是由于膜包30000 MWCO的孔徑大，部分分子量較小的馬鈴薯蛋白穿過膜包進(jìn)入透過液造成的。再經(jīng)過2次滲濾之后，最終濃縮液（樣品11）的蛋白濃度為30.63 mg/mL（體積調(diào)整成為 165 mL），蛋白質(zhì)的回收率為 62.98%。10000 MWCO膜包三次透過液（樣品8、9和10）的蛋白濃度分別為6.53、1.38和0.47 mg/mL，同樣呈下降趨勢(shì)。

表2 樣品當(dāng)中蛋白濃度測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of protein concentration in samples

2.3 SDS-PAGE

圖2 SDS-PAGE樣品結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of samples

馬鈴薯蛋白粗溶液、濃縮液和透過液的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示，樣品3、4和5為10000 MWCO膜包三次透過液，樣品8、9和10為30000 MWCO膜包三次透過液，由于蛋白濃度低，因此這6欄的電泳圖譜上均看不到條帶?？捡R斯亮藍(lán)染色靈敏度為每條帶0.1～1 μg[27]，上樣量為20 μL，因此理論上蛋白濃度低于0.05 mg/mL不會(huì)出現(xiàn)條帶。另外一種看不到條帶的原因可能是一些＜10 ku的小分子量蛋白質(zhì)電泳過程中跑出了凝膠，分析這些小分子量的蛋白質(zhì)需要用高濃度的膠。

從圖2還可以看出，樣品2明顯比樣品1的濃度高，這是由于超濾濃縮的結(jié)果。樣品6比樣品2濃度低，一方面是由于樣品6的體積是樣品1的2倍，另一方面經(jīng)過2次滲濾以后，部分蛋白分子進(jìn)入了透過液。兩個(gè)超濾膜包對(duì)馬鈴薯蛋白的濃縮效果除了蛋白回收率有差異（見2.3節(jié)），在蛋白組成方面沒有什么差異，馬鈴薯蛋白主要由Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑組成，圖 2當(dāng)中分子量大約 40 ku的蛋白條帶即為Patatin蛋白，分子量低于40 ku的蛋白質(zhì)均為蛋白酶抑制劑。由于孔徑大一點(diǎn)的30000 MWCO膜包比孔徑小一點(diǎn)的10000 MWCO膜包膜通量大，水和小分子量物質(zhì)更容易穿透，生產(chǎn)效率高，因此選用 30000 MWCO膜包更為合適。

2.4 胰蛋白酶抑制劑活力分析

馬鈴薯粗蛋白溶液和兩個(gè)超濾膜包濃縮的蛋白溶液胰蛋白酶抑制劑活力測(cè)定結(jié)果見表 3，依據(jù)參考文獻(xiàn)采用了三個(gè)不同濃度梯度進(jìn)行分析，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[26]，隨著蛋白含量增加酶活檢測(cè)結(jié)果呈降低的趨勢(shì)，“真實(shí)”酶活是根據(jù)三個(gè)濃度梯度的檢測(cè)結(jié)果通過偏最小二乘法繪制回歸曲線的截距。馬鈴薯粗蛋白溶液的“真實(shí)”酶活為79.52 TIUs/mg蛋白，分子截留量為10000 MWCO的膜包和分子截留量為30000 MWCO的膜包最終濃縮液的胰蛋白酶抑制劑的活力分別為124.38和95.25 TIUs/mg蛋白。

表3中不同樣品之間“真實(shí)”酶活之間的差異，可能的原因?yàn)椋海?）馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑包含很多不同的組分（圖2），雖然不同的組分對(duì)胰蛋白酶均有抑制活力，但活力大小存在差異，分子量較小的胰蛋白酶抑制劑活力較低，通過膜分離以后小分子量的蛋白酶抑制劑被分離出去，從而提高了蛋白溶液的整體抑制活力[28]。（2）另一方面，當(dāng)胰蛋白酶抑制劑活力較高的組分被分離出去以后，蛋白溶液的整體酶活就會(huì)降低。

表3 胰蛋白酶抑制劑活力分析Table 3 Analysis of trypsin inhibitor activity

注：a根據(jù)胰蛋白酶抑制劑活力單位定義，殘留酶活=OD410 nm×100；b 2 mL 20 μg/mL胰蛋白酶的活力為35.80 TU，被抑制的酶活=35.80-殘留酶活；c參考文獻(xiàn)[26,29]。

3 結(jié)論

分子截留量分別為 10000 MWCO和 30000 MWCO兩個(gè)超濾膜包的蛋白質(zhì)回收率分別為67.61%和62.98%，回收的蛋白胰蛋白酶抑制劑的活力分別為124.38和95.25 TIUs/mg蛋白。兩個(gè)超濾膜包回收的蛋白質(zhì)均包含patatin蛋白和蛋白酶抑制劑組分，30000 MWCO的超濾膜包濃縮效率高，更加適合于回收馬鈴薯總蛋白。超濾法適用于從馬鈴薯淀粉加工分離汁水中回收天然活性蛋白質(zhì)。

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