王寧，林小翠，王文君

（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌 330045）

黃金茶，學名柳葉臘梅(Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu.)，別名山臘梅，浙南又稱石涼茶，香風茶，巖馬桑，茅山茶食，屬真蕨目、為臘梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(Chimonanthus Lindl.)半常綠灌木植物，主要分布于安徽南部、湖北、湖南、浙江和江西等地[1]。山臘梅中含有揮發(fā)油、生物堿、黃酮、香豆素、萜類、微量元素、維生素和18種礦物質等天然活性成分[2,3]，因而具有降血糖[4]、免疫調節(jié)[5]、抗腫瘤[6]、消脂降壓和預防心腦血管疾病等作用[7]。20世紀 70年代起，山蠟梅葉制成的制劑有山蠟梅葉顆粒、山蠟梅葉片、山蠟梅葉膠囊、山蠟梅清感茶和脾胃舒膠囊等各種制劑均已進入市場，其使用量逐年增加，也是畬族群眾最常用的畬藥之一[2,8]。山蠟梅葉因能祛風解表；芳香化濕；可治療流感，中暑，慢性支氣管炎等癥而被《中華本草》收錄[8]，并在2014年經(jīng)國家衛(wèi)計委批準成為藥食同源的新食品原料之一。

黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結構的化合物，實際上是以黃酮為母核衍生的一類黃色色素，即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，其在植物中主體部分與糖結合成苷類，小部分以苷元形式存在，具有抗心律失常、溶解血栓[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、鎮(zhèn)痛和降血脂等作用[12]。如馬瑩娟等[13]證明柿葉黃酮類化合物能夠明顯改善亞急性衰老小鼠學習記憶能力，提高腦組織的抗氧化能力，降低腦內炎癥水平，具有延緩腦衰老的作用。黃酮類化合物具有很多功能活性，在到達人體各部位之前必然會經(jīng)過消化道，它與消化酶之間的相互作用將會成為今后研究的熱點。胰蛋白酶是存在于人和動物腸道中的一種重要的消化酶，并且是所有胰臟蛋白酶原的共同激活劑[14]。正常情況下胰蛋白酶在血液中的含量非常低，但是胰腺炎、肺氣腫、癌癥及各種腦血管等疾病患者體內都存在過量的胰蛋白酶，現(xiàn)代醫(yī)學證明，胰蛋白酶抑制劑對急慢性胰腺炎、肺氣腫和出血性休克等疾病有一定的療效[15]。趙紅輝等[16]證明二氫楊梅素的添加量為胰蛋白酶的44倍（摩爾比）時，對胰蛋白酶的催化活性抑制率達到34.8%。植物黃酮是一類潛在的類胰蛋白酶抑制劑；胰蛋白酶既是消化酶，也對機體的新陳代謝起著至關重要的調節(jié)作用。初步探究黃金茶中的黃酮對胰蛋白酶的抑制作用，對于臨床應用、新藥設計具有一定的意義。

近年來，超聲技術普遍用于提取植物中天然活性成分，如黃酮[16]、多酚[18]、多糖[19]、氨基酸[20]和果膠[21]等，該法具有耗時短、節(jié)省溶劑和降低能源消耗的優(yōu)點；同時可提高化學動力學、溶解度以及試驗的再現(xiàn)性[22]。盛丹丹等通過正交試驗優(yōu)化超聲提取黃金茶中總黃酮的工藝[23]。與正交和均勻設計相比，Box-Behnken設計可以評價指標和因素間的非線性關系，使用方便，條件預測性好，對實驗影響因素的研究較為全面[24]。

本文以黃金茶為原材料，在單因素和響應面實驗設計的基礎上對黃金茶中的總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，旨在獲得最佳的工藝參數(shù)，為黃金茶的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。同時初步探究黃金茶總黃酮經(jīng)聚酰胺樹脂，30%乙醇洗脫液純化后的產(chǎn)物對胰蛋白酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃金茶，采自浙江麗水，粉碎后過60目篩備用；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇，均為國產(chǎn)分析純；聚酰胺（60~80目），上海摩速科學器材有限公司；蘆丁標準品，成都曼思特生物科技有限公司；苯甲酰精胺酰對硝基苯胺（BApNA）、胰蛋白酶、Tris.cl(pH=7.4)，購自北京索萊寶有限公司；冰醋酸、二甲基亞砜（DMSO），西隴科學股份有限公司。

