吳 凱，應(yīng)文俊，鄭志鋒，史正軍，楊海艷，楊 靜*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省生物質(zhì)高效利用工程實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué), 云南 昆明 650224)

受全球能源緊缺和環(huán)境惡化所帶來(lái)的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，以生物質(zhì)為原料開(kāi)發(fā)新能源和新型化學(xué)品的研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。木質(zhì)纖維是世界上最豐富的一種可再生生物質(zhì)原料，利用其中的纖維素生產(chǎn)和制備乙醇成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶解過(guò)程中，木質(zhì)素是主要抑制劑，一方面，木質(zhì)纖維原料中的木質(zhì)素和半纖維素、木質(zhì)素和纖維素之間復(fù)雜的結(jié)構(gòu)構(gòu)成了纖維素的“天然抗降解屏障”[2-4]；另一方面，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附將減少纖維素對(duì)纖維素酶的有效吸附[5-7]。盡管通過(guò)預(yù)處理手段可以除去大量木質(zhì)素，但并不能從根本上解決木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的抑制。為了解決這個(gè)難題，研究人員試圖通過(guò)探討木質(zhì)素在纖維素酶水解中的影響機(jī)制找到解決辦法。如Li等[8]在堿木質(zhì)素對(duì)酶蛋白的吸附中發(fā)現(xiàn)隨著相對(duì)分子質(zhì)量的遞增，堿木質(zhì)素對(duì)纖維素酶蛋白的親和力和分配系數(shù)減小，從而推測(cè)木質(zhì)素分子中可能存在一些功能基團(tuán)可導(dǎo)致其疏/親水性、電負(fù)性等性能改變，最終影響纖維素酶解效率。本研究以云南苦竹為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑和球磨預(yù)處理制備乙醇木質(zhì)素(EOL-B)和磨木木質(zhì)素(MWL-B)，采用FT-IR和13C NMR分析木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，并探究其對(duì)纖維素酶解效率、纖維素吸附酶蛋白的影響作用及機(jī)制，以期為纖維素酶水解的研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1原料、試劑與儀器

苦竹，采自云南省普洱市，粉碎，取0.3～0.45 mm粉末。微晶纖維素(Avicel PH-101)，購(gòu)自Sigma公司。纖維素酶(UTA-8)，購(gòu)于湖南尤特爾生化有限公司，濾紙酶活100 FPIU/mL，β-葡萄糖苷酶活72 IU/mL；纖維素酶(C2730)來(lái)源于里氏木霉(ATCC 26921)，購(gòu)自Sigma公司，濾紙酶活128 FPIU/mL，β-葡糖苷酶酶活27 IU/mL。乙醇、甲苯、98 %硫酸、二氧六環(huán)，均為分析純。水熱反應(yīng)器，鄭州博科儀器設(shè)備有限公司；球磨機(jī)，德國(guó)FRITSCH公司；冷凍干燥機(jī)，德祥科技有限公司；Agilent 1200 series高效液相色譜儀(HPLC)，美國(guó)Agilent公司；紅外吸收光譜儀(Madison, WI)，美國(guó)Thermo Nicolet公司。

1.2木質(zhì)素制備

1.2.1乙醇木質(zhì)素 參照文獻(xiàn)[9]將20 g苦竹與140 mL 75 %乙醇混合，固液比1∶7(g∶mL)，加入 98 %硫酸0.102 g。將混合液裝入1 L的水熱反應(yīng)器中，在170 ℃下反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻反應(yīng)器，取出反應(yīng)后的混合物，過(guò)濾，濾液中加入3倍的水，將醇溶木質(zhì)素沉淀，過(guò)濾，即得到乙醇木質(zhì)素(EOL-B)。

1.2.2磨木木質(zhì)素 參照文獻(xiàn)[10～11],將 30 g 苦竹用甲苯-乙醇抽提6 h, 甲苯200 mL，乙醇100 mL，抽提后的苦竹風(fēng)干并取 20 g 球磨 8 h，球磨后的樣品15 g 用300 mL 96 %二氧六環(huán)常溫避光抽提48 h，固液比為1∶20(g∶mL)，過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值 5.5，將濾液減壓濃縮至 30 mL，將濃縮后的濾液逐滴加入到 90 mL 的 95 %乙醇溶液中沉淀，離心分離半纖維素。將離心后的濾液減壓濃縮5 mL，加入 50 mL 酸(pH值 2.0)，離心，冷凍干燥，即得磨木木質(zhì)素(MWL-B)。

