符群，李卉，王振宇，王路

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱 150090）

薇菜，學名紫萁（Osmunda japonica Thunb.），民間俗稱野雞頭、大巢菜、掃帚菜，古時名為“巢菜”或“野豌豆”。紫萁科（Osmundaceae）紫萁屬（Osmunda）多年生真蕨類植物。薇菜味苦性涼并富含多種蛋白質、氨基酸、維生素及微量元素[1]，薇菜整株均可入藥，具有抗菌、凝血、消炎退熱[2]、抗氧化、增進人體免疫力、抗癌防癌及延緩衰老的作用，其中促進細胞修復等功效明顯[3]。薇菜多年在國際上被稱為“無污染菜”，在日本更被譽為“野山菜之王”。

薇菜是我國重要的山珍和藥食同源植物，對薇菜最早的開發(fā)源于日本，20世紀80年代，我國學者對薇菜進行研究[4]，內(nèi)容多為生態(tài)學、培育學和初級加工工藝學，對薇菜高值化及深加工研究甚少。薇菜中富含黃酮類物質，李鳳霞[5]等人通過醇提法制備提取液中薇菜總黃酮含量為15.99%。黃酮是一類具有多種生物活性的物質[6]，目前黃酮類物質的制備有傳統(tǒng)的浸提回流法[7]、生物酶法[8]、超聲波輔助提取法[9]和微波輔助提取法[10]等，單一方法提取存在一定局限性，耗能高、時間久、提取不完全，多種方法聯(lián)合提取可以更高效、省時的提取出原料中黃酮類化合物。

本研究采用減壓-超聲波輔助溶劑法提取薇菜黃酮，減壓方法是通過真空泵抽取容器內(nèi)的空氣使提取物的氣壓維持在（0.08 MPa～-0.1 MPa）的范圍內(nèi)的方法。減壓條件下氣壓降低，容器內(nèi)的氣體變稀薄，溶劑分子之間的距離變大，打破溶劑之間分子鏈的能量隨之減少，從而使溶劑的沸點降低，同時通過超聲波的空化作用，分子之間的加速度加大了對分子鏈和細胞壁的作用，使得提取物可以有效流出。通過響應面法對其提取工藝條件進行了優(yōu)化，并且將提取的黃酮化合物與常壓條件下提取物的抗氧化活性進行對比分析，為薇菜深加工技術推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薇菜：采自吉林長白山。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸均為分析純；蘆丁，純度≥98%，Solarbio；DPPH，Sigma；ABTS，Sigma。

1.2 儀器與設備

KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-IIIG循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；ME204分析天平，Mettler-Toledo；UV-1810型紫外分光光度計，上海普析通用。

1.3 方法

1.3.1 薇菜原料的預處理

將干制薇菜原料置于 40 ℃烘箱中烘干至殘余水分含量小于3%，以超高速粉碎機粉碎過篩60目，按照料液比1：10加入石油醚，連續(xù)攪拌2 h脫脂脫色，揮干溶劑后備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法測定[11]。將蘆丁標準品干燥至恒重后，準確稱取0.0140 g定容于50 mL容量瓶中，得濃度0.28 mg/mL的蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.75 mL，搖勻，放置6 min再加入10%的Al(NO3)3溶液0.75 mL，搖勻，放置6 min后再加入4% NaOH溶液10 mL，70%乙醇定容，搖勻，靜置10～15 min后于510 nm處測定吸光度A，以蘆丁濃度X（mg/mL）對吸光度Y進行線性回歸，得回歸方程y=0.4367x-0.0006，R2=0.9996。

1.3.3 薇菜中黃酮類化合物提取量的測定

以蘆丁為對照品，采用UV法測定總黃酮含量。取一定體積的黃酮提取樣液，按1.3.2操作，加75%乙醇定容至25 mL，在波長510 nm處測定其吸光度。黃酮提取液中的黃酮含量以每g樣品中蘆丁當量計，按照公式（1）計算黃酮提取量。

式中：C表示測定液總黃酮含量（mg/mL）；N表示稀釋倍數(shù)；V表示為樣品體積（mL）；M表示樣品質量（g）。

1.3.4 薇菜黃酮提取單因素試驗

試驗時為減少在抽濾過程中提取溶劑乙醇體積分數(shù)的變化，需將真空泵與抽濾瓶連接管替換成軟質橡膠管，抽濾時橡膠管迅速變形閉合同時用夾子夾住橡膠管即可有效減少提取液的損失又可保證提取瓶內(nèi)氣壓穩(wěn)定。此外，將樣品和提取液裝入抽濾瓶后，應做好詳細刻度標記，并每隔5 min觀察提取液損失情況并及時補充，最大限度減少乙醇體積分數(shù)受真空條件的影響。通過對抽濾瓶密封程度的改變來控制減壓壓力范圍。