GPX-9248A干燥箱/培養(yǎng)箱(兩用)，上海躍進醫(yī)療器械廠；AUY120型電子天平，日本島津有限公司；V-5600可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；M2型酶標儀，美國Molecular Device公司；Scientz-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司HH-60；數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱，常州國華電器有限公司；FLB-100型萬能高速粉碎機，上海菲力博食品機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

將黃金茶葉子用微型植物試樣粉碎機粉碎，過60目篩備用。

將最優(yōu)工藝提取出的黃酮過聚酰胺樹脂純化，用30%的乙醇洗脫，旋蒸，并冷凍干燥，配制成一系列濃度的樣品溶液。

1.2.2 總黃酮含量的測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線制備

根據(jù)參考文獻[25,26]，精確稱取60 ℃下烘干至恒重的蘆丁標準品10 mg于小燒杯中，加一定70%的乙醇溶解，轉移到25 mL容量瓶中，搖勻并定容，即為0.4 mg/mL的標準溶液。精確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的標準溶液，分別置于6個25 mL容量瓶中，加5%的亞硝酸鈉0.3 mL，靜置6 min，再加10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，靜置6 min，最后加4%的氫氧化鈉溶液4 mL，用70%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后用可見分光光度計在510 nm波長下測定吸光度，繪制蘆丁標準曲線。

1.2.2.2 黃金茶中總黃酮得率的測定

準確稱取黃金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，加入定量一定濃度的乙醇溶液，在一定超聲功率下，超聲一定時間，將提取液轉移至25 mL容量瓶中，用相應濃度的乙醇定容至刻度，搖勻，過濾。準確吸取1 mL濾液于25 mL容量瓶中，按照標準曲線中的顯色方法顯色，測定吸光度，根據(jù)回歸方程，計算總黃酮的含量，得出得率：

式中，c為0.25 g黃金茶粉末經(jīng)乙醇提取后所得黃酮的濃度（mg/mL）；m為黃金茶粉末的質量（g）。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 超聲時間對得率的影響

準確稱取黃金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，加入5 mL（1:20）的70%乙醇溶液，超聲功率為72 W，分別超聲10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，將提取液轉移至25 mL容量瓶中，用相應濃度的乙醇定容至刻度，搖勻，過濾。準確吸取1 mL濾液于25 mL容量瓶中，按照1.2.2的方法測定其得率，每組實驗重復3次。

1.2.3.2 超聲功率對得率的影響

準確稱取黃金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，加入70%的乙醇5 mL(即料液比1:20)，分別在功率36、54、72、90、108 W條件下，作用25 min，然后轉移至25 mL容量瓶，用相應濃度的乙醇定容，搖勻后過濾。準確吸取1 mL濾液于25 mL容量瓶中，按照1.2.2的方法測定其得率，每組實驗重復3次。

1.2.3.3 乙醇提取分數(shù)對得率的影響

準確稱取黃金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，分別加入體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液5 mL，作用25 min，然后轉移至25 mL容量瓶，用相應濃度的乙醇定容，搖勻后過濾。分別取濾液1 mL于25 mL容量瓶，按照1.2.2的方法測定其得率，每組實驗重復3次。

1.2.3.4 料液比對得率的影響

準確稱取黃金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，分別加入相應體積60%的乙醇溶液，使其料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，作用25 min，超聲功率為72 W，然后轉移至25 mL容量瓶，用相應濃度的乙醇定容，搖勻后過濾。分別取濾液 1 mL于25 mL容量瓶，按照1.2.2的方法測定其得率，每組實驗重復3次。

1.2.4 響應面實驗設計

由單因素實驗得到的結果，采用響應面法中的Box-Behnken的中心組合實驗，選擇對黃金茶總黃酮得率具有顯著影響的四個因素：超聲時間（A）、超聲功率（B）、乙醇體積分數(shù)（C）和料液比（D），采用四因素三水平的響應面實驗設計，見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計Table 1 Experimental design of Box-Behnken

