何陵玲，吳麗華，鄭必勝，胡康，顏盛繁，蔣澤根

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東時(shí)代食品與生命健康研究有限公司，廣東廣州 510670）

裂褶多糖（Schizophyllan，簡(jiǎn)稱SPG）是由藥用[3]，它不僅具有保健功能，還可用于鉆井以增加石油的回收率[4]。天然裂褶多糖分子量一般為106～107u[5]，由于分子量太大，導(dǎo)致其水溶性差。作為藥物，口服真菌裂褶菌（Schizophyllum commune Fries）產(chǎn)生的一種中性胞外多糖，具有抗腫瘤和良好的保濕功效[1,2]，可作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和免疫系統(tǒng)的非特異性刺激劑時(shí)吸收率較差，生物利用度低；皮下注射引起疼痛和硬化，靜脈注射引起血管閉塞[6]。而且，它作為原料在產(chǎn)品加工過(guò)程中也面臨難溶解和溶解時(shí)間長(zhǎng)等諸多問(wèn)題。周林等通過(guò)對(duì)裂褶多糖進(jìn)行羧甲基化[7]和乙?；痆8]修飾研究，從而為得到溶解性好的改性多糖提供途徑。由此，需對(duì)天然大分子裂褶多糖進(jìn)行改性，獲得分子量大小適中溶解性好的裂褶多糖。

德國(guó)Munzber[9]曾對(duì)SPG的酸水解過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)酸水解時(shí)其分子鏈斷裂是隨機(jī)的，產(chǎn)物分子量分布寬。日本早在1978年就開展了高強(qiáng)度超聲對(duì)裂褶多糖的降解研究[10]，并有相關(guān)的發(fā)明專利[6]。治療子宮癌的西佐糖（Sizofiran），就是裂褶多糖經(jīng)過(guò)超聲降解成分子量為450 ku左右的產(chǎn)物，但超聲降解效率低，處理成本高，導(dǎo)致該藥品的價(jià)格一直趨高。利用酶法對(duì)多糖進(jìn)行定向降解和修飾是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。Sutivisedsak等[11]發(fā)現(xiàn)用裂褶多糖作為唯一碳源篩選出的菌種有較高的β-葡聚糖酶活，且該葡聚糖酶也可作用于昆布多糖和熱凝膠多糖。Leathers等[12]發(fā)現(xiàn)了三種真菌產(chǎn)生的內(nèi)切β-葡聚糖酶可特異性地作用于裂褶多糖，其酶活達(dá)1.70～4.30 U/mg。本項(xiàng)目組在前期研究中，也成功地從裂褶菌發(fā)酵液中分離出一種β-1,3-內(nèi)切葡聚糖酶，對(duì)于裂褶多糖具有很好的專一性，通過(guò)多級(jí)純化后對(duì)其酶的特性進(jìn)行了研究，證明其為典型的內(nèi)切 β-1,3-葡聚糖酶[13,14]。由此，若能在裂褶菌發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)發(fā)酵條件的系統(tǒng)控制，則有可能利用其體系所產(chǎn)酶對(duì)所產(chǎn)多糖進(jìn)行降解從而一步獲得分子量較低，水溶性較好的裂褶多糖。本論文首先從四株裂褶菌GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1中篩選出酶活相對(duì)較高的菌株，之后分別探究了酵母浸膏和氯化銨的添加量和添加時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量和酶活的影響，明確了氮源的添加策略，得出胞外多糖產(chǎn)率、β-1,3-葡聚糖酶活力之間的聯(lián)系，為后續(xù)發(fā)酵調(diào)控制備水溶性較好的裂褶多糖的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試4株裂褶菌的編號(hào)和來(lái)源。其中Sc1來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保藏，由廣東省微生物研究所提供；GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44現(xiàn)購(gòu)于廣東省微生物研究所。

1.1.2 試劑

昆布多糖，購(gòu)于Sigma公司；葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉和苯酚等均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5424R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf；DU-730紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Beckman Coulter；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Christ；GI54DWS型高壓滅菌鍋：美國(guó)致微。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基（g/L）：PDA培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 30，酵母浸膏 3，KH2PO41，MgSO47H2O 0.50，pH自然。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