1.3纖維素酶水解

取微晶纖維素0.4 g，分別加入0、 40、 80、 160 mg 的EOL-B和MWL-B，加入18.6 mL水、1 mL檸檬酸緩沖液和0.4 mL纖維素酶液，酶用量為10 FPIU/g(以葡聚糖計(jì)，下同)，總體系20 mL。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?50±1) ℃、 150 r/min的搖床中反應(yīng)。分別于2、 4、 8、 12、 24、 48和72 h取樣，于3 000 r/min下離心10 min，取1 mL清液適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜測(cè)定反應(yīng)液中葡萄糖和纖維二糖的濃度變化，并計(jì)算纖維素酶水解得率[12-13]。纖維素水解葡萄糖得率按式(1)計(jì)算：

Y=(c×0.02×0.9)/(m×W)×100 %

(1)

式中：Y—纖維素水解葡萄糖得率，%；0.02—水解糖液體積，L；c—水解液中葡萄糖和纖維二糖質(zhì)量濃度，g/L；0.9—纖維素和葡萄糖、纖維二糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)；m—原料質(zhì)量，g；W—原料中纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.4纖維素酶吸附

分別稱(chēng)取EOL-B和MWL-B各0.1 g于50 mL三角瓶中，加入一定量的水、0.25 mL檸檬酸緩沖液和纖維素酶液(0.02～0.1 g/L)，使底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?4±1) ℃、150 r/min的搖床中反應(yīng)3 h。通過(guò)測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量(Bradford法)來(lái)評(píng)價(jià)不同時(shí)間纖維素酶蛋白的吸附情況[14]。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方程：y=1.094 8x-0.562 8，R2=0.994(x為吸光值，y為上層液酶量)。用Langmuir等溫吸附方程擬合不同底物對(duì)纖維素酶的吸附性能[13]，其中，Γmax和K值可由Langmuir線性方程擬合得出，分配系數(shù)R=Γmax×K。方程如式(2)所示：

Γ=KCΓmax/(1+KC)

(2)

式中：C—上清液中的游離酶質(zhì)量濃度，g/L；?！孜锷辖Y(jié)合酶的濃度，mg/g；Γmax—纖維素酶在底物上的飽和吸附量，mg/g；K—Langmuir常數(shù)，表示纖維素酶的親和力。

1.5分析表征

1.5.1化學(xué)組分分析 樣品的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的組成按美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室公布的方法測(cè)定[15]。采用HPLC測(cè)定酶水解液中的糖組分，酶水解后的上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，以0.005 mol/L 的硫酸作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，在色譜柱溫為55 ℃，示差折光檢測(cè)器(RI)上進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2紅外光譜分析 樣品采用紅外吸收光譜儀進(jìn)行分析，波數(shù)范圍400～4000 cm-1，掃描32次和分辨率2 cm-1透射模式下采集數(shù)據(jù)。

1.5.3核磁共振分析 樣品采用布魯克400 M超導(dǎo)核磁共振儀進(jìn)行測(cè)定。以氘代DMSO為溶劑，在FTr模式100.6 MHz下進(jìn)行信號(hào)采集，選取DMSO的(39.5)進(jìn)行校標(biāo)。采樣條件為：采用30度脈沖序列，采樣時(shí)間1.36 s，弛豫時(shí)間1.89 s，累積30 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1成分分析

從苦竹中提取的乙醇木質(zhì)素(EOL-B)和磨木木質(zhì)素(MWL-B)的主要化學(xué)成分如表1所示。

表1 苦竹、乙醇木質(zhì)素和磨木木質(zhì)素成分Table 1 Constituent of bitter bamboo, EOL-B and MWL-B

