王祖浩，郭勇，周美含，劉春雷，方麗，閔偉紅

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）（2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春 130118）

氧化還原反應是人體內(nèi)進行的一種生理化學反應，人體在代謝過程中，會產(chǎn)生大量活性氧自由基，同時體內(nèi)的氧化防御系統(tǒng)會清除活性氧自由基。正常情況下，健康人體抗氧化防御能力健全，防御系統(tǒng)處于動平衡狀態(tài)，即人體內(nèi)氧化自由基的產(chǎn)生和被清除處于動態(tài)平衡的狀態(tài)[1]。然而，一旦人體產(chǎn)生大量活性氧自由基或抗氧化防御體系出現(xiàn)紊亂時，大量的活性氧自由基不能被及時清除，這種動態(tài)平衡就會被打破，造成機體氧化損傷，導致衰老，甚至發(fā)生臟器病變、細胞死亡、組織受損、糖尿病和冠狀動脈硬化等許多慢性疾病[2,3]。近年來，國內(nèi)外利用動物或植物蛋白通過酶控制水解技術制備獲得了較好抗氧化作用的多肽，例如：玉米蛋白肽[4]、花生仁蛋白肽[5]和牛乳酪蛋白[6]等[7]。榛子富含脂肪 59.1%～69.8%、蛋白質(zhì)14.1%～18.0%、碳水化合物 6.5%～9.3%、膳食纖維8.2%～9.6%及多種礦物質(zhì)，其蛋白質(zhì)含包括人體8種必需氨基酸在內(nèi)的20余種氨基酸，是優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，亦是制備功能肽的食源性蛋白[8,9]。目前，抗氧化肽已成為活性肽研究中的熱點，研究人員已從動植物蛋白中篩選出了一些具有較強抗氧化活性的天然抗氧化肽。本實驗室在前期工作中通過酶法定向水解制備多肽、Sephadex G-25、Sephadex G-15、反相高效液相色譜分離純化、質(zhì)譜鑒定和化學合成獲得長白山榛仁蛋白五肽Ala-Trp-Asp-Pro-Glu，在此基礎上，本研究通過化學和細胞模型等方法，研究其對自由基的清除作用及對HUVEC細胞氧化應激損傷的保護作用，為長白山地區(qū)榛子蛋白資源的深度開發(fā)提供理論依據(jù)，促進優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源的高效利用。

1 材料與設備

1.1 實驗原料

Ala-Trp-Asp-Pro-Glu肽：北京中科亞光生物科技有限公司合成，純度96.87%。

1.2 試劑及來源

DPPH、抗壞血酸（Vc）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、二甲基亞砜(DMSO)、四氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；RPMI·1640培養(yǎng)液、雙抗、EDTA胰酶、胎牛血清、PBS溶液購自美國Gibco公司；HUVEC細胞、上海中喬新舟生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設備

高速冷凍離心機（Z36HK），HERMLE公司（德國）；酶標儀（SPECTRA MAX 190），美國（Molecular Devices）；紫外可見分光光度計（UV-1700），日本島津；CO2細胞培養(yǎng)箱（CB150），德國BINDER公司；熒光倒置顯微鏡（IX53），日本Olympus公司；超凈工作臺（AIRTECH），蘇州安泰空氣技術有限公司；等常用儀器設備。

1.4 試驗方法

1.4.1 榛仁活性肽制備

以長白山脫脂榛仁粉為原料，采用堿溶酸沉法制備分離蛋白，利用堿性蛋白酶酶解制備抗氧化肽，經(jīng)過Sephadex G-25、Sephadex G-15、RP-HPLC三步純化后，通過質(zhì)譜鑒定出分子量為 616.63 u的Ala-Trp-Asp-Pro-Glu榛仁肽，最后由北京中科亞光生物科技有限公司合成純度為96.87%五肽。

1.4.2 AWDPE對體外自由基清除能力的測定

1.4.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照謝正軍的試驗方法[10]。

DPPH 清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

1.4.2.2 ABTS+·自由基清除能力的測定

參照Kong B的試驗方法[11]。

ABTS 清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

1.4.3 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)培養(yǎng)

取得原代HUVEC細胞，將其培養(yǎng)瓶放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，待其生長穩(wěn)定后，進行繼續(xù)培養(yǎng)（細胞培養(yǎng)液：10%培養(yǎng)液：90 mL 1640培養(yǎng)液+10 mL胎牛血清+2 mL雙抗），細胞傳代，細胞凍存（細胞凍存液：1640培養(yǎng)液：胎牛血清：DMSO=6：3：1）處理。選擇生長狀態(tài)良好4～9代細胞進行試驗。

