蘇暢，竇曉，葉新，馬瑩瑩，楊建剛

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢 643000）

中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒的釀造微生物包括酒醅微生物、窖泥微生物、大曲微生物和環(huán)境微生物等四大菌群微生物。不同菌群微生物在釀酒過程中的活動能夠左右白酒的品質(zhì)[1]大曲作為一種多酶多菌的微生態(tài)制品在白酒釀制中起糖化、發(fā)酵和增香的作用[2～4]。不同菌群微生物在釀酒過程中的活動能菌作為大曲微生物中的主要組成部分之一，對大曲的功能的形成有著不可或缺的作用，能夠生產(chǎn)糖化酶和蛋白酶等多種酶類以及有機酸等多種代謝產(chǎn)物[5]。在大曲研究中，發(fā)現(xiàn)了很多與白酒風味有關(guān)的功能菌。張應蓮從醬香型大曲中分離到一株白地霉，研究了它的產(chǎn)蛋白酶特性，其在最適條件下蛋白酶活力可達到3387.61 U/mL，在發(fā)酵過程中為降解蛋白質(zhì)和提供香味物質(zhì)有一定作用[6]。曲霉在高溫大曲中常見，能夠產(chǎn)生糖化酶，通過誘變的黑曲霉UV-11具有更高的糖化酶活力，在中型實驗中降低了用曲量和提高了出酒率[7]。紅曲霉在代謝過程中會產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等，而且具有較高酯化酶活力，可增加白酒中酯的含量，提高白酒的品質(zhì)[8]。

傳統(tǒng)的霉菌鑒定方法建立在菌株的形態(tài)、生理特性和生物化學特性質(zhì)差異之上。然而這些特征會受培養(yǎng)條件的影響，在某種程度上具有不確定性，為確保鑒定結(jié)果的可靠性，鑒定一株菌經(jīng)常需要完成50～100項實驗[9]。費時費力且重復性不高。分子生物學方法應用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析使得對環(huán)境樣品中占大多數(shù)的不可培養(yǎng)微生物的研究成為了可能。

由于功能上高度保守，序列上的不同位置具有不同的變異速率，核糖體RNA（rRNA）是目前在微生物分子生態(tài)學上最為有用以及應用最廣泛的分子標記，通過序列比對，可以分析不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。目前，較為常用的分析微生物群落結(jié)構(gòu)的方法大多是建立在對于小亞基上的全長或某個片段進行擴增的基礎(chǔ)上的[10]。本研究通過對不同時期大曲中分離的霉ITS4/5 rRNA區(qū)序列進行分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(BLAST)，比較供試菌株與已知霉菌相應序列的同源性。依據(jù)分離鑒定的結(jié)果對大曲生產(chǎn)過程中的霉菌的演替規(guī)律進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

大曲取自瀘州老窖制曲生態(tài)園，對生產(chǎn)過程中0、3、5、7、10、25、90 d的大曲進行采集。在形態(tài)學觀察的基礎(chǔ)上，挑取了193株霉菌進行ITS4/5 rRNA區(qū)的序列測序與比對。

1.1.2 儀器試劑

基因擴增儀（GT9612），杭州柏恒科技有限公司；離心機（CF15R），日立集團；電泳儀（JK600C），北京君意東方電泳設備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)AlphaInnotech，美國Alpha公司。Taq PCR Master Mix，引物27f，1492r均購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。Tris，SDS，EDTA，醋酸鉀，氯仿異戊醇，異丙醇，乙醇均購自北京華奧正生科技有限公司；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH）121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 霉菌分離

在瀘州老窖制曲生態(tài)園中采取第0、3、5、7、10、25、90 d的大曲，每個時期的大曲雜碎混勻后取50 g加入到450 mL無菌水里面充分混勻后，吸取1 mL混合液到裝有9 mL無菌水的試管中，依次做成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五個梯度，然后再用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH）進行平板分離。對培養(yǎng)好的平板進行計數(shù)，并根據(jù)菌落形態(tài)差異進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 總DNA的提取

