朱曉冉，徐穎，李德海，趙楠楠，龔金華

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.香港教育大學博文及社會科學學院科學與環(huán)境學系，香港 999077）

長期接觸輻射環(huán)境，使機體處于氧化應激狀態(tài)，導致體內自由基濃度升高，加速細胞衰老死亡，造成機體組織損傷，增加心血管疾病和癌癥的發(fā)病率[1]。研究表明食用外源性天然抗氧化劑能有效拮抗體內過剩的自由基，減少氧化作用產生的活性氧化簇，相比人工合成抗氧化劑具有來源廣泛、低毒和無副作用等優(yōu)勢[2]，因此開發(fā)天然抗氧化劑受到研究者的極大關注。

黑木耳（Auricularia auricula）又名木耳、光木耳，屬真菌門擔子綱，是我國重要的藥食同源真菌，具有防治動脈硬化、高血壓、眼底出血和缺鐵性貧血等功效，有“素中之葷”的美稱[3]。黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharides，AAP）是黑木耳中含量最多、最主要的活性成分。研究表明，黑木耳多糖具有抗氧化、抗輻射[4]、抗凝血、降血脂[5]、降血糖和抗腫瘤[6]等生物學功能，因此利用黑木耳多糖開發(fā)功能性食品、保健品和藥物具有廣闊的前景。

但多糖聚合度較大，組成多樣，空間結構復雜，使黑木耳多糖的開發(fā)受到限制。研究學者發(fā)現多糖分子量大小顯著影響多糖的生理活性。ZhouXu等[7]發(fā)現山茶籽餅低分子量多糖有更強的自由基清除能力和金屬螯合能力。

MZhong等[8]研究發(fā)現，與高分子的牡蠣多糖相比，低分子量的牡蠣多糖能夠顯著增加細胞中相容性復合物Ⅱ（MHC-Ⅱ）CD40和CD86的表達，進一步誘導腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細胞介素（IL）-12的分泌。FanYang等[9]研究發(fā)現低分子量的黃芪根多糖顯著提高小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2b、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12對重組熱休克蛋白-90疫苗的特異性抗體滴度（p＜0.05）。

本文以野生黑木耳為原料，采用 Labscale TFF System實驗室超濾系統(tǒng)對黑木耳多糖進行分子量分級，以體外抗氧化指標為評價手段，研究分子量大小與黑木耳多糖抗氧化功能的相關性，以期為黑木耳多糖的功能活性及其功能性食品研發(fā)提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售大興安嶺地區(qū)野生黑木耳，購自哈爾濱市南極市場；Tris、ABTS、DPPH，Sigma公司；無水乙醇、葡萄糖和抗壞血酸等其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Labscale TFF System實驗室超濾系統(tǒng)，Pellicon XL超濾膜包（膜面積50 cm2，截留分子量30 ku、100 ku），美國Millipore公司；RT-6000酶標儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司；TU-1810紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；JA2003萬分之分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；R-205B旋轉蒸發(fā)儀，上海申勝儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

黑木耳烘干粉碎，石油醚脫脂，置于4 ℃條件下保藏備用。

1.3.2 黑木耳多糖的制備

準確稱取黑木耳干粉按照一定的料液比分別加入0.1 mol/L的鹽酸、去離子水和0.1 mol/L的NaOH溶液于90 ℃水浴鍋中浸提4 h。提取液離心、抽濾調至中性后旋蒸，得黑木耳多糖濃縮液；濃縮液采用Servge法脫蛋白，5% H2O2、37 ℃條件下脫色，經透析、醇沉、超濾、凍干后分別得到酸性未脫色黑木耳多糖、酸性脫色黑木耳多糖、中性未脫色黑木耳多糖、中性脫色黑木耳多糖、堿性未脫色黑木耳多糖和堿性脫色黑木耳多糖六種多糖。