1.2.5 純化后總黃酮對胰蛋白酶活性的影響

據(jù)參考文獻[27]，試驗方法略作調整。胰蛋白酶儲存液配制：稱取胰蛋白酶 6 mg，溶于 10 mL的Tris-HCl(pH=7.4)緩沖液，其摩爾濃度為1×10-6mol/L。底物配制（現(xiàn)配現(xiàn)用）：稱取13 mg的BApNA，溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO），其摩爾濃度為0.03 mol/L。配置33%的冰醋酸。

使用96孔板測定胰蛋白酶活性：先加入50 μL的Tris-HCl，然后加入50 μL的BApNA，再加入50 μL的樣品，37 ℃水浴10 min，加入80 μL的胰蛋白酶，37 ℃水浴10 min，期間不斷攪拌，最后加入33%的冰醋酸中止反應，并在410 nm處測定吸光度值，所有的試驗重復三次。

式中：為AEG樣品試驗組的吸光度值；ABCG為緩沖溶液代替酶的吸光度值；ANCG為緩沖溶液代替樣本的吸光度值；ABG為緩沖溶液代替酶和底物的吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用F檢驗對響應面實驗數(shù)據(jù)進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)分析軟件采用 Design Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rufin

蘆丁標準曲線的繪制以蘆丁標準溶液濃度為縱坐標，以吸光度值A為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線的散點圖，如圖 1，蘆丁標準曲線的回歸方程為y=0.1782x-0.0065，R2=0.996，表明蘆丁標準溶液在0.087~0.302 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 單因素分析

2.2.1 超聲時間對黃金茶總黃酮得率的影響

圖2 超聲時間對黃金茶總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

由圖2可得，超聲時間在10~25 min之間，黃金茶總黃酮的得率隨著超聲時間的延長而增加，在 25 min時得率達到最高；之后，總黃酮的得率隨著超聲時間而略微下降，可能是由于超聲波強烈的空化效應、機械振動、破碎作用，導致植物細胞膜破裂，細胞內其他物質如粘液的流出影響了提取效果；另一方面由于超聲波的熱效應，可能影響了黃酮類物質的穩(wěn)定性及黃酮類物質在溶劑中達到了飽和。因此，選擇超聲提取時間為20~30 min進行Box-Behnken實驗設計。

2.2.2 超聲功率對黃金茶總黃酮得率的影響

圖3 超聲功率對黃金茶總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic treatment power on total flavonoids yield

由圖3可得，當超聲功率小于72 W時，總黃酮得率隨著功率的增加快速提高，當功率超過72 W之后，其得率逐漸下降。這是因為超聲波可以使植物細胞壁形成較多的小孔，增強細胞膜的透性，利于胞內物質的溶出，但是功率過大會對黃酮類物質造成破壞，并且會增加能耗，增加提取成本[24]。因此，選擇超聲提取功率為54~90 W進行Box-Behnken實驗設計。

2.2.3 乙醇提取分數(shù)對黃金茶總黃酮得率的影響

圖4 乙醇濃度對黃金茶總黃酮得率的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由圖4可得，乙醇體積分數(shù)為40%~60%時，提取效果隨乙醇濃度的增加而增加，乙醇濃度超過60%時，總黃酮率得率下降。這可能是乙醇體積分數(shù)過高，黃金茶的色素、脂溶性物質和糖類及黏性物質等物質大量滲出，影響總黃酮提取，同時破壞了黃酮的穩(wěn)定性，導致了黃酮得率明顯下降[28]。因此，選擇乙醇體積分數(shù)為50%~70%進行Box-Behnken實驗設計。

2.2.4 料液比對黃金茶總黃酮得率的影響

圖5 料液比對黃金茶總黃酮得率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids

由圖5可得，料液比在1:10~1:25時，總黃酮得率逐漸升高，當料液比繼續(xù)增大時，總黃酮得率略有下降。當料液比比較小時，原料中的黃酮不能完全溶解到溶劑中，造成提取不完全、提取效率低。增大溶劑用量可以使內部的植物細胞和外部溶劑之間產(chǎn)生更大的濃度差，有利于黃酮的擴散更迅速地進行，因而具有較高的得率[29]。并且當料液比超過一定范圍時，可能使一些雜質溶出，與黃酮類物質競爭溶劑；或者雜質影響黃酮在溶劑中的溶解度?？紤]到節(jié)能減排、提高效率，選擇料液比為1:20~1:30進行Box-Behnken實驗設計。