1.4.4 MTT法檢測AWDPE對HUVEC細胞的毒性作用

選取對數(shù)期生長良好的 HUVEC細胞用胰酶消化，用10%培養(yǎng)液制成密度為1×105個/mL細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，三個平行樣，空白對照組和劑量組（樣品終濃度分別為0、1、10、50、100、500、1000 μg/mL），于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h后，加入MTT溶液（終濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，震蕩10 min至甲臜結晶完全溶解，酶標儀測A570nm值。

細胞存活率%=(A樣品組/A空白對照組)×100%。

1.4.5 HUVEC細胞氧化損傷模型的建立

實驗分空白對照組、AngⅡ組（計量終濃度梯度為 0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L），于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)不同時間（0、2、4、6、8 h）[12]，其他操作同1.4.4。

1.4.6 AWDPE對AngⅡ氧化損傷HUVEC細胞的保護作用

實驗分空白對照組、AngⅡ損傷組和樣品保護組，選取對數(shù)期生長良好的HUVEC細胞用胰酶消化，用10%培養(yǎng)液制成密度為 1×105個/mL細胞懸液，以 1 mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞完全貼壁生長后（約接種24 h），饑餓培養(yǎng)4 h后，樣品保護組加入AWDPE溶液（樣品終濃度分別為1、10、50、100、500、1000 μg/mL），培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，AngⅡ損傷組和樣品保護組分別加入終濃度為10-7mol/L AngⅡ，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)6 h，其他操作同1.4.4。

1.4.7 分析AWDPE對HUVEC細胞內(nèi)各種抗氧化酶的影響

按照南京建成生物工程研究所，MDA、LDH、CAT、T-SOD、GSH-PX、總蛋白定量試劑盒進行實驗。

1.4.8 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 AWDPE對DPPH、ABTS+·自由基清除能力的分析

Hernández等[23]人研究發(fā)酵乳中抗氧化肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)His、Pro（疏水性氨基酸）可顯著提高抗氧化肽的抗氧化活性，Trp（疏水性氨基酸）、Tyr對ABTS+自由基清除的貢獻最大，因為這類氨基酸的吲哚基和苯環(huán)可供氫。本研究中AWDPE清除ABTS+自由基活性能力較強，可能是與其含有的Trp和Pro有關。另外，Ali Bougatef等[24]人利用沙丁魚副產(chǎn)物水解分離出的抗氧化肽，研究其抗氧化功能，利用DPPH自由基清除能力檢驗其抗氧化能力。本研究中AWDPE所含有的氨基酸與其所研究的活性肽含有的氨基酸成分部分一致。

2.2 AWDPE對HUVEC細胞的毒性作用

圖2為利用MTT試驗法，考察AWDPE對HUVEC細胞的毒性作用。由圖可知，以空白對照組的細胞存活率為100%，除50 μg/mL濃度外，不同濃度AWDPE對細胞存活率的影響與空白組相比并無差異顯著性，說明AWDPE對HUVEC細胞無毒性作用，對HUVEC細胞的生長繁殖亦無促進作用，對細胞生長是安全的。50 μg/mL濃度雖然細胞存活率升高，具有差異顯著性，但細胞存活率升高并不大，與不同濃度 AWDPE其他組分的細胞存活率相比并無差異顯著性。

圖1 AWDPE對DPPH、ABTS自由基清除作用Fig.1 The scavenging effect of AWDPE on DPPH and ABTS radicals

圖2 不同濃度AWDPE對HUVEC細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of AWDPE on the survival rate of HUVEC cells

2.3 HUVEC細胞氧化損傷模型的建立

圖3考察不同濃度AngⅡ溶液，作用不同時間對HUVEC細胞存活率的影響。由圖可知，不同濃度AngⅡ溶液，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞存活率均呈現(xiàn)下降趨勢。當AngⅡ溶液濃度為10-3和10-4mol/L時，細胞存活率降低至空白組的0.202倍，說明該濃度對細胞刺激過于嚴重而導致細胞存活率低。當AngⅡ濃度為10-5、10-6、10-8和10-9mol/L，細胞存活率相差不大。而當AngⅡ濃度為10-7mol/L時，培養(yǎng)6 h和8 h時細胞存活率均為空白組的0.534倍，細胞損傷明顯且穩(wěn)定，本實驗誘導模型選擇濃度為10-7mol/L AngⅡ誘導HUVEC細胞損傷6 h。