絲狀真菌是接種環(huán)挑取一環(huán)純化后的霉菌菌體（緊貼培養(yǎng)基挑?。?，接入到含有500 μL 75%乙醇的1.5 mL離心管中（CTAB法）。5000轉(zhuǎn)離心1 min，收集菌體到管底，倒掉酒精。（如果顏色較深，多用75%乙醇洗滌幾次，洗去色素，以免影響PCR結(jié)果?？梢苑湃?20 ℃和室溫長期保存）在離心管中加入1～2 g石英砂，用牙簽或槍頭攪拌，將石英砂同菌體混勻，加入液氮，用安裝玻璃鉆頭的手電鉆攪拌石英砂，磨碎菌體，破除霉菌細胞壁。（轉(zhuǎn)速不要過快，以免發(fā)熱影響DNA提取率）。加入500 μL月桂酸鈉，震蕩搖勻10 min，在通風櫥中加入250 μL氯仿異戊醇，加入250 μL的Tri飽和酚，震蕩搖勻5 min，13000轉(zhuǎn)離心10 min。吸取上清液500 μL，通風櫥內(nèi)加入等體積的異丙醇，-20 ℃放置30 min或1 h，13000 r/min離心15 min，倒掉上清液，管底微小沉淀即為DNA，加入75%乙醇緩慢轉(zhuǎn)動離心管洗滌DNA后倒掉乙醇，共洗滌2次。65 ℃水浴30 min，烘干乙醇，加入100 μL ddH2O，即為模板DNA。在4 ℃下溶解2 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增和測序

PCR擴增ITS4/5 rRNA基因區(qū)：絲狀真菌采用真菌 ITS基因的通用引物：Its5的堿基序列為5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，Its4堿基序列5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，提取與擴增方法見阮云杰擴增反應條件[11]：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72℃ 45 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 8 min。PCR反應產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測：取3 μL PCR擴增原液點樣于 1%的瓊脂糖凝膠，電泳，溴化己錠(EB)染色后在紫外燈照射下確定是否擴出所要片段。ITS4/5 rRNA區(qū)擴增出單一明亮條帶，片段大小約為700～800 bp。

1.2.4 DNA序列分析方法

DNA序列分析：用DNA Star軟件并結(jié)合DNA正反向序列圖譜對DNA序列進行拼接和校正。將校正后的序列在國際核酸數(shù)據(jù)庫(http：www.ncbi.nlm.nih.gov.blast)中進行同源序列搜索，初步確定受試菌株的分類地位，一般在ITS4/5 rRNA區(qū)可以按如下經(jīng)驗值判斷：(1)與最近緣種的模式菌株相似率為100%，可確定為同一種；(2)與最近緣種的模式菌株的相似率＜98%，可初步確定為新種；(3)與最近緣種的模式菌株的相似率在99%～100%之間，它們的關(guān)系要視不同的情況而定，除考慮序列差異外，還應考慮生理生化性狀差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 ITS4/5 rRNA基因區(qū)序列的擴增

圖1 ITS4/5 rRNA基因區(qū)序列的擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoresis map of the amplified product of ITS4/5 rRNA gene sequence

在對分離的193株菌的ITS4/5區(qū)序列進行了PCR擴增，下圖為部分樣品PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，顯示產(chǎn)物的長度都在700～800 bp之間的中間位置，這與絲狀真菌的ITS4/5區(qū)域序列長度為750 bp左右相符合，說明擴增正常（圖1）。

2.2 ITS4/5區(qū)序列的比對

通過對分離的193株絲狀真菌的ITS4/5基因區(qū)序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(BLAST)后，按照上邊論述的要求，將相似度大于97%鑒定為同一種，下表為經(jīng)過ITS4/5基因序列比對后，不同類型菌株在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索后的結(jié)果。由于總體數(shù)量較多不能一一呈現(xiàn)，表1中為鑒定到種的菌株每個種選取一株菌株的序列比對結(jié)果。

2.3 基于ITS4/5基因區(qū)序列構(gòu)建M-L系統(tǒng)樹

用軟件MEGA6.06對所有序列進行比對后，刪除兩端未對齊的堿基生成進化樹，并進行 1000次的Bootstraps檢驗。采用“Maximum Likelihood Tree”方法顯示進化樹（結(jié)果見圖2）。構(gòu)建了不同菌株的模式菌株的M-L系統(tǒng)樹如圖2所示，通過系統(tǒng)發(fā)育樹的建立對大曲中分離出的不同類型的絲狀真菌的種間親緣關(guān)系進行了直觀界定。從圖中可以看出，不同種屬微生物間的差異很明顯。通過與前面高通量結(jié)果比較可知，大曲發(fā)酵過程中占優(yōu)勢的絲狀真菌有：紅曲霉(Aspergillus ruber)，米根霉(Rhizopus oryzae)，微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)，Rhizopus azygosporus，Aspergillus fumigatus，嗜熱子囊菌(Thermomyces lanuginosus)，謝瓦氏曲霉(Aspergillus salwaensis)，Aspergillus chevalieri，米曲霉(Aspergillus oryzae)。