1.2.1.1 平板培養(yǎng)

斜面種子28 ℃培養(yǎng)7 d，然后從斜面試管中用接種環(huán)取少量菌絲，劃線接種于平板培養(yǎng)基中，28 ℃，培養(yǎng)7 d。

1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng)

斜面種子28 ℃培養(yǎng)7 d，然后從斜面試管中用接種環(huán)取兩環(huán)菌絲，轉(zhuǎn)入裝液量為100 mL的250 mL一級(jí)種子瓶中，28 ℃、170 r/min培養(yǎng)3 d，將一級(jí)種子培養(yǎng)液以10%的接種量轉(zhuǎn)到250 mL培養(yǎng)瓶中，28 ℃、170 r/min，培養(yǎng)溫度28 ℃，pH自然，發(fā)酵7 d。

1.2.2 菌株篩選

以剛果紅瓊脂染色法定性測(cè)定菌株 GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1內(nèi)切 β-1,3-葡聚糖酶活；再進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以SPG和β-1,3-葡聚糖總酶活為考察指標(biāo)，篩選出多糖產(chǎn)量和酶活都相對(duì)較高的菌株。

1.2.3 氮源對(duì)多糖和酶活的影響

本實(shí)驗(yàn)探討了有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮在單獨(dú)及協(xié)同作用下對(duì)裂褶多糖產(chǎn)量和 β-1,3-葡聚糖酶活力的影響，發(fā)酵7 d后測(cè)定各參數(shù)，得出氮源最佳添加策略。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量的測(cè)定

取一定量的發(fā)酵液，5000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用蒸餾水洗滌2次，在70 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重。

1.3.2 粗多糖的測(cè)定

取上述發(fā)酵液中的上清液，用3倍體積95%乙醇醇沉后，置于70 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重。

1.3.3 還原糖的測(cè)定

DNS 法[15]。

1.3.4 β-1,3-葡聚糖酶活力測(cè)定

1.3.4.1 總酶活測(cè)定[16]

取0.50 mL酶液，0.50 mL NaAc-HAc緩沖液（0.05 mol/L，pH 5.00）配制的0.50% SPG溶液組成反應(yīng)體系于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，加3.00 mL DNS溶液，沸水浴5 min，用蒸餾水定容至25.00 mL，混勻后，在550 nm處測(cè)定其OD值。以滅活酶做空白。

酶活力（Etotal）單位定義：在上述反應(yīng)條件下，1 min水解β-1,3-葡聚糖釋放出1 μmol葡萄糖所需的酶量即為一個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.3.4.2 內(nèi)切酶活定性測(cè)定[17]

取8 μL樣品加到新鮮制備的平板表面（0.70%瓊脂，0.05%（m/V）β-1,3-葡聚糖）。平板放置過(guò)夜，用1.00 mg/mL剛果紅染色45 min后，用1 mol/L NaCl脫色30 min。內(nèi)切酶活由透明圈亮度決定。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）的形式表示，n=3。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶發(fā)酵各參數(shù)比較

圖1 四株裂褶菌生物量、胞外多糖產(chǎn)量和酶活力的比較Fig.1 Biomass, exopolysaccharide and enzyme activity of fourstrains of Schizophyllum commune

將該四株裂褶菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，7 d后測(cè)定生物量、殘?zhí)呛?、胞外多糖得率?β-1,3-葡聚糖酶活。如圖1，菌株Sc1消耗還原糖能力最強(qiáng)，菌體干重有最大值為13.61 g/L；菌株GIM5.43胞外多糖產(chǎn)量和酶活同時(shí)有最大值，分別為2.29 g/L、0.28 U/mL，且其殘?zhí)呛肯啾容^高，為17.02 g/L，可見(jiàn)該菌株還原糖轉(zhuǎn)化率高。

2.2 β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶活定性分析

圖2 剛果紅染色法測(cè)定菌株內(nèi)切酶活Fig.2 Determination of the of activity endo-glucanase by congo red staining

