文/魏凱 楊華蓮 韓姝伊 陳春山

細鱗鮭是國產名貴的冷水性魚類，也是列入農業(yè)農村部珍稀水生動物增殖放流計劃的魚類，主養(yǎng)區(qū)在東北和華北地區(qū)。由于苗種成活率低，因此各養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖規(guī)模都不是很大。主要原因有兩個：一是稚魚對人工餌料的不適應性，二是早期發(fā)生不明原因死亡。2017年7月，北京市水生野生動植物救護中心實驗養(yǎng)殖的細鱗鮭魚苗突發(fā)大規(guī)模死亡，典型癥狀為：眼球凸出，鰓蓋邊緣、鰭條基部充血，部分病魚肛門紅腫。為了控制該疾病的蔓延，對從自然發(fā)病的細鱗鮭肝臟、腎臟、腸道處分離得到的菌株進行了理化特性及耐藥性分析。本實驗結果可為細鱗鮭細菌性疾病的診斷、防治和用藥提供參考。

一、材料與方法

（一）實驗材料

細鱗鮭采集于北京市水生野生動植物救護中心。患病魚體長3.2cm～4.0cm，體重為0.18g～0.31g，典型癥狀為：眼球凸出，鰓蓋邊緣、鰭條基部充血，部分病魚肛門紅腫。健康魚體長5cm～8cm，體重6g～8g，在實驗室飼養(yǎng)21d確定健康后用于回歸感染實驗。

（二）細菌的分離純化

取病癥明顯的細鱗鮭，在無菌條件下采集肝臟、腎臟、腸道，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)24h。挑取形態(tài)一致的單個優(yōu)勢菌落進行革蘭氏染色，并進行分離純化培養(yǎng)，得到3株優(yōu)勢菌分別命名為BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3。

（三）細菌的生理生化鑒定

取純化后的BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3菌株接種于細菌生化鑒定管中，進行葡萄糖、吲哚等項目的生理生化特性測定，生化試驗結果參照伯杰氏細菌鑒定手冊方法進行判定。

（四）藥敏實驗

藥敏實驗采用紙片擴散法進行。使用比濁儀調節(jié)BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3菌液濃度為0.5個麥氏濁度，以無菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面，再用鑷子將藥敏紙片貼于MH瓊脂平板表面。28℃培養(yǎng)24h后測量不同藥物的抑菌圈直徑(mm)，并根據(jù)CLSI標準進行藥敏結果判定。

（五）16SrDNA序列測定

利用細菌16SrDNA通用引物對BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3株16SrDNA基因進行擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性樣品由北京六合華大科技有限公司測序。將陽性PCR產物的測定結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對。

（六）回接感染實驗

使用菌液濃度為1.0×108CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.0×106CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×104CFU/mL的細菌懸液進行回接感染實驗。各試驗組用健康細鱗魚10尾。采用腹腔注射的方式進行攻毒，注射劑量為0.05mL/尾。同時設注射無菌生理鹽水的對照組。分別于24h、48h及72h后觀察記錄死亡情況，同時計算菌株半數(shù)致死量(LD50)。取具有發(fā)病癥狀的細鱗鮭，無菌條件下進行細菌的再分離培養(yǎng)，并比較分離到的細菌和攻毒所用菌株的理化特征，鑒定病原菌。

二、結果與分析

（一）細菌形態(tài)特征

BJSY-1、BISY-2、BJSY-3都為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成濕潤微凸、圓形光滑、邊緣整齊、灰白色、大小不一的菌落。

（二）生理生化鑒定結果

菌株BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3的生化鑒定結果如表1所示。其中BJSY-1菌株氧化酶反應呈陽性，不具有運動性，不利用枸椽酸鹽，不形成吲哚，V.P.試驗呈陰性，能發(fā)酵葡萄糖，不能發(fā)酵蔗糖、棉子糖、山梨醇、蜜二糖；BJSY-2菌株具有運動性，能發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵纖維二糖、麥芽糖、鼠李糖、乳糖、木糖，與精氨酸雙水解酶反應呈陽性，與賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫酸酶反應呈陰性；BJSY-3菌株具有運動性，與鳥氨酸脫羧酶、氧化酶反應呈陽性，不能發(fā)酵蔗糖、鼠李糖、麥芽糖等。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，初步判定BJSY-1為殺鮭氣單胞菌，BJSY-2為惡臭假單胞菌，BJSY-3為腐敗希瓦氏菌。

（三）藥敏實驗結果

分離株BJSY-1的藥物敏感性如表2所示，對卡那霉素、左氧氟沙星、頭孢呋辛鈉、四環(huán)素、氯霉素、甲氧芐啶、喹諾類藥物高度敏感。分離株BJSY-2對卡那霉素、磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、頭孢呋辛鈉、四環(huán)素、氨芐西林及喹諾酮類藥物高度敏感，如表3所示。分離株BJSY-3的藥物敏感性與前兩株相近，對四環(huán)素類、喹諾酮類藥物高度敏感，對青霉素、萬古霉素等具有耐藥性（見表4）。

表1 分離株BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3的生理生化特性

表2 分離株BJSY-1的藥物敏感性

表3 分離株BJSY-2的藥物敏感性

表4 分離株BJSY-3的藥物敏感性

（四）16SrDNA測序

分離株BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3用于16SrDNAPCR擴增和測序。PCR反應獲得1500bp左右長度的特異性目的片段，測序后分別獲得1430bp、1680bp、1700bp的準確序列，經同源性檢索后顯示，BJSY-1序列與氣單胞菌屬的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種核苷酸同源性達到99%以上。BJSY-2序列與惡臭假單胞菌ATCC1117216S的核苷酸同源性達99%以上，該序列在GenBank的登錄號為AF094745.1。BJSY-3序列則與腐敗希瓦氏菌同源性達到99%以上，該序列在GenBank的登錄號為MG576030.1。