準確稱取烘干至恒重的薇菜粉末1.00 g，分別研究料液比（1：40、1：50、1：60、1：70、1：80），乙醇體積分數(shù)（30%、40%、50%、60%、70%），超聲功率（180、210、240、270、300 W），提取壓力（0.00～0.02、0.02～0.04、0.04～0.06、0.06～0.08、0.08～-0.1 MPa），提取溫度（40、50、60、70、80 ℃），提取時間（20、30、40、50、60 min）對薇菜黃酮提取量的影響。

1.3.5 提取工藝的響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗選取對黃酮提取量影響顯著的因素（p＜0.05），非顯著條件選擇單因素最優(yōu)條件，采用中心組合Box-Benhnken Design(BBD)設計試驗進行響應面優(yōu)化減壓-超聲波輔助醇法提取薇菜黃酮工藝。

1.3.6 薇菜黃酮DPPH·自由基清除能力的對比

參照呂英華等[12]人的方法稍作修改，取不同梯度濃度稀釋樣品2 mL和1 mmoL/L DPPH·2 mL，加入同一試管中，混勻后室溫下避光反應6 min，在515 nm下測定吸光值 Ai，對照組 Aj以等體積蒸餾水代替DPPH·溶液，空白組A0以等體積的蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水空白調零，清除率按公式2計算，并以Vc為陽性對照，平行測定3次。

式中：Ai表示2 mL樣品+2 mL DPPH；Aj表示2 mL樣品+2 mL蒸餾水；A0表示2 mL蒸餾水+2 mL DPPH。

1.3.7 薇菜黃酮ABTS+·自由基清除能力對比

ABTS+·的測定方法參考白海娜等[13]人方法稍作修改，取不同梯度濃度稀釋樣品1.5 mL和ABTS+·1.5 mL，加入同一試管中，混勻后室溫下避光反應6 min，在734 nm下測定吸光值Ai，對照Aj以等體積蒸餾水代替ABTS+·溶液，空白組A0以等體積的蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水空白調零，清除率按式3計算，并以Vc為陽性對照，平行測定3次。

式中：Ai表示 1.5 mL 樣品+1.5 mL ABTS+·；Aj表示 1.5 mL樣品+1.5 mL蒸餾水；A0表示1.5 mL蒸餾水+1.5 mL ABTS+·。

1.3.8 薇菜黃酮總還原力能力的對比

總還原力的方法參考薩茹麗[14]等人的方法，并稍作修改，考察減壓-超聲法提取的薇菜黃酮對總還原能力的影響。在試管中分別加入2.5 mL pH為6.6的PBS溶液，再加入0.01 g/mL的鐵氰化鉀溶液1 mL混勻后加入薇菜總黃酮1 mL，充分搖勻50 ℃水浴靜置20 min，待冷卻后迅速加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，吸取2 mL于另一試管中，加入0.1 g/mL的三氯化鐵溶液1 mL混勻，靜置10 min后于700 nm處檢測吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文繪圖軟件使用OriginPro 8.6，Plackett-Burman和BBD試驗設計使用Design-Expert 8.0.6，所有實驗數(shù)據(jù)均重復3次，所得數(shù)據(jù)標準誤差及其單因素方差顯著行分析（LSD）、IC50計算均使用SPSS 19.0。

2 結果與討論

2.1 減壓-超聲波輔助醇法提取薇菜總黃酮的單因素試驗結果

2.1.1 料液比對薇菜總黃酮提取量的影響

圖1 料液比對薇菜總黃酮提取量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb

在提取溫度50 ℃，乙醇體積分數(shù)50%，提取時間30 min，超聲功率為150 W，提取壓力為0.08～-0.1 MPa的條件下，考察不同液料比對薇菜黃酮提取量的影響。由圖1可知，料液比在1：40～1：60的范圍內(nèi)，溶劑量增加對薇菜黃酮提取量有明顯提高，當液料比為1：60時，薇菜黃酮提取量達到最大71.93 mg/g，當料液比在 1：60～1：80的范圍內(nèi)時，料液比與溶劑成負相關，此現(xiàn)象表明薇菜黃酮類物質已不隨溶劑的增加而溶出。且液料比過大，成本增加，因此液料比選擇在1：50～1：70范圍內(nèi)，進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對薇菜總黃酮提取量影響