1.3.3 黑木耳多糖得率和純度

采用苯酚-硫酸法測定黑木耳多糖含量[11]。

準確稱取一定量的黑木耳多糖粉，配制成黑木耳多糖溶液，按照葡萄糖標準曲線制作的方法測定吸光度，同時以蒸餾水做空白對照，三次平行，取平均值，代入標準曲線y=7.9120x+0.0798（R2=0.9992）計算黑木耳多糖的得率、純度，計算公式如下所示：

式中：C為稀釋后提取液中多糖濃度，g/mL；N為稀釋倍數，V為提取液體積，mL；M為原料質量，g。

式中：C為稀釋后提取液中多糖濃度，g/mL；V為提取液體積，mL；M為原料質量，g。

1.3.4 ABTS自由基（ABTS+·）清除能力測定

參照文獻[12]，并稍作修改。將5 mL 7.4 mmol/L ABTS與88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8混勻，室溫下避光靜置過夜，形成ABTS儲備液。使用前用無水乙醇稀釋至常溫條件下于波長 734 nm處測定吸光度為0.7±0.02。將250 μL ABTS 工作液與50 μL樣品溶液混合，常溫避光靜置6 min，于734 nm處測吸光值，平行測定3次，結果取平均值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值。

1.3.5 DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定

參考PRIOR[13]的方法，在2 mL樣液中加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液，混勻室溫下避光靜置20 min后，在517 nm處測定吸光值，DPPH·清除率按下列公式計算。試驗設3組平行，結果取平均值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.3.6 羥自由基（·OH）清除能力測定

參考Furao Lai的方法[14]，并作出改動，樣品組反應體系中加入1 mL樣品溶液、1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵、1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液和 1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫，混合均勻，在波長510 nm處測定各溶液的吸光值，未加硫酸亞鐵和未加樣品作為空白對照組，·OH清除率按下列公式計算試驗設3組平行，結果取平均值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.3.7 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

參照CHANDRIKP等[15]的方法并作一定調整，試管中加入1 mL樣液和3 mL pH 8.2的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，混勻后25 ℃水浴平衡8 min，加入35 mmol/L的鄰苯三酚200 μL，兩者混合均勻，加入8 mmol/L HCL 1 mL終止反應，325 nm處測定吸光值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.3.8 總還原力的測定

采用鐵氰化鉀還原法測定黑木耳多糖的總還原能力[16]。樣液1.00 mL加入2.50 mL、1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃下反應20 min，速冷后向溶液加入2.50 mL、10%的三氯乙酸溶液，5 min后，加入5 mL去離子水，0.50 mL、0.1%三氯化鐵溶液，反應30 min，在700 nm處測定吸光值。

1.3.9 不同分子量黑木耳多糖體外抗氧化能力的比較

從六種不同方法提取黑木耳多糖中篩選出抗氧化能力最佳黑木耳多糖作為試驗原料。參考姜帆[10]等人的方法，采用Labscale TFF System實驗室超濾系統(tǒng)，選用截留分子量為100 ku和30 ku的聚醚砜超濾膜，先后對黑木耳多糖溶液進行分離。通過超濾處理，將黑木耳多糖分為三個分子量段：Sp1(＞100 ku)、Sp2(30 ku～100 ku)和 Sp3(＜30 ku)。三種黑木耳多糖液濃縮，脫色，透析，凍干得Sp1、Sp2和Sp3干粉。采用五種方法，評價三種不同分子量黑木耳多糖的體外抗氧化能力。

1.4 統(tǒng)計分析

數據結果以平均值±標準方差（means±SD）表示，數據處理，結果采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 21.0與Origin 8.5進行統(tǒng)計分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 黑木耳多糖得率及純度分析

試驗研究了溶劑酸堿性脫蛋白以及脫色處理對黑木耳多糖得率和純度的影響，結果見表1。

表1 黑木耳多糖的得率及純度分析Table 1 Yield and purity analysis of Auricularia auricula polysaccharides