圖2 基于ITS4/5區(qū)序列構(gòu)建的M-L系統(tǒng)樹Fig.2 M-L phylogenetic tree established based on ITS4/5 sequence

表1 不同種菌株ITS4/5基因區(qū)在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對結(jié)果Table 1 The results of homologous sequences comparison in Genbank database of different strains of ITS4/5 gene area

分離時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期（90 d）大曲中的絲狀真菌中的主要霉菌有微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)，Aspergillus chevalieri和橫梗霉(Lichtheimia ramose)。前兩種微生物的分離結(jié)果與高通量分析結(jié)果一致，而Lichtheimia ramose只在高通量多樣性分析的科水平上出現(xiàn)，說明橫梗霉(Lichtheimia ramose)確實存在，只不過高通量數(shù)據(jù)在屬以及種水平上鑒定時精度大幅降低，又把這類微生物給遺漏了。

2.4 不同時期大曲霉菌的分布規(guī)律

圖3 不同時期大曲中霉菌的分布Fig.3 The Distribution of Mold in Daqu in Different Periods

根據(jù)對193株酵母菌的ITS4/5區(qū)序列比對鑒定的結(jié)果以及前期平板計數(shù)的結(jié)果對不同時期大曲中的霉菌進行統(tǒng)計分析。如圖3所示，大曲生產(chǎn)頂溫期（7～10 d）霉菌的種群數(shù)量較多，其數(shù)量也較多，推測原因可能是部分霉菌都比較耐高溫，而其他酵母或者細菌在高溫下種群數(shù)量都一定程度的減少，使得霉菌在大曲的水分與養(yǎng)分方面沒有競爭。第30 d，霉菌的種群數(shù)量和數(shù)量都呈現(xiàn)大幅下降，推測原因可能是因為大曲的水分和養(yǎng)分開始減少影響了大部分霉菌的生長。第90 d大曲基本達到成品曲的水平，這時期微生物的種類很豐富，各種菌群達到了一種比較平衡的狀態(tài)。

3 結(jié)論

3.1 本文通過傳統(tǒng)的平板計數(shù)的方法對大曲培菌過程中的霉菌的種群變化進行了初步的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)頂溫區(qū)（7～10 d）霉菌數(shù)量最多，其次是在成品大曲（90 d），在頂溫區(qū)（7～10 d）主要以卷枝毛霉 F（Mucor circinelloides f. circinelloides）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）以及牛根毛霉（Rhizomucor tauricus），在成品大曲（90 d以后）主要是以多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）以及卷枝毛霉 F（Mucor circinelloides f.circinelloides），其中多枝橫梗霉（Lichtheimia ramose）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）在大曲整個培菌期間都呈穩(wěn)定趨勢，說明它們對大曲的品質(zhì)好壞起著至關(guān)重要的作用。呂梅等人從高溫大曲中分離的多枝橫梗霉，發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)酯酶的能力[12]，而且一些研究中發(fā)現(xiàn)多枝橫梗霉具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力[13,14]，該酶是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶[15]。作為纖維素酶水解纖維素過程中微小根毛霉最后一步關(guān)鍵酶，把纖維二糖和短鏈的纖維寡糖分解為可利用的葡萄糖[16,17]。而微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）在一些研究中則發(fā)現(xiàn)其有優(yōu)良的產(chǎn)淀粉酶能力[18,19]在60 d霉菌數(shù)量在整個培菌期間最少，主要是以多枝橫梗霉（Lichtheimia ramose）、Lichtheimia corymbifera。在第30 d主要以嗜熱子囊菌（Thermomyces lanuginosus）為主，在該期間主要處于大曲的打攏階段，即將曲塊轉(zhuǎn)過來集中且不留縫隙，存放 15～30 d。故推測該菌不光在耐高溫，可能在耐低氧濃度等方面也要優(yōu)于其他霉菌。從種類豐度方面來看，在第30 d霉菌的種類豐度是最低的，而在成品曲（90 d以后）種類豐度最高，這也進一步說明，曲房氧濃度對于霉菌的生長繁殖至關(guān)重要。