采用Design-Expert 6.0.1軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，建立多元二次回歸模型：Y(%)=-43.055+1.534×A+1.544×C-0.054×D-0.057×A2-0.015×C2-0.019×D2+6.65×10-3×A×C+0.041×A×D，實驗因素對得率的影響不單單是線性關系，A、C、D、AC、AD對得率Y的影響非常顯著。表3回歸統(tǒng)計分析結果表明：模型的F=51.67，p<0.0001，表明實驗的二次模型是非常顯著的，具有統(tǒng)計學意義。失擬項 p值=0.0912>0.05，決定系數(shù)經(jīng)調整后R2=0.9354，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，即失擬項是不顯著的。結果顯示此模型與實際結果是非常擬合的，可以科學地表示影響得率的各因素與響應值之間的關系，可用該模型對黃金茶中總黃酮得率進行很好地分析和預測。由表 3可知，乙醇體積分數(shù) C（p<0.0001）極顯著，超聲時間A（p=0.002）高度顯著。二次項A2（p<0.0001），C2（p<0.0001）極顯著，D2（p=0.002）高度顯著，超聲時間和料液比的交互作用極顯著。由p值和F值可看出，各因素對黃金茶總黃酮得率影響的順序為：乙醇體積分數(shù)>超聲時間>料液比，超聲功率對總黃酮的得率無影響效果。兩因素的交互作用對總黃酮得率的影響極顯著的是：超聲時間和料液比的交互作用。

表2 Box-Behnken實驗設計及實驗數(shù)據(jù)結果Table 2 Box-Behnken experiment design and the experimental results

表3 二次回歸模型的方差分析結果Table 3 The variance analysis results of the quadratic regression model

2.3 響應面分析與優(yōu)化

響應曲面三維圖可以直觀地反映各因素對響應值的影響程度和因素間的交互作用強弱。等高線的形狀反映出交互作用影響效應的強弱與大小。

圖6 超聲時間與乙醇體積分數(shù)交互作用影響總黃酮得率的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of the interaction of ultrasonic time and ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids

圖7 超聲時間與料液比交互作用影響總黃酮得率的曲面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time on the yield of total flavonoids

橢圓形表示兩種因素的交互作用影響顯著，而圓形則表示兩種因素的交互作用影響不顯著[24]。比較圖6和圖7，發(fā)現(xiàn)超聲時間與料液比的交互作用比超聲時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用對得率的影響顯著。

如圖 6，可以看出超聲時間與乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的交互作用和等高線圖，二者的交互作用并不是很顯著。將乙醇體積分數(shù)固定在60%水平時，總黃酮得率隨著超聲時間的增加而先增加后降低，當超聲時間達25 min最大值后開始降低。在一定范圍內，總黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的升高而增加，從圖 6中也可以看出超聲時間對得率的曲線較為陡峭，說明在提取過程中超聲時間對得率的影響小于乙醇體積分數(shù)。

圖7表示超聲時間與料液比對黃金茶總黃酮得率的交互作用的影響效應。其等高線圖表明料液比與超聲時間的交互作用影響顯著。當把料液比固定在1:20水平上時，隨著超聲時間的增加，總黃酮得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在25 min左右，總黃酮得率達到最大點，隨著時間增加，而略有降低?？赡苡捎诔暡▽χ参锛毎ふ窳训睦奂幼饔?，粘液等雜質的溢出相應增加，使浸提液粘度增大，擴散速度降低，影響總黃酮的得率。

2.4 最佳工藝的預測和驗證

利用Design-expert 8.0.6的optimization功能，將總黃酮得率的Goal選項選擇為maximize，可得到最優(yōu)方案為：超聲時間為30 min、超聲功率為57.59 W、乙醇體積分數(shù)為 52.03%、料液比 1:23.85，黃金茶中總黃酮得率預測值為19.01%?？紤]實際操作過程的方便性，選擇提取工藝參數(shù)為：超聲時間為30 min，超聲功率為58 W、乙醇體積分數(shù)為52%、料液比1:24，在該工藝下進行三次平行實驗所得的總黃酮平均得率為 19.38%±0.12%，與預測值之間的相對誤差僅為1.9%，變異系數(shù)僅為0.6%，重復性非常好。該模型能較好的預測黃金茶總黃酮的得率。與耿敬章等[30]采用超聲協(xié)同復合酶提取山臘梅中的黃酮相比，該試驗中黃金茶總黃酮得率略高。究其原因，一方面是原料產(chǎn)地和品種不同，耿所用的山臘梅葉采自陜南植物園，文獻中[1]未見其在陜西廣泛分布；本文中所用材料購自浙江麗水，山臘梅在浙江境內分布較廣，可見山臘梅更喜浙江氣候和水土條件。另一方面山臘梅中的黃酮含量與其采摘月份有關，從5月到10月，黃酮類總含量呈現(xiàn)逐步遞增趨勢[31]。