圖2 乙醇體積分數(shù)對薇菜總黃酮提取量的影響Fig.2 Effects of volume fraction of ethanol on the yield of total flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb

在提取溫度50 ℃，料液比1：60，提取時間30 min，超聲功率為150 W，提取壓力為0.08～-0.1 MPa的條件下，考察不同乙醇體積分數(shù)比對薇菜黃酮提取量的影響。由圖2可知，乙醇體積分數(shù)在30%～50%范圍內(nèi)，乙醇體積分數(shù)與黃酮提取量成正相關，當乙醇濃度50%黃酮提取量達到最大81.91 mg/g，當乙醇體積分數(shù)超過50%時，乙醇濃度與黃酮提取量成負相關。溶液提取根據(jù)相似相溶的原則，濃度過高過低都不利于提取物的溶出，因此最適乙醇體積分數(shù)選擇40%～60%范圍，進行響應面優(yōu)化。

2.1.3 超聲功率對薇菜總黃酮提取量的影響

圖3 超聲功率對薇菜總黃酮提取量的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of total flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb

在提取溫度50 ℃，料液比1：60，提取時間30 min，乙醇體積分數(shù)50%，壓力為0.08～-0.1 MPa的條件下，考察不同超聲功率對薇菜黃酮提取量的影響。

由圖3可知，薇菜黃酮提取量隨功率增加而持續(xù)增長，當超聲功率達到300 W時，黃酮提取量達到最大值90.04 mg/g，此現(xiàn)象說明，超聲功率越高，熱效應、空穴效應及機械效應相應增加，共同促進了分子間運動相互作用的程度，有利于黃酮類化合物的溶出。超聲波清洗器最大工作功率為300 W，選擇超聲功率300 W為黃酮最佳提取條件。

2.1.4 超聲溫度對薇菜總黃酮提取量的影響

圖4 超聲溫度對薇菜總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Osmunda japonica Thunb

在乙醇體積分數(shù)50%，液料比1：60，提取時間30 min，超聲功率為300 W，氣壓為0.08～-0.1 MPa的條件下，考察不同的超聲溫度對薇菜黃酮提取量的影響。

由圖4可知，超聲溫度在40～70 ℃范圍內(nèi)，超聲溫度與黃酮提取量成正比，當超聲溫度70 ℃黃酮提取量達到最大104.2 mg/g，當超聲溫度超過70 ℃時，薇菜黃酮提取量開始降低，此現(xiàn)象說明，溫度高會加速分子間的運動，增加黃酮的提取量。

2.1.5 減壓對薇菜黃酮提取量的影響

圖5 壓強對薇菜總黃酮提取量的影響Fig.5 Effects of pressure on the yield of total flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb

在乙醇體積分數(shù)50%，料液比1：60，提取時間30 min，超聲功率為300 W，超聲溫度70 ℃，考察不同壓強對薇菜黃酮提取量的影響。由圖5可知，隨著提取壓強的逐漸降低，黃酮提取量不斷提高，當壓強在0.00～0.02 MPa接近常壓時，黃酮提取量為84.19 mg/g，而壓強降至0.08～-0.1 MPa接近真空時，黃酮提取量達到最大104.2 mg/g。減壓比常壓條件下黃酮提取量增加20.01 mg/mL。此現(xiàn)象說明：相同溫度條件下，減壓處理比常壓更有利于黃酮類物質的溶出，低壓時提取容器內(nèi)空氣稀薄，提取溶劑內(nèi)的提取物受到的外力減小，分子鏈變大，需要打破分子鏈的能量降低，因此，相同條件下低壓強提取較常壓提取效率更高。

2.1.6 超聲時間對薇菜總黃酮提取量的影響

圖6 超聲時間對薇菜總黃酮提取量的影響Fig.6 Effects of ultrasonic time on the yield of total flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb

在乙醇體積分數(shù) 50%，料液比 1：60，超聲溫度70 ℃，超聲功率為300 W，提取壓力為0.08～-0.1 MPa的條件下，考察超聲時間對薇菜黃酮提取量的影響。