從表1可得出，苦竹含葡聚糖41.2 %，木聚糖22.3 %，木質(zhì)素30.3 %；經(jīng)乙醇和球磨處理后得到的EOL-B和MWL-B中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95 %和90.2 %，葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于8 %，無(wú)木聚糖和乙醇抽出物，兩者都具有較高的純度，可作為木質(zhì)素的模型物用于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)對(duì)纖維素酶吸附和酶水解的研究。MWL-B是采用深度球磨和溶劑萃取(二氧六環(huán))分離出的木質(zhì)素，這種木質(zhì)素在結(jié)構(gòu)上與原本木質(zhì)素相近，被廣泛充當(dāng)原本木質(zhì)素的模型物來(lái)研究木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)。

2.2纖維素酶水解

以磨木木質(zhì)素(MWL-B)和乙醇木質(zhì)素(EOL-B)作為模型物，研究木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的影響。以微晶纖維素和添加了0、 40、 80、 160 mg的EOL-B或MWL-B的微晶纖維素為底物，在纖維素酶用量10 FPIU/g、pH值4.8和50 ℃條件下水解，葡萄糖得率隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著MWL-B的用量增加，72 h葡萄糖得率從 51.34 %降低至 46.06 %，葡萄糖得率降低了10 %。Sun等[15]研究發(fā)現(xiàn)紫丁香基單元和愈創(chuàng)木基單元能對(duì)纖維素酶水解產(chǎn)生聯(lián)合抑制效應(yīng)，這主要是由于縮合的芳環(huán)增加了木質(zhì)素分子的疏水性，而紫丁香基和愈創(chuàng)木基提高了木質(zhì)素的氫鍵結(jié)合力，因此對(duì)木質(zhì)纖維素的酶水解過(guò)程產(chǎn)生了協(xié)同抑制作用。然而，從圖1還可看出，隨著EOL-B的用量增加，葡萄糖72 h得率分別為56.06 %、60.61 %和61.06 %；與對(duì)照的葡萄糖得率51.34 %相比，加入8 g/L EOL-B后，72 h葡萄糖得率增加了19 %。Zhou等[16]認(rèn)為磺酸鹽木質(zhì)素可能作為一種表面活性劑來(lái)提高纖維素的酶水解效率。MWL-B經(jīng)過(guò)球磨、二氧六環(huán)抽提制得，而EOL-B為經(jīng)乙醇萃取，溶解于乙醇溶液中的木質(zhì)素。不同的預(yù)處理方式得到的木質(zhì)素，化學(xué)結(jié)構(gòu)及其表面化學(xué)性質(zhì)也不同，這些變化會(huì)影響到纖維素的酶解效率。

2.3木質(zhì)素對(duì)纖維素酶吸附的影響

以微晶纖維素、MWL-B和EOL-B為底物，酶用量10 FPIU/g，在pH值4.8、4 ℃、 150 r/min條件下反應(yīng)3 h，Langmuir吸附等溫線及其參數(shù)如圖2和表2所示。

圖1 木質(zhì)素添加量對(duì)纖維素酶解的影響Fig.1 Effects of adding isolated lignins on enzymatic hydrolysis of cellulose

圖2 不同木質(zhì)素與纖維素酶蛋白的等溫吸附曲線Fig.2 Isothermal adsorption curves of different lignin and cellulase proteins

從圖2可以看出，MWL-B對(duì)纖維素酶等溫吸附曲線上的斜率大于EOL-B，意味著MWL-B與纖維素酶間的親和力大于EOL-B與纖維素酶間的親和力。MWL-B對(duì)纖維素酶最大吸附量為EOL-B的1.96倍，表明MWL-B上有更多的纖維素酶吸附位點(diǎn)。

表2 纖維素酶蛋白在不同底物上的Langmuir吸附等溫曲線參數(shù)Table 2 Langmuir adsorption isotherm parameters of cellulase proteins on different substrates