由表1可知，提取溶劑的酸堿性、脫蛋白和脫色處理對黑木耳多糖的得率和純度影響較大。

得率結果表明酸性條件提取多糖得率最高，其次是堿性條件，最低的是中性條件，可以看出堿性和酸性條件有利于黑木耳多糖的提取。

酸堿溶液能夠破壞組織細胞壁結構，從而促進胞內多糖的釋放，提高黑木耳多糖的得率[17]。但純度結果表明，堿性條件提取多糖純度最高，其次是中性條件，酸性條件提取多糖的純度最低，說明提取的堿性條件能夠促進更多的非多糖成分溶出，而酸性條件不利于非多糖成分溶出。

從表1數據中還可以看出，脫蛋白的黑木耳多糖脫色處理后黑木耳多糖的純度提高但得率卻降低，說明脫蛋白后使用雙氧水脫除的色素時會造成部分的多糖損失，且對不同酸堿性的多糖損失率也不同，其中酸性多糖損失最大，堿性的多糖損失最小，這個可能是因為堿性條件下提取的酸性黑木耳多糖含有較多的糖醛酸，而雙氧水具有很強氧化性對其的影響較大[18]。

2.2 不同提取方式提取黑木耳多糖體外抗氧化能力的比較

溶劑種類及溶劑的pH均顯著影響提取成分的生理活性，因此本實驗研究了不同酸堿性溶劑對黑木耳多糖體外抗氧功能的影響，試驗結果見表2。

表2 不同黑木耳多糖抗氧化指標IC50值比較Table 2 Antioxidant indexes (IC50) of different Auricularia auricula polysaccharides

2.3 分子量對黑木耳多糖體外抗氧化活性的影響

研究表明不同分子量的多糖其功能有著顯著差異，因此本實驗采用超濾膜分離技術對抗氧化能力較好的中性未脫色黑木耳多糖進行了分子量分級，分別得到了三個分子量段的中性未脫色黑木耳多糖，即Sp1（＞100 ku）、Sp2（30 ku～100 ku）和 Sp3（＜30 ku），比較分子量對木耳多糖抗氧化功能的影響。

2.3.1 不同分子量黑木耳多糖分布結果

圖1 不同分子量段黑木耳多糖分布比例Fig.1 Distribution proportion of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weight

中性未脫色黑木耳多糖經過超濾膜分離后，不同分子量段黑木耳多糖占黑木耳多糖比例見圖1。

由圖1可知，Sp2占總多糖含量最高為54%，Sp1占總多糖含量33%、Sp3占總多糖含量13%。采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法、3,5-二硝基水楊酸比色法測定超濾前后總糖、蛋白質和還原糖含量的變化，結果表明Sp1組分中蛋白質含量最高，Sp2、Sp3中蛋白質含量較低，可能由于蛋白質、糖蛋白等物質的分子量大于 100 ku而無法透過第一層超濾膜，因此僅對Sp1進行脫蛋白處理。脫蛋白后的Sp1多糖占總多糖比例減小，可能是由于蛋白質、糖蛋白等被去除導致大分子黑木耳多糖所占比例降低。此外，Sp1、Sp2中幾乎不含還原糖，由此說明超濾過程可以有效地去除小分子還原糖等雜質，因此可以通過截留液中還原糖含量的多少來判斷超濾結點。

2.3.2 不同分子量黑木耳多糖對 ABTS+·的清除作用

抗氧化劑提供電子或氫原子清除自由基，導致ABTS溶液顏色發(fā)生變化，通過吸光值測定清除ABTS+·能力，從而反映抗氧化能力，因此本實驗研究了Sp1、Sp2和Sp3對ABTS+·的清除率，結果如圖2所示。