由剛果紅瓊脂染色法定性測(cè)定的內(nèi)切 β-1,3-葡聚糖酶活，結(jié)果如圖2所示，四株裂褶菌所得透明圈大小差別不大，但透明圈亮度差別明顯，由圖 2（b）GIM5.43菌株透明圈最亮，可見(jiàn)其內(nèi)切酶活最高，再結(jié)合圖1胞外多糖產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)選GIM5.43為后續(xù)研究菌株。

2.3 氮源對(duì)多糖和酶活的影響

2.3.1 酵母浸膏的添加量對(duì)多糖得率和酶活力的影響

圖3 酵母浸膏對(duì)多糖產(chǎn)量和酶活的影響Fig.3 Effects of yeast extract on the yield of schizophyllan and the activity of β-1, 3- glucanase

由圖 3，隨著酵母浸膏濃度的升高多糖得率逐漸降低，而 β-1,3-葡聚糖酶活逐漸增大。多糖在酵母浸膏濃度為1.00 g/L時(shí)有最大值5.31 g/L，但此時(shí)酶活幾乎為0，可能是還原糖的抑制作用（殘?zhí)呛繛?1.32 g/L），或者是氮源缺乏不利于β-1,3-葡聚糖酶的合成。

表1 酵母浸膏對(duì)生物量和還原糖含量的影響Table 1 Effects of yeast extract on the biomass and the content of reducing sugar

搖瓶培養(yǎng)中，低濃度酵母浸膏（1.00 g/L），菌球稀疏且較?。桓邼舛龋?.00 g/L以上）時(shí)菌體呈羽毛狀，布滿整個(gè)搖瓶，達(dá)最大生物量為15.49 g/L，可知高濃度酵母浸膏促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，不利于多糖的積累，與 Munzer報(bào)道結(jié)論不一致，可能是菌種不同造成的[18]。Darby研究了培養(yǎng)基中氮濃度對(duì)疣狀瘧原蟲顆粒生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度氮（約 100～500 mmoL NH4NO3）可產(chǎn)生緊密的平滑顆粒，低濃度（1～5 mmoL）得到非常松散和蓬松的顆粒[19]。Pirt和Callow研究產(chǎn)黃青霉，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加硫酸銨可得到顆粒狀菌體，將玉米漿作為氮源則得到塊狀菌體[20]。Burkholder的早期工作已經(jīng)表明，介質(zhì)組成確實(shí)影響菌體形態(tài)[21]，可見(jiàn)酵母浸膏可改變裂褶菌菌絲體的形態(tài)，從而影響其分泌胞外多糖[22]。為了提高 β-1,3-葡聚糖酶活的同時(shí)又不影響多糖的產(chǎn)率，后續(xù)研究中可探究NH4Cl對(duì)酶活是否有提高，或者采用分批補(bǔ)加酵母浸膏的方法使胞外多糖和 β-1,3-葡聚糖酶活力同時(shí)達(dá)最大值。

2.3.2 NH4Cl對(duì)多糖得率和 β-1,3-葡聚糖酶活力的影響

圖4 NH4Cl對(duì)多糖產(chǎn)量和酶活的影響Fig.4 Effects of NH4Cl on the yield of schizophyllan and the activity of β-1, 3-glucanase