從表2可知，Langmuir常數(shù)K表示纖維素酶與底物之間的相對(duì)親和力，意味著在纖維素的酶水解過(guò)程中，不僅纖維素與纖維素酶之間有親和力，木質(zhì)素與纖維素酶之間也有強(qiáng)的結(jié)合力，其中，MWL-B的纖維素酶親和力是EOL-B的1.17倍。因此，在酶水解過(guò)程中，木質(zhì)素將會(huì)與纖維素競(jìng)爭(zhēng)吸附纖維素酶。Langmuir方程中分配系數(shù)R用于估計(jì)纖維素酶與底物之間結(jié)合力的強(qiáng)弱。纖維素酶在Avicel、MWL-B和EOL-B上的R分別為0.47、 0.04和0.09，并且纖維素酶與MWL-B之間的分配系數(shù)是EOL-B的2.25倍。以上數(shù)據(jù)表明與MWL-B相比，EOL-B與纖維素酶之間具有較低的親和力和結(jié)合力，故對(duì)纖維素酶的最大吸附量也低于MWL-B。

因此，推測(cè)如下：相比MWL-B，在EOL-B上可能存在一些基團(tuán)，能夠排斥、阻止纖維素酶的靠近，使纖維素底物周?chē)拿傅鞍诐舛仍黾?，進(jìn)而促進(jìn)了酶解效率，這與2.2節(jié)的分析結(jié)果相一致。

2.4紅外光譜分析

為了探討MWL-B和EOL-B的結(jié)構(gòu)對(duì)酶水解和酶吸附的影響，分別對(duì)它們進(jìn)行紅外光譜(FT-IR)分析，結(jié)果如圖3所示。從圖中b、c線可以看出，在1597、 1506和1427 cm-1處的吸收峰為木質(zhì)素苯環(huán)骨架振動(dòng)的特征吸收峰[17]，說(shuō)明MWL-B和EOL-B具有木質(zhì)素特有的苯環(huán)結(jié)構(gòu)；1506 cm-1處的吸收峰為與苯環(huán)相連的C—H變形振動(dòng)吸收峰。1330、 1270 cm-1處的吸收峰分別由紫丁香基和愈創(chuàng)木基的苯環(huán)伸縮振動(dòng)引起。1165、 830 cm-1處的2個(gè)峰以及1162 cm-1處的肩峰[18]表明竹材木質(zhì)素屬于典型的禾草類(lèi)木質(zhì)素(GSH型)，其大分子由對(duì)羥基苯丙烷、愈創(chuàng)木基丙烷和紫丁香基丙烷3種基本結(jié)構(gòu)單元組成。以上結(jié)果表明：2個(gè)木質(zhì)素模型物具有木質(zhì)素的基本的苯基丙烷結(jié)構(gòu)。

2.5核磁共振光譜分析

13C NMR是檢測(cè)木質(zhì)素碳骨架結(jié)構(gòu)的有效手段，可用來(lái)確定木質(zhì)素的基本成分，如芳基醚鍵、縮合和非縮合的結(jié)構(gòu)單元、甲氧基單元等信息，能提供木質(zhì)素大分子的整體結(jié)構(gòu)信息，MWL-B和EOL-B的13C NMR譜圖如圖4所示。

圖3 苦竹(a)、苦竹磨木木質(zhì)素(b)和乙醇木質(zhì)素(c)紅外吸收光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of bitter bamboo(a), MWL-B(b)and EOL-B(c)

圖4 苦竹磨木木質(zhì)素(a)和乙醇木質(zhì)素(b) 的13C NMR譜圖Fig.4 13C NMR spectra of MWL-B(a) and EOL-B(b)