3.2 目前，對微生物的研究主要分為表型特征鑒定法和基因型鑒定法。表型特征鑒定法是與微生物分離相結(jié)合的，這種方法工作量大，準確率低，但是能得到活的菌株，利于后續(xù)研究。如Chang-lu Wang等通過表型特征鑒定法對茅臺大曲中的微生物進行了系統(tǒng)的分離鑒定[20]?；蛐丸b定法多是對樣品進行總 DNA的提取之后，通過對微生物通用保守序列的比對，從而可以分析鑒定出樣品中可培養(yǎng)以及不可培養(yǎng)的微生物，具有快速準確等優(yōu)點，但是多數(shù)得不到活的菌株，不利于后續(xù)深入研究。人們采用基因型鑒定法對微生物的群落研究應用已經(jīng)很廣泛，Jia Zheng等采用DGGE與PLFA結(jié)合的方法現(xiàn)代分子生物學的方法對不同窖齡窖泥的微生物進行了分析研究[21]；Zhang Liqiang等運用PCR-DGGE技術(shù)解析了不同類型大曲中微生物的組成差異[22]，但是大曲中仍然存在很多不可培養(yǎng)的微生物，它們的存在影響著大曲的品質(zhì)。所以不論是傳統(tǒng)的表型特征鑒定方法還是現(xiàn)代的分子生物學方法都有著自身的優(yōu)缺點。由于微生物極其微小，區(qū)別于動植物單純的通過表型特征是不能將它們進行確切分類的。

3.3 雖然目前隨著各種分離技術(shù)的進步，能分離出來的微生物越來越多，但是在實驗室條件下能分離出來的微生物仍占不到環(huán)境微生物的10%[23～26]。因此對環(huán)境微生物群落的研究不能局限在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，必須結(jié)合現(xiàn)代分子生物學的方法，這樣才能對可培養(yǎng)微生物和非可培養(yǎng)微生物有一個系統(tǒng)的認識。

[1]李欣,王彥華,林靜怡,等.高通量測序技術(shù)分析醬香型白酒酒醅的微生物多樣性[J].福建師范大學學報(自然科學版),2017,33(1)：51-59 LI Xin, WANG Yan-hua, LIN Jing-yi, et al. Analysis of Maotai liquor fermented grains of microbial diversity of high-throughput sequencing technology [J]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition), 2017, 33(1)：51-59

[2]任飛,周紅海,韓珍瓊.夏季濃香型大曲生產(chǎn)的工藝控制[J].釀酒科技,2007,8：56-58 REN Fei, ZHOU Hong-hai, HAN Zhen-qiong. Process control of Luzhou flavor Daqu production in summer [J].Liquor-Making Science & Technology, 2007, 8：56-58

[3]許德富,沈才萍.制約大曲質(zhì)量品質(zhì)的條件剖析及前景展望[J].釀酒科技,2003,30(5)：33-34 XU De-fu, SHEN Cai-ping. The condition analysis and prospect of restricting Daqu quality and quality [J].Liquor-Making Science & Technology, 2003, 30(5)：33-34

[4]唐玉明,沈才洪.酒曲理化品質(zhì)指標相關(guān)性探討[J].釀酒科技,2006,7：37-41 TANG Yu-ming, SHEN Cai-hong. Investigation on the correlations of physiochemical indexes of starter [J].Liquor-Making Science & Technology, 2006, 7：37-41

[5]余偉民,曾志,吳生文,等.紅曲霉對特香型白酒風味風格物質(zhì)影響[J].中國釀造,2012,31(3)：87-91 YU Wei-min, ZENG Zhi, WU Sheng-wen, et al. Influence of Monascus on the style and flavor components of special-flavor liquor [J]. China Brewing, 2012, 31(3)：87-91

[6]張應蓮,黃永光,邱樹毅.醬香大曲中白地霉產(chǎn)蛋白酶固態(tài)發(fā)酵條件及其優(yōu)化[J].中國釀造,2012,31(3)：35-38 ZHANG Ying-lian, HUANG Yong-guang, QIU Shu-yi.Solid-state fermentation condition and its optimization of protease production by Geotrichum candidum in Moutai-flavor Daqu [J]. China Brewing, 2012, 31(3)：35-38

[7]天津釀酒廠.試用黑曲霉UV-11生產(chǎn)白酒小結(jié)[J].黑龍江發(fā)酵,1978,4：38-45 Tianjin brewery. Production of white wine by Aspergillus niger UV-11 [J]. Heilongjiang Fermentation, 1978, 4：38-45

[8]趙東,胡曉龍,彭志云,等.淺談紅曲霉在白酒中的應用[J].釀酒,2010,37(2)：11-13 ZHAO Dong, HU Xiao-long, PENG Zhi-yun, et al.Elaborates the application of monascus in liquor industry [J].Liquor Making, 2010, 37(2)：11-13