從圖2中可以看出，三段分子量的中性未脫色黑木耳多糖和抗氧化劑Vc對ABTS+·均有抑制作用，且與黑木耳多糖濃度呈現良好的量效關系，說明均具有較好的抗氧化能力[20]，多糖濃度大于4 mg/mL時抑制能力達到最高后趨于平緩。Sp1、Sp2、Sp3抑制能力均低于Vc，但Sp3抑制能力與Vc抑制能力相近。從圖1中還可知，分子量的大小不同顯著影響黑木耳多糖對 ABTS+·的抑制能力，其中小分子量的 Sp3對ABTS+·的抑制能力最強可達到90%左右，其次是Sp2，抑制能力最弱的是大分子量的Sp1，為51%，因此說明小分子量的中性未脫色黑木耳多糖具有最好的抗氧化能力。何芳[21]等超濾膜分級不同分子量條斑紫菜多糖的體外抗氧化性，結果表明分子量最小的條斑紫菜多糖具有最強的抗氧化活性，與本試驗研究結果基本一致。

2.3.3 不同分子量黑木耳多糖對DPPH·的清除作用

圖3 不同分子量黑木耳多糖對DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weight on DPPH

抗氧化活性物質與DPPH·的孤對電子配對，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色的DPPH-H非自由基形式，從而使溶液褪色，褪色程度與接受的電子數成定量關系[22]。實驗研究了Sp1、Sp2和Sp3對DPPH·對清除率，結果如圖3所示。

由圖3可知，在試驗濃度范圍內，三種不同分子量的黑木耳多糖隨濃度增加，對DPPH·的清除率均呈現提高的趨勢，呈明顯的劑量依賴關系。黑木耳多糖能夠清除DPPH·可能是多糖能夠提供質子，配對孤對電子，使DPPH自由基生成穩(wěn)定的化合物[23]。三種分子量的黑木耳多糖對 DPPH·的清除能力均顯著弱于Vc。在黑木耳多糖質量濃度為5 mg/mL時，Sp3清除率最高為81%，是Sp2的1.42倍、Sp1的1.96倍，因此說明隨著分子量的升高，多糖清除DPPH·的能力逐漸下降，最小分子量的多糖具有最強的抗氧化能力。何喜珍等[24]通過控制降解條件得到不同分子量的大豆多糖樣品，并分別測定比較了四種多糖抗氧化活性，結果表明四種大豆多糖都有一定的抗氧化活性，但小分子量的285 ku大豆多糖對自由基的清除能力最強，還原能力最強。

2.3.4 不同分子量黑木耳多糖對·OH的清除作用

圖4 不同分子量黑木耳多糖對·OH的清除作用Fig.4 Scavenging effects of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weight on ·OH

羥基自由基是毒性最強的活性氧自由基，幾乎能和所有的細胞成分發(fā)生反應，且反應速度很快，是生物體內過氧損傷的主要因素。試驗研究了三種不同分子量的黑木耳多糖清除·OH的能力，結果如圖4所示。

由圖4可知，不同分子量段黑木耳多糖對于·OH均具有顯著的清除作用，并且呈明顯的量效關系。當三種分子量段的木耳多糖濃度為1 mg/mL時，對·OH清除率最低，當多糖濃度達到5 mg/mL時，對·OH清除率達到最大，其中 Sp3對·OH清除率顯著增加到50.56%，提高了 5.15倍，Sp2對·OH清除率增加到30.75%，提高了2.23倍，Sp1對·OH清除率顯著增加到15.12%，提高了2.78倍。與抗氧化劑Vc相比，三種不同分子量的黑木耳多糖的清除能力均低于 Vc對·OH的清除能力。黑木耳多糖具有抑制和清除·OH的能力，主要是由于多糖分子中的醇羥基能夠螯合金屬離子，從而抑制了金屬離子催化過氧化氫產生·OH的反應[25]。同時從圖中還可以看出，分子量的大小對黑木耳木耳多糖清除·OH的能力具有顯著影響，Sp3具有最高的·OH清除能力，Sp2次之，Sp1最差。不同分子量黑木耳多糖清除能力存在差異的原因可能是多糖大分子在溶液中的構象不同，導致發(fā)揮活性的醇羥基的數量不同，因此導致清除·OH的能力也有所不同。