從圖4可以看出，MWL-B(a)和EOL-B(b)的碳水化合物信號(hào)(δ90～102)強(qiáng)度很弱，說(shuō)明這2種木質(zhì)素中的糖含量較低，這與其化學(xué)成分分析中葡聚糖和木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于8 %是一致的，因此其作為模型物來(lái)分析木質(zhì)素結(jié)構(gòu)對(duì)纖維素酶水解和酶吸附的影響較為合理。木質(zhì)素13C NMR的芳環(huán)區(qū)分為3個(gè)區(qū)域：δ140～160為氧化的芳基碳，δ123～140 為芳環(huán)碳碳鍵和δ103～123的芳環(huán)亞甲基碳[19-20]。與MWL-B相比較，EOL-B的氧化碳、芳環(huán)的碳碳鍵和芳環(huán)的亞甲基碳信號(hào)強(qiáng)度均降低，表明經(jīng)乙醇預(yù)處理后，β-β、β-5鍵含量降低，即木質(zhì)素中的β-β、β-5鍵發(fā)生了斷裂。EOL-B來(lái)源于乙醇預(yù)處理竹材后，溶解于乙醇中的木質(zhì)素，從圖4還可以看出，在這一過(guò)程中，原本木質(zhì)素在β碳上的烷醚鍵或芳醚鍵斷裂，并且斷裂后的小分子片段沒(méi)有繼續(xù)縮合，因此在EOL-B中凝縮單元少于MWL-B。研究已經(jīng)表明木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中凝縮單元含量高將增加木質(zhì)素分子的疏水性能，終將增加木質(zhì)素對(duì)纖維素酶蛋白疏水性氨基酸的吸附，導(dǎo)致酶水解效率降低[21]。

木質(zhì)素各單元間的連接鍵的信號(hào)峰出現(xiàn)在δ50～90區(qū)域,β-O- 4′信號(hào)出現(xiàn)在δ72.3和δ60.2處，β-β位于δ71.9處，β-5在δ62.8處[19-20]。正如圖4所示，EOL-B在此區(qū)域的信號(hào)峰強(qiáng)度大于MWL-B，表明在乙醇預(yù)處理過(guò)程中，木質(zhì)素的β-O- 4′斷裂，大分子碎片化，并且碎片化的小分子發(fā)生縮合反應(yīng)的幾率較小。這與Hallac和Sannigrahi的研究結(jié)果一致[22-23]。β-O- 4′斷裂后，引入了大量的親水性基團(tuán)羥基，這與EOL-B在FT-IR中3448 cm-1處的羥基的O—H振動(dòng)吸收峰的強(qiáng)度大于MWL-B是一致的。此外，δ56.35處為甲氧基的信號(hào)峰，說(shuō)明球磨過(guò)程中甲基芳醚鍵沒(méi)有斷裂。研究表明木質(zhì)素分子與纖維素酶之間的疏水作用導(dǎo)致了它們之間的非特異吸附現(xiàn)象[24-25]。木質(zhì)素分子上親水基團(tuán)的增加，導(dǎo)致木質(zhì)素分子親水性能增強(qiáng)，對(duì)纖維素酶產(chǎn)生排斥作用，從而使纖維素周?chē)w維素酶的濃度增加，因此，EOL-B對(duì)纖維素酶的親和力和最大吸附量均小于MWL-B，加入EOL-B的纖維素的酶水解得率升高。

3 結(jié) 論

3.1從苦竹中提取乙醇木質(zhì)素(EOL-B)和磨木木質(zhì)素(MWL-B)，并以2種木質(zhì)素為模型物添加到微晶纖維素中，研究木質(zhì)素對(duì)纖維素酶解的影響。結(jié)果表明：當(dāng)0.4 g微晶纖維素中加入40、80和160 mg EOL-B時(shí)，反應(yīng)72 h葡萄糖得率逐漸升高，分別為56.06 %、 60.61 %和61.06 %；但葡萄糖得率隨MWL-B的添加量增大而降低，與對(duì)照葡萄糖得率51.34 %相比，加入8 g/L MWL-B的葡萄糖得率降低了10 %。

3.2與MWL-B相比較，EOL-B與纖維素酶之間具有較低的親和力和結(jié)合力，纖維素酶在MWL-B上的最大吸附量為EOL-B的1.96倍。

3.3MWL-B對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附降低了酶解得率；苦竹經(jīng)乙醇預(yù)處理后，β碳上的芳醚鍵和烷醚鍵發(fā)生斷裂，引入了大量的親水性基團(tuán)羥基，增加了木質(zhì)素分子的親水性能，并在β碳上形成碳碳凝縮單元的機(jī)率較小，致使EOL-B分子對(duì)纖維素酶蛋白的吸附量減少，導(dǎo)致纖維素酶水解得率增加。

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