由圖6可知，超聲時間在30～50 min范圍內(nèi)，超聲溫度與黃酮提取量成正比，當超聲時間50 min黃酮提取量達到最大113.05 mg/g，當超聲時間超過50 min時，薇菜黃酮提取量開始降低，此現(xiàn)象說明，超聲時間越長，提取物提取越充分；但時間過長對黃酮類物質活性會起到破壞作用，且提取時間過長在生產(chǎn)實踐時會造成能源浪費，因此最佳提取時間為50 min。

2.2 減壓-超聲波輔助醇法提取薇菜總黃酮的響應面優(yōu)化試驗結果

通過Plackett-Burman試驗對6組單因素數(shù)據(jù)行進顯著性分析，得到方程如下：

黃酮提取量=91.68+3.25A+3.49B-1.71C+2.05D-0.98E-1.31F。

計算結果顯示，在6個主效應中，料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度是顯著影響因素（p＜0.05），顯著性順序為乙醇體積分數(shù)（B）＞料液比（A）＞超聲溫度（D），三因素與響應值均呈正相關，而其它因素影響不顯著。根據(jù)PB結果，按照3因素3水平設計響應面試驗。

表1 試驗因素與水平設計Table 1 Experimental factors and levels design

2.3 響應面法優(yōu)化試驗結果

圖7 乙醇體積分數(shù)和料液比對黃酮提取量交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Contour plot and response surface diagram of effects of the interaction between the volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

圖8 超聲溫度和料液比對黃酮提取量交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 Contour plot and response surface diagram of effects of the interaction between ultrasonic temperature and solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

通過對圖7～圖9響應面和等高線的觀察分析，可直觀的得出料液比（A）、乙醇體積分數(shù)（B）和超聲溫度（C）之間的交互作用對薇菜黃酮提取量的影響，當?shù)雀呔€呈馬鞍形或橢圓形時，交互作用顯著；當?shù)雀呔€呈圓形時，則表示交互因素不顯著[15]。

圖9 超聲溫度和乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.9 Contour plot and response surface diagram of effects of the interaction between the ultrasonic temperature and volume fraction of ethanol on the yield of flavonoids

由圖7可知，等高線呈較為明顯的圓形，說明乙醇體積分數(shù)和料液比之間的交互作用不顯著，與方差分析結果相符。由圖8可知，超聲溫度的變化曲面和料液比的變化曲面較陡峭，說明這兩個因素對薇菜黃酮提取量影響均較顯著，溫度比料液比的變化坡面陡峭，說明溫度比料液比對薇菜總黃酮提取量的影響更為顯著。與方差分析結果相符。由圖9可知，等高線呈明顯的橢圓形，說明溫度和乙醇體積分數(shù)之間的交互作用較為顯著，對薇菜總黃酮的提取量影響較大。

在單因素的基礎上進行3因素3水平的試驗，結果如表2所示，數(shù)據(jù)的方差分析見表3。

通過Design Expert.V8.0.6軟件對表2中薇菜黃酮提取量進行優(yōu)化處理，進行二次多項式回歸擬合，得到薇菜黃酮提取量對料液比（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、提取溫度（C）的回歸模型方程為：

Y=116.89+5.82A-2.77B+7.36C+1.05AB-3.86AC+5.83BC-8.66A2-10.83B2-8.87C2

從表3可看出，該模型p＜0.01，說明該模型極顯著；失擬項不顯著 p＞0.05，校正決定系數(shù)（R2Adj）：0.9526；R2：97.29%，說明擬合度良好，試驗誤差小，方程的顯著性及可靠性很高，能夠反映響應值的變化。通過此回歸模型對減壓-超聲波輔助醇法提取薇菜總黃酮的工藝參數(shù)進行分析和預測。通過對回歸模型顯著性分析可知，A、C、AC、BC對黃酮提取量有極顯著的影響（p＜0.01），B對黃酮提取量具有顯著影響（p＜0.05），AB影響不顯著。由F值可知，各因素對薇菜黃酮提取量影響的順序為：超聲時間（C）＞料液比（A）＞乙醇體積分數(shù)（B）。

表2 響應面法試驗設計結果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

注：決定系數(shù)R2=0.9729；調整系數(shù)R2Adj=0.9526；*表示差異顯著，p＜0.05；**表示差異極其顯著，p＜0.01。

2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

通過響應面法得到減壓-超聲輔助超聲波提取薇菜總黃酮最佳工藝條件為：液料比 1：60（g/mL）、乙醇體積分數(shù) 49.97%、超聲溫度 70.19 ℃，提取壓力0.08～-0.1 MPa、超聲功率300 W、超聲時間50 min此條件下提取黃酮的最佳工藝（118.924±1.950）mg/g。為便于產(chǎn)業(yè)化控制，調整最佳工藝為料液比：1：60（g/mL）、乙醇體積分數(shù)50 %、超聲溫度為70 ℃，在此條件下進行驗證試驗，得到的黃酮含量為（117.133±1.120）mg/g，與理論值接近。