（五）回接感染實驗結果

3株分離菌均對細鱗鮭有不同程度的致病性，其中BJSY-1的致病性最強。接種1.0×108CFU/mLBJSY-1菌液的細鱗鮭14天內的死亡率為100%，接種1.0×108CFU/mLBJSY-2、BJSY-3后14天后的死亡率分別為40%和20%。而且人工感染BJSY-1后的發(fā)病細鱗鮭均表現(xiàn)出鰭條基部及尾柄處充血、鰭潰爛，眼球凸出，肛門紅腫的癥狀，與自然發(fā)病細鱗鮭一致，如圖1、2所示。由此證明BJSY-1為此次細鱗鮭發(fā)病的主要致病菌，BJSY-2和BJSY-3為輔助致病菌。利用Reed和Muench氏法計算BJSY-1菌株的半數(shù)致死量LD50為6.97x105CFU/mL。

（六）藥物療效

根據(jù)藥敏實驗結果，選取了三個菌株都高度敏感的四環(huán)素類藥物鹽酸多西環(huán)素拌餌投喂治療。每1kg餌料加4g～6g鹽酸多西環(huán)素，每天投喂兩次，同時給發(fā)病魚池潑灑鹽酸多西環(huán)素進行殺菌，有效地控制了疾病的傳播。

圖1 鰭條基部充血、肛門紅腫的死亡細鱗鮭

圖2 肝臟上有出血點的死亡細鱗鮭

圖3 眼球突出充血

三、討論

殺鮭氣單胞菌在世界上分布的地區(qū)廣泛，能引起人類和多種動物的疾病，是鮭科魚類癤瘡病的病原體。癤瘡病發(fā)病率高，死亡率高，影響著世界范圍內的水產養(yǎng)殖。殺鮭氣單胞菌可分為五個亞種：殺鮭亞種、無色亞種、溶果膠亞種、史式亞種和殺日本鮭亞種。其中殺鮭亞種為典型株，可引起鮭科魚類眼球突出，鰓絲紅腫，魚鰭基部出血，嚴重者在體表形成膿腫或潰瘍。殺鮭氣單胞菌是一種條件致病菌，在魚類受到環(huán)境脅迫時容易發(fā)病。

惡臭假單胞菌是魚類腸道菌群的重要成員之一，也為條件致病菌，當環(huán)境條件適宜其生長繁殖且魚體抵抗力較弱時容易受到病原的侵襲。腐敗希瓦氏菌是一種導致人畜共患病的病原菌，也能夠引起水產動物發(fā)病。國外目前僅發(fā)現(xiàn)鯉魚和虹鱒感染腐敗希瓦氏菌的病例。本實驗分離到的腐敗希瓦氏菌對細鱗鮭的致病性不強，可能是因為分離到的菌株毒性較弱，這表明受到環(huán)境脅迫時的魚類免疫力下降，很容易遭受到毒性較弱的病原菌的入侵從而導致感染的發(fā)生。據(jù)此分析，本次疾病的爆發(fā)主要是由于此階段的細鱗鮭魚苗正處在開口攝食人工飼料不久的階段，體質較弱，抵抗力差，從而引發(fā)了殺鮭氣單胞菌同惡臭假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的共同感染。

細鱗鮭是近幾年推廣養(yǎng)殖的國產鮭科魚類，各地養(yǎng)殖的細鱗鮭幼苗期均出現(xiàn)不明原因死亡現(xiàn)象，癥狀與本實驗發(fā)病魚癥狀相同。本實驗選取鹽酸多西環(huán)素進行治療，取得了較好的治療效果。鹽酸多西環(huán)素屬于四環(huán)素類抗生素，為一種廣譜抑菌劑，通過破壞致病菌細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β酰氨，4糖苷類鍵，使其細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，致病菌因細胞壁破裂內容物逸出而被溶解（殺死），達到消炎、修復組織的目的，但不可以長期大劑量使用。一方面，容易誘發(fā)魚類對細菌和真菌的二重感染；另一方面，防止細菌對鹽酸多西環(huán)素產生耐藥性，避免耐藥菌株的出現(xiàn)。

本實驗為進一步研究殺鮭氣單胞菌、惡臭假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的致病性及耐藥性提供了理論依據(jù)。在細鱗鮭細菌性疾病防治過程中，科學地和針對性地用藥，避免盲目用藥導致病原菌耐藥性的增強，同時也應積極研發(fā)疫苗，逐漸減少抗生素類藥物的使用，維持生態(tài)環(huán)境的平衡。

休閑漁業(yè)已成為我國漁業(yè)的五大產業(yè)之一，與水產養(yǎng)殖業(yè)、捕撈業(yè)、加工業(yè)、增殖業(yè)并重。為推動休閑漁業(yè)發(fā)展，農業(yè)農村部于2016年召開了休閑漁業(yè)現(xiàn)場會，2017年開始把休閑漁業(yè)發(fā)展納入監(jiān)測，加強對休閑漁業(yè)的管理和服務，接下來還將實施一系列舉措推動我國休閑漁業(yè)發(fā)展。配合國家相關方針政策和產業(yè)發(fā)展需要，本刊特開辟“休閑漁悅”欄目，歡迎廣大讀者就相關內容投稿。