圖3 不同濃度AngⅡ?qū)UVEC細胞存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of AngⅡon the survival rate of HUVEC cells

2.4 AWDPE對AngⅡ氧化損傷HUVEC細胞的保護作用

圖4 不同濃度AWDPE和10-7 mol/L AngⅡ?qū)UVEC細胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of AWDPE and 10-7 mol/L of AngⅡon the survival rate of HUVEC cells

如圖4所示，AngⅡ損傷組細胞存活率為空白對照組的 0.45倍，表現(xiàn)出差異極顯著性（p＜0.01），說明終濃度為10-7mol/L的AngⅡ溶液處理細胞6 h后，對細胞產(chǎn)生了損傷作用。不同濃度AWDPE保護組與AngⅡ損傷組相比，細胞存活率均極顯著高于損傷組（p＜0.01），說明AWDPE對細胞產(chǎn)生了抗氧化保護作用。結合2.2實驗結論，證明了AWDPE對細胞的保護作用源于其自身的抗氧化性，與其他因素無關。本實驗選取50 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL 這3 個濃度的AWDPE溶液開展后續(xù)研究。

2.5 HUVEC細胞生長形態(tài)的變化

圖5 HUVEC細胞生長形態(tài)的變化Fig.5 The changes in the growth morphology of HUVEC cells

由圖5中可以看出，a表明正常生長的HUVEC細胞呈現(xiàn)出典型的菱形、多邊形和梭形鑲嵌排列，生長旺盛，大小均勻，邊緣清晰。b表明加入 AWDPE的細胞，生長狀態(tài)與a并無明顯差別，可見細胞呈現(xiàn)自身形態(tài)，展現(xiàn)細胞分裂過程。c表明經(jīng)AngⅡ刺激6 h后的細胞，生長數(shù)量明顯減少，大部分細胞胞體呈現(xiàn)圓形，出現(xiàn)聚縮現(xiàn)象，脫離培養(yǎng)瓶，懸浮于培養(yǎng)液中，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。d表明經(jīng)AWDPE處理后的細胞，在經(jīng)AngⅡ刺激6 h后，改變形態(tài)的細胞明顯減少，大部分還呈現(xiàn)良好的生長趨勢，說明 AWDPE對AngⅡ氧化損傷的HUVEC細胞具有的保護作用。

2.6 AWDPE對HUVEC細胞抗氧化酶的影響

詳見圖6a-e。乳酸脫氫酶（LDH）是一種穩(wěn)定的存在于所有細胞胞質(zhì)內(nèi)的糖酵解酶。一般情況下，LDH穩(wěn)定的存在于細胞質(zhì)內(nèi)部，但細胞受到刺激，胞膜受損后，LDH隨著受損情況而釋放出不同的量，進入到細胞培養(yǎng)液中，通過檢測培養(yǎng)液和細胞內(nèi) LDH含量，計算出LDH釋放率而推斷細胞的受損程度[16]。如圖6a所示，陰性對照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液對HUVEC細胞的氧化損傷非常明顯，細胞膜受損嚴重，LDH釋放率最高，達到42.26±2.23%，為空白組9.06倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護組處理后，100 μg/mL AWDPE保護組細胞內(nèi)LDH釋放率降低為27.14±1.16%，為陰性對照組0.62倍（p＜0.01），接近于陽性對照Vc組。這說明AWDPE處理后的細胞，細胞膜受損程度降低，大幅度提高細胞的生命力，保護細胞膜完整性，證明了AWDPE對于HUVEC細胞的氧化應激損傷的保護作用。

丙二醛（MDA）為過氧化脂質(zhì)中的產(chǎn)物，氧化過程中產(chǎn)生的MDA會攻擊細胞膜，而引起細胞損傷[17]。如圖6b所示，陰性對照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細胞，細胞內(nèi)MDA含量達到（4.15±0.22）nmol/mg，為空白組1.49 倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護組處理后，細胞內(nèi)MDA含量有所下降，500 μg/mL AWDPE保護組細胞內(nèi)MDA含量為（3.47±0.28）nmol/mg，為陰性對照組0.73倍，但無差異顯著性。這可能與細胞內(nèi)本身含有一定量的MDA有關，經(jīng)AWDPE保護后的細胞，產(chǎn)生的MDA含量有所降低，間接的說明了其在一定程度上阻止了細胞脂質(zhì)過氧化過程。

過氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，其處于所有已知動物的各個組織中[18]。如圖 6c所示，陰性對照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細胞中，CAT含量最低為（1.94±0.18）U/mg，為空白組0.54倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護組處理后，100 μg/mL AWDPE保護組細胞內(nèi) CAT含量為（2.34±0.11）U/mg，為陰性對照組1.39 倍(p＜0.05），證明了AWDPE具有一定的抗氧化性，降低了細胞內(nèi)CAT的消耗量，從而保護細胞的完整性，AWDPE對于HUVEC細胞的氧化應激損傷的保護作用。

總超氧化物歧化酶（T-SOD）是一種新型酶制劑，生物界分布廣泛，是一種重要的抗氧化劑，保護暴露于空氣中細胞免受氧化損傷[19,20]。如圖6d所示，陰性對照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細胞中，T-SOD 含量最低為(12.28±2.27)U/mg，為空白組0.28倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護組處理后細胞體內(nèi)，T-SOD含量隨著AWDPE濃度升高而隨之增加，呈濃度依賴性關系，100 μg/mL和500 μg/mL AWDPE保護組細胞內(nèi)T-SOD含量為（19.88±1.99）U/mg和（23.55±1.26）U/mg，為陰性對照組的 2.18倍（p＜0.01）和2.48倍（p＜0.01），說明細胞內(nèi)T-SOD消耗量少，進而證明AWDPE對于HUVEC細胞體氧化應激損傷的保護作用，保證細胞完整性。

圖6 不同濃度AWDPE、1 mg/mL Vc和10-7 mol/L AngⅡ?qū)UVEC細胞抗氧化酶的影響Fig.6 Effects of different concentrations of AWDPE, 1 mg/mL of Vc and 10-7 mol/L of Ang II on the antioxidant enzymes of HUVEC cells

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。它的生理功能主要是催化 GSH參與過氧化反應，清除在細胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而減輕細胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用[21,22]。如圖6e所示，陰性對照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細胞中，GSH-PX 含量最低為(22.2±2.99)nmol/L，為空白組 0.4 倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護組處理后的細胞體內(nèi)，GSH-PX含量隨著AWDPE濃度的升高而隨之增加，呈現(xiàn)濃度依賴性關系，500 μg/mL AWDPE保護組細胞內(nèi)GSH-PX含量為（33.9±2.75）nmol/L（p＜0.01），為陰性對照組的1.91倍。經(jīng)AWDPE保護的細胞中，GSH-PX含量減少，進一步證明了AWDPE對于HUVEC細胞的抗氧化保護作用，保證細胞的完整性。

本實驗對細胞內(nèi)抗氧化酶系的研究結果與曹小舟等[25]研究的小麥胚芽抗氧化肽和林松毅等[26]研究的松子抗氧化肽，在細胞水平上結果趨勢一致。證明了AWDPE肽可通過改變細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的含量，實現(xiàn)對HUVEC細胞氧化應激的保護作用，進而證明了AWDPE的抗氧化能力。

3 結論

3.1 AWDPE抗氧化肽對DPPH、ABTS+自由基清除能力呈現(xiàn)出濃度依賴性關系，證明其具有良好的抗氧化能力；除50 μg/mL外，不同濃度的AWDPE抗氧化肽對HUVEC細胞生長無抑制亦無促進作用，對細胞生長形態(tài)無影響，進而證明AWDPE對于細胞氧化應激損傷的保護作用源于其自身的抗氧化能力；AWDPE抗氧化肽保護組的細胞存活率極顯著高于AngⅡ氧化損傷組的細胞存活率，說明AWDPE抗氧化肽具有保護HUVEC細胞免受氧化損傷的能力和良好的抗氧化性，但其在50 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL細胞存活率變化不明顯，這與其在不同濃度下所作用的抗氧化酶活性有關，需進一步研究。

3.2 建立AngⅡ氧化刺激損傷HUVEC細胞模型，通過測定細胞內(nèi)抗氧化酶系，研究AWDPE對HUVEC細胞的保護和抗氧化能力，經(jīng) AWDPE處理后的HUVEC細胞內(nèi)LDH釋放率和MDA水平下降，CAT、T-SOD和GSH-PX水平升高，表明AWDPE可通過保護細胞內(nèi)重要的抗氧化酶系統(tǒng)降低細胞損傷，增強HUVEC應對氧化應激損傷的能力。

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