[9]Lin C C S, Fung D Y. Conventional and rapid methods for yeast identification [J]. Crit. Rew. Microbiolo., 1987, 14(4)：273-289

[10]李曉然.基于核糖體 RNA高通量測序分析微生物群落結(jié)構(gòu)[D].上海：復旦大學,2011 LI Xiao-ran. Using ribosomal RNA pyrosequencing to explore the microbial community structure [D]. Shanghai：Fudan University, 2011

[11]阮運杰.DNA凝膠電泳分析系統(tǒng)研究[D].哈爾濱：哈爾濱工程大學,2012 RUAN Yun-jie. Analysis system of DNA gel electrophoresis[D]. Harbin：Harbin Engineering University, 2012

[12]呂梅,陳茂彬,鎮(zhèn)達.濃香型大曲產(chǎn)酯酶菌株HSM的分離及產(chǎn)酶營養(yǎng)條件研究[J].釀酒科技,2014,1：12-15,20 LV Mei, CHEN Mao-bin, ZHEN Da. Isolation of esterase-producing strain HSM from strong-flavor daqu and study on its esterase-producing nutritional conditions [J].Liquor-Making Science & Technology, 2014, 1：12-15, 20

[13]Garcia N F L, Santos F R D S, Gon?alves F A, et al.Production of β-glucosidase on solid-state fermentation by Lichtheimia ramosa, in agro industrial residues：Characterization and catalytic properties of the enzymatic extract [J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2015, 18(4)：314-319

[14]Gon?alves F A, Leite R S R, Rodrigues A, et al. Isolation,identification and characterization of a novel high level β-glucosidase-producing Lichtheimia ramosa strain [J].Biocatalysis & Agricultural Biotechnology, 2013, 2(4)：377-384

[15]Edwin Clifford Webb. Enzyme nomenclature：recommendations of the nomenclature committee of the international Union of biochemistry and molecular biology on the nomenclature and classification of enzymes [M]. San Diego：Academic Press, 1992

[16]曾青蘭.纖維素酶研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學,2007,6：42-46 ZENG Qing-lan. Research progress of cellulase [J]. Modern Agricultural Sciences, 2007, 6：42-46

[17]鄔敏辰,鄭建豐.黑曲霉液體發(fā)酵纖維素酶的研究[J].釀酒科技,1998,3：25-28 WU Min-chen, ZHENG Jian-feng. Study on the culture conditions of Aspergillus to produce cellulose [J].Liquor-Making Science & Technology, 1998, 3：25-28

[18]Turchi S L, Becker T. Improved purification of α-amylase isolated from Rhizomucor pusillus, by affinity chromatography [J]. Current Microbiology, 1987, 15(4)：203-205

[19]任勰珂,陳莉,盧紅梅,等.茅臺地區(qū)醬香型酒糟中高溫真菌的分離鑒定[J].中國釀造,2017,36(2)：69-74 REN Xie-ke, CHEN Li, LU Hong-mei, et al. Isolation and identification of thermophilic fungi from Moutai-flavor vinasse in Moutai area [J]. China Brewing, 2017, 36(2)：69-74

[20]Chang-lu Wang, Dong-jian Shi, Guo-li Gong.Microorganisms in Daqu：a starter culture of Chinese Maotai-flavor liquor [J]. World J Microbiol Biotechnol, 2008,24(10)：2183-2190

[21]Jia Zheng, Ru Liang, Liqiang Zhang, et al. Characterization of microbial communities in strong aromatic liquor fermentation pit muds of different ages assessed by combined DGGE and PLFA analyses [J]. Food Research International,2013, 54：660-666

[22]Zhang Liqiang, C Wu, X Ding, et al. Characterizations of microbial communities in Chinese liquor fermentation starters Daqu using nested PCR-DGGE [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2014, 30(12)：3055-3063

[23]Lane D J. Nucleic acids techniques in bacterial systematic[M]. New York：John Wiley & Sons, 1991

[24]Thompson J R, Marcelino L A, Polz M F. Heteroduplexes in mixed-template amplifications：formation, consequence and elimination by ‘reconditioning PCR’ [J]. Nucleic Acids Research, 2002, 30(9)：2083-2088

[25]Hamady M, Walker J J, Harris J K, et al. Error-correcting bar coded Primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex [J]. Nature Methods, 2008, 5(3)：235-237

[26]Suzuki M T, Taylor L T, DeLong E F. Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial populations via 5’-nuclease assays [J]. Applied Environmental Microbiology, 2000, 66(11)：4605-4614