2.3.5 不同分子量黑木耳多糖對 O2-·的清除作用

超氧陰離子是反應性氧中間物的一種，是其他活性氧的前體，能導致DNA損傷和細胞死亡，因此，清除超氧陰離子自由基在抗氧化過程中起著重要的作用，不同分子量的中性黑木耳多糖對超氧陰離子的清除能力見圖5。

圖5 不同分子量黑木耳多糖對O2-·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weight on O2-

鄰苯三酚在堿性條件下可發(fā)生自氧化反應釋放O2-·，并生成有色中間產物，該有色中間產物在325 nm波長處有特征吸收峰，黑木耳多糖中的活性氫與O2-·反應生成水，終止O2-自由鏈基反應，從而阻止中間產物的積累[26]。圖 5反映了 Sp1、Sp2、Sp3對于O2-·的清除能力。從圖中可知，三種黑木耳多糖對O2-·的清除能力均與劑量濃度呈正相關。總體來說，三個分子量段的黑木耳多糖清除O2-·的能力強弱順序為：Sp2、Sp3、Sp1，但三種分子量的黑木耳多糖清除O2-·的能力均弱于Vc對O2-·的清除能力。在試驗濃度范圍內，Sp1的清除率從6.01%上升至19.80%，Sp2的清除率從 9.92%上升至 65.41%，Sp3的清除率從5.34%上升至45.37%。結果表明Sp2具有更好的O2-·清除功能。這可能是由于低分子量的多糖具有更多的醛酮類強電基團，且Sp2含量比Sp1高，因而具有更強清除 O2-·能力。

2.3.6 不同分子量黑木耳多糖總還原能力的比較

具有還原力的物質是通過提供氫原子來破壞自由基反應鏈，從而達到抗氧化的目的[27]。Sp1、Sp2和Sp3三種多糖總還原能力測定結果如圖6所示。

圖6 不同分子量黑木耳多糖的還原能力Fig.6 Reducing capacity of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weight

從圖6中可以看出，在試驗濃度范圍內，總還原力隨著多糖的濃度升高而增強。與Vc相比，三種不同分子量的黑木耳多糖還原能力均低于Vc的還原能力。

當質量濃度為5 mg/mL時，總還原能力大小順序為Sp2、Sp3、Sp1，小分子量的黑木耳多糖具有較強還原金屬離子的能力，這可能是由于相對分子量較小的黑木耳多糖結構松散，氫鍵作用弱，活性醛基易暴露在外，能夠提供更多電子，且大分子量黑木耳多糖黏度大不利于發(fā)揮功能，相對分子量小的多糖更容易結合活性位點[28]。劉紅輝等[29]采用超聲輔助H2O2-Vc體系降解紫球藻胞外多糖，并用Sepharose6B對其進行分離，得到3種不同分子量的多糖，通過鐵氰化鉀法測定其還原力發(fā)現，紫球藻多糖各組分的總還原能力隨多糖分子量的增大而不斷減小。

2.4 不同分子量黑木耳多糖體外抗氧化能力比較

本試驗通過計算得出3種不同分子量的中性黑木耳多糖各抗氧化指標的 IC50值（半數清除率），并與抗氧化劑Vc及中性未脫色黑木耳多糖進行比較，試驗結果見表3。

表3 不同分子量黑木耳多糖抗氧化指標IC50值比較Table 3 Antioxidant indexes (IC50) of Auricularia auricula polysaccharides with different molecular weight

由表3可知，具有較大分子量的Sp1對于抗氧化指標的清除能力均顯著低于其他兩種多糖，且除DPPH·外，其余4種抗氧化指標的IC50均要高于中性未脫色黑木耳多糖。綜上所述，低分子量的黑木耳多糖具有更高的抗氧化活性。黑木耳多糖的分子量大小對生物活性的影響存在相關性，結構決定理化性質，分子體積較大，黏度過大不利于反應，分子體積較小耦合活性位點能力強，但太小無法形成聚合結構，從而影響活性。由于Sp3在中性未脫色黑木耳多糖中的含量較低，且相對分子量過低，故為考慮生產的可行性與便利性，也可選擇抗氧化性能比較好的Sp2量產。