當(dāng)酵母浸膏濃度為3.00 g/L時(shí)，NH4Cl的添加量對(duì)裂褶菌分泌胞外多糖和 β-1,3-葡聚糖酶的影響。由圖4可知，隨著NH4Cl濃度的增加，多糖曲線呈下降趨勢(shì)，可知當(dāng)酵母浸膏含量為3.00 g/L時(shí)，發(fā)酵液中添加NH4Cl不利于多糖的積累，空白組多糖產(chǎn)率最高為2.02 g/L。NH4Cl含量為1.00 g/L時(shí)，多糖產(chǎn)率最低，但此時(shí)酶活有最大值0.34 U/mL，與趙欣[16]報(bào)道的結(jié)論一致，由表2可知，此時(shí)還原糖含量相對(duì)其他濃度來(lái)說(shuō)較低，且菌體得率也不高，說(shuō)明裂褶菌的代謝途徑和未添加NH4Cl比較發(fā)生了顯著改變，菌體可能由其他途徑代謝還原糖分泌其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，且這個(gè)環(huán)境更利于產(chǎn)酶。對(duì)于裂褶菌來(lái)說(shuō)分泌胞外多糖和β-1,3-葡聚糖酶是一個(gè)內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)后的結(jié)果，若外部環(huán)境有利于多糖的積累，那此時(shí)菌體幾乎不分泌β-葡聚糖酶，若外部環(huán)境不利于分泌胞外多糖，或?qū)Ξa(chǎn)酶更有利，那此時(shí)胞外多糖反而產(chǎn)量更低。同樣Rau研究溶氧量和分批發(fā)酵過(guò)程對(duì)裂褶多糖產(chǎn)量的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后期裂褶菌可產(chǎn)生 β-1,3-葡聚糖酶，猜測(cè)可能是發(fā)酵罐中C源不足，菌體分泌酶降解自身多糖得到可利用的碳源[23]。

由表2可知還原糖含量在10.00 g/L以上，但每個(gè)濃度梯度都有酶活，說(shuō)明圖3中酵母浸膏濃度為1.00 g/L時(shí)酶活為0，很大可能是因?yàn)榈吹娜狈Α１緦?shí)驗(yàn)，在氮源充足的情況下，起始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.00 g/L NH4Cl有利于 β-1,3-葡聚糖酶的產(chǎn)生，但卻不利于多糖的積累，所以為了保證多糖得率較高的同時(shí)發(fā)酵后期酶活力最大，可考慮在發(fā)酵過(guò)程中分批補(bǔ)加NH4Cl，考察NH4Cl在酵母浸膏濃度較低的情況下是否可提高酶活。

表2 NH4Cl對(duì)生物量和還原糖含量的影響Table 2 Effects of NH4Cl on the biomass and the content of reducing sugar

2.3.3 NH4Cl的添加時(shí)間對(duì)多糖得率和 β-1,3-葡聚糖酶活力的影響

圖5 NH4Cl的添加時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量和酶活的影響Fig.5 Effects of NH4Cl addition time on the yield of schizophyllan and the activity of β-1,3- glucanase

當(dāng)酵母浸膏和NH4Cl的添加量均為最佳值時(shí)，探究 NH4Cl的最佳添加時(shí)間對(duì)多糖得率和酶活力的影響。

由圖5可知，當(dāng)酵母浸膏濃度為1.00 g/L時(shí)，與對(duì)照組比較，在發(fā)酵前期添加NH4Cl不利于胞外多糖和生物量的積累，第6 d添加NH4Cl對(duì)多糖積累有促進(jìn)作用，最大產(chǎn)率為 2.71 g/L，較對(duì)照組提高了14.83%。第2 d添加NH4Cl其生物量、還原糖含量和胞外多糖產(chǎn)量都是最低的，可能菌體處于調(diào)整期后期，對(duì)數(shù)期初期，此時(shí)外加NH4Cl打破了內(nèi)部平衡，需重新適應(yīng)環(huán)境。NH4Cl添加的時(shí)間越后對(duì)菌體的生長(zhǎng)和胞外多糖產(chǎn)率影響越小，因此需在后期添加NH4Cl。圖中β-1,3-葡聚糖酶活均為0，可知當(dāng)有機(jī)氮酵母浸膏濃度過(guò)低時(shí)，NH4Cl的添加對(duì)胞外酶活力無(wú)促進(jìn)作用，可知只有在酵母浸膏充足的情況下，氯化銨才可提高酶活力。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，需重點(diǎn)探究分批補(bǔ)加酵母浸膏對(duì)菌體生長(zhǎng)和分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響。

2.3.4 分批補(bǔ)加酵母浸膏對(duì)多糖得率和酶活的影響

圖6 分批補(bǔ)加酵母浸膏對(duì)多糖產(chǎn)量和酶活的影響Fig.6 Effects of batch addition of yeast extract on the yield of schizophyllan and the activity of β-1,3- glucanase