2.5 薇菜總黃酮的體外抗氧化活性對比分析

2.5.1 DPPH·清除率比較分析

圖10 兩種方法提取薇菜總黃酮DPPH自由基清除率差異Fig.10 Comparison of DPPH· radical scavenging capacity of flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb by two different methods

由圖10可知，常壓超聲和減壓-超聲提取薇菜總黃酮與水溶Vc組進行對照，兩種方法對DPPH的清除能力均高于 Vc，且樣品質量濃度與 DPPH·的清除率成正相關，兩種樣品及Vc對DPPH·清除率的IC50分別為：0.117 mg/mL（減壓-超聲）、0.119 mg/mL（常壓超聲）、0.121 mg/mL（水溶Vc）。通過比較分析，兩種方法提取的樣品對DPPH自由基的清除效果差異均不顯著（p＞0.05）[15]。

2.5.2 ABTS+·清除率比較分析

圖11 兩種方法提取薇菜總黃酮ABTS+·清除率差異Fig.11 Comparison of ABTS+· radical scavenging capacity of flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb by two different methods

由圖11可知當樣品濃度范圍在0.05～0.2 mg/mL之間時，減壓-超聲提取的薇菜黃酮對ABTS+·消除率增強。兩種樣品及Vc對ABTS+·清除率的IC50分別為[16]：0.072 mg/mL（減壓-超聲）、0.076 mg/mL（常壓超聲）、0.1 mg/mL（水溶Vc）。兩種提取方法的薇菜黃酮樣液與Vc通過方差分析進行兩兩比較，兩種提取物對自由基的清除率顯著高于水溶 Vc（p＜0.05），但兩種方法的黃酮提取液對自由基的清除率差異不顯著（p＞0.05）。說明常壓超聲和減壓-超聲提取的薇菜總黃酮均對ABTS+·有較強的清除效果。

2.5.3 總還原能力比較分析

通過圖12可知，隨各樣品濃度逐漸增加，總還原能力也不斷增強。兩種方法提取的樣液的還原能力均高于水溶Vc，通過單因素方差分析進行兩兩比較，兩種提取方法黃酮提取液的總還原能力差距不顯著（p＞0.05）。

圖12 兩種方法提取薇菜總還原力差異Fig.12 Comparison of total reducing power capacity of flavonoids extracted from Osmunda japonica Thunb by two different methods

3 結論

3.1 采用減壓-超聲波輔助乙醇提取薇菜黃酮的最佳條件為：液料比1：60（g/mL）、乙醇體積分數(shù)49.97%、超聲溫度70.19 ℃，提取壓力0.08～-0.1 MPa、超聲功率300 W、超聲時間50 min此條件下提取黃酮的最佳工藝（118.924±1.950）mg/g。以水溶 Vc為對照，通過對比常壓超聲和減壓-超聲提取液的體外抗氧化活性可知，兩種提取方法與Vc對DPPH自由基的清除能力從大到小：減壓-超聲＞常壓-超聲＞水溶Vc，單因素方差分析兩兩比較結果顯示，兩種提取方法的樣品對DPPH自由基的清除效果差異不顯著（p＞0.05）；對ABTS自由基的清除能力從大到?。簻p壓-超聲＞常壓-超聲＞水溶Vc，兩種方法的黃酮提取液清除率差異不顯著（p＞0.05），與Vc相比差異顯著（p＜0.05）；兩種提取方法的總還原能力差異均不顯著（p＞0.05）。

3.2 綜上所述，通過減壓-超聲法輔助乙醇提取薇菜黃酮，使薇菜黃酮提取量得到顯著（p＜0.05）提升，也很好地保留了黃酮的抗氧化活性。相比常壓超聲輔助乙醇提取法，減壓-超聲工藝通過降低提取容器內(nèi)壓強接近至真空狀態(tài)，減小提取液分子間相互壓力，從而降低提取所需能量，縮短了超聲提取時間，降低了提取溫度，對降低產(chǎn)業(yè)化成本有積極指導作用。

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