2.5 純化后總黃酮對胰蛋白酶活性的測定結果

經(jīng)聚酰胺樹脂純化，30%的乙醇洗脫的總黃酮對胰蛋白酶的抑制活性隨著黃酮濃度的增加而增加，但是當黃酮濃度達到一定值后，其對胰蛋白酶的抑制率急劇下降（圖8）。

圖8 純化后黃酮對胰蛋白酶活性的影響Fig.8 The effect of the purified flavonoids on the activity of trypsin

純化后黃酮中可能含有蘆丁、槲皮素、山奈酚和木犀草素等[4,32]成分，許明等[15]發(fā)現(xiàn)異槲皮素、蘆丁對胰蛋白酶無明顯的抑制作用，而槲皮素對胰蛋白酶有較強的抑制作用，對胰蛋白酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.115 mol/L，最大抑制率為80%，對胰蛋白酶的抑制類型為非競爭與反競爭混合型。純化后黃金茶中的總黃酮對胰蛋白酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 1.04 mg/mL，當樣品濃度為 1.36 mg/mL，抑制率達到57.14%，隨后抑制率隨樣品濃度的增加而下降。這可能與黃金茶黃酮中各成分與胰蛋白酶的作用機制、作用位點以及抑制類型有關；并且樣品溶液是混合物，在抑制胰蛋白酶活性時各成分可能存在協(xié)同或者拮抗的作用。趙紅輝等[33]證明當類黃酮濃度為0.8 μmol時，槲皮素對胰蛋白酶活性的抑制率達到最大，為46%左右。類黃酮對胰蛋白酶活性的抑制率大小為槲皮素>木犀草素>山奈酚>蘆丁>芹菜素。筆者猜測總黃酮中對胰蛋白酶發(fā)揮主要抑制作用可能是槲皮素及其衍生物。

胰蛋白酶抑制劑主要來自動、植物和微生物中，目前研究比較多的是大豆中的胰蛋白酶抑制劑，程芬芬等[34]采用硫酸鈉鹽析法從大豆乳清廢水中選擇性回收大豆胰蛋白酶抑制劑，且以商品化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑為對照表征 STI的理化性質和界面性質。在臨床上，胰蛋白酶抑制劑用于保護胰臟、防止凝血異常、抑制腦血管通透性增高、治療腦水腫、抑制和治療癌癥，在農(nóng)業(yè)防蟲害方面也得到了應用[15]。分析黃金茶黃酮對胰蛋白酶的抑制能力，為其在食品、醫(yī)藥保健行業(yè)中更合理有效的利用提供依據(jù)。

3 結論

通過超聲波輔助乙醇溶劑提取黃金茶中的黃酮，用分光光度法測定總黃酮的含量，對超聲時間、超聲功率、乙醇體積分數(shù)、料液比各因素進行單因素分析及響應面優(yōu)化提取工藝，得出最優(yōu)條件為超聲時間為30 min，超聲功率為58 W、乙醇體積分數(shù)為52%、料液比 1:24，測得黃金茶總黃酮在此條件下的得率為19.38%±0.12%，實驗結果與預測結果較為吻合。該研究為黃金茶黃酮的提取工藝提供了理論依據(jù)，為提高黃金茶的綜合利用奠定了理論基礎。30%的乙醇洗脫的總黃酮對胰蛋白酶具有明顯的抑制作用，對胰蛋白酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為1.04 mg/mL，當樣品濃度為1.36 mg/mL，抑制率達到57.14%。鑒于黃金茶黃酮類化合物具有多種功能活性以及對胰蛋白酶的抑制性，可應用到保健食品、醫(yī)藥領域，為擴大黃金茶的開發(fā)利用提供基礎依據(jù)。

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