初始酵母浸膏含量1.00 g/L，發(fā)酵第6 d再補(bǔ)加不同濃度的酵母浸膏，首先如圖6中a所示。添加酵母浸膏后生物量迅速增加，多糖產(chǎn)量整體呈下降趨勢(shì)，可能是在后期添加酵母浸膏使得菌體代謝途徑由多糖合成轉(zhuǎn)變?yōu)榫w繁殖。隨著菌體繁殖速度加快，新生成的菌絲也開始合成多糖，從而使得多糖產(chǎn)量稍有上升跡象，但是酵母浸膏添加量達(dá)到一定的程度，多糖產(chǎn)量迅速降低，此時(shí)多糖合成途徑受到抑制，因此設(shè)計(jì)添加少量酵母浸膏，減少菌體繁殖對(duì)多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖6中b所示。

添加0.5 g/L以下酵母浸膏，多糖產(chǎn)量仍較未添加組低，但 β-1,3-葡聚糖酶活卻顯著升高，在酵母浸膏添加量為0.2 g/L時(shí)有最大值，之后酶活稍有降低?？梢?jiàn)在低初始酵母浸膏含量的情況下，分批補(bǔ)加低濃度酵母浸膏可促進(jìn)菌體分泌 β-1,3-葡聚糖酶。祃棟猛等探究發(fā)酵后期補(bǔ)加酵母膏和硫酸銨對(duì)克雷伯氏菌合成 1,3-丙二醇的影響，發(fā)現(xiàn)兩種氮源均可增強(qiáng)關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和1,3-丙二醇的合成[24]，可見(jiàn)氮源可顯著影響次級(jí)代謝中酶活性，從而刺激生長(zhǎng)，同樣，孫啟星等也得到相同的結(jié)論[25]。但隨著補(bǔ)加濃度的增大，菌體合成多糖速率增大，相應(yīng)的酶活降低，跟NH4Cl對(duì)產(chǎn)多糖和酶這兩者之間關(guān)系的結(jié)論基本一致：菌體產(chǎn)多糖和酶是兩個(gè)相互抑制的過(guò)程，合成SPG時(shí)，β-1,3-葡聚糖酶酶活被抑制。由此，在盡量保證多糖產(chǎn)量的情況下提高酶活，采用分批補(bǔ)加策略，初始酵母浸膏濃度為1.00 g/L，發(fā)酵第6 d補(bǔ)加0.10 g/L酵母浸膏，多糖產(chǎn)量達(dá)4.16 g/L，比未優(yōu)化（圖3酵母浸膏為3.00 g/L時(shí)）提高了61.24%，酶活為0.34 U/mL，提高了142.86%。

3 結(jié)論

以SPG產(chǎn)量和β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶和總酶活為考察指標(biāo)，采用剛果紅瓊脂染色法和搖瓶培養(yǎng)，從四株裂褶菌GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1中篩選出多糖產(chǎn)量和酶活都相對(duì)較高的菌株GIM5.43，多糖產(chǎn)量和酶活分別為2.29 g/L與0.28 U/mL。因此選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)研究，優(yōu)化酵母浸膏、NH4Cl的補(bǔ)加策略，結(jié)果表明：當(dāng)酵母浸膏含量為1.00 g/L時(shí)，得到小的松散菌絲體，多糖產(chǎn)量為5.31 g/L，但總酶活較低（0 U/mL）；含量為7.00 g/L以上時(shí)得到絮狀絨毛狀菌體，多糖產(chǎn)量為0.50 g/L，總酶活為0.23 U/mL。為了保證多糖產(chǎn)率，采用分批補(bǔ)加策略，初始酵母浸膏濃度1.00 g/L，發(fā)酵第6 d補(bǔ)加0.10 g/L酵母浸膏，多糖產(chǎn)量為4.16 g/L，比未優(yōu)化提高了 61.24%，總酶活為 0.34 U/mL，提高了142.86%。當(dāng)酵母浸膏含量較低（1.00 g/L），添加NH4Cl對(duì)酶活無(wú)促進(jìn)作用，當(dāng)其含量為3.00 g/L時(shí)，NH4Cl可提高總酶活達(dá)51.20%。

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