2.5 黑木耳多糖分子量分級與抗氧化能力的相關性

為進一步研究不同分子量黑木耳多糖與抗氧化能力之間的相關性，特通過SPSS統(tǒng)計學軟件分析比較，相關性結果見表4。

表4 黑木耳多糖分子量分級與抗氧化能力的相關性Table 4 Correlation between grading molecular weight and antioxidant capacity of Auricularia auricula polysaccharides

由表 4可知，三種不同分子量的黑木耳多糖與ABTS+·清除能力、DPPH·清除能力、·OH清除能力、O2-·清除能力、總還原力之間均存在相關性（p＜0.05），其中 Sp3與各抗氧化指標間存在極顯著相關（p＜0.01），其中 Sp3 與 ABTS+·相關性是 0.942（p＜0.01），與 DPPH·相關性是 0.994（p＜0.01），與·OH相關性是 0.962（p＜0.01），與 O2-·相關性是 0.991（p＜0.01），與總還原力相關性是0.998（p＜0.01），Sp3與各抗氧化指標間相關性最強，其中Sp1與ABTS+·相關性是 0.871（p＜0.05），與 DPPH·相關性是 0.882（p＜0.05），與·OH 相關性是 0.884（p＜0.05），與 O2-·相關性是 0.816（p＜0.05），與總還原力相關性是 0.832（p＜0.05），Sp1與各抗氧化指標間相關性最弱，由此可以看出相關性分析結果與上述抗氧化活性試驗結果一致?？梢哉f明小分子量的黑木耳多糖含量的多少與黑木耳多糖抗氧化能力的強弱呈正相關，但是由圖 1可知，黑木耳多糖中大分子量多糖占很大比例，因此為開發(fā)具有較強抗氧化功能的黑木耳多糖可以通過對木耳多糖進行降解處理，提高小分子量黑木耳多糖含量從而優(yōu)化抗氧化木耳多糖的應用。此外研究報道多糖的抗氧化活性并非僅與分子量相關，還與多糖的黏度、溶解度、糖苷鍵的構型、單糖組成、多糖構象以及連接點類型等因素有關[30]，一般來說具有β-螺旋型立體結構的多糖抗氧化活性較高，有可拉伸帶狀或皺紋型帶狀的多糖抗氧化活性較低甚至沒有，而且多糖的水溶性提高，其活性功能也會提高，因此黑木耳多糖的體外抗氧化性理論上也是這些因素綜合作用的結果。此外黑木耳多糖的體內抗氧化機理要比體外抗氧化復雜得多，如類胡蘿卜素等物質體外抗氧化能力弱，但卻具有一定體內抗氧化作用，這與多糖及蛋白質等生物大分子體內締合聚集所形成的微環(huán)境密切相關，因此黑木耳多糖的體內抗氧化機理有待進一步研究。

3 結論

本論文結果表明提取溶劑酸堿性和多糖分子量對黑木耳多糖的制備和抗氧化功能有顯著的影響。酸性和堿性溶劑均能夠提高黑木耳多糖的得率，而且酸性條件有利于多糖的純化。同時六種黑木耳多糖均具有一定的抗氧化活性，其中中性未脫色黑木耳多糖的抗氧化活性最好。不同分子量中性未脫色黑木耳多糖抗氧化試驗表明，小分子量的Sp3抗氧化活性最好，與Vc的抗氧活性相近，相關性分析結果進一步證明，小分子量多糖與抗氧化功能相關性最顯著。本實驗研究的結果為東北黑木耳的精深加工以及開發(fā)天然抗氧化劑的開發(fā)提供了科學數據。

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