任恒鑫，呂玉光，宗希明，牟立婷，張舒婷，宋春香，孫長海

(佳木斯大學 藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

松科植物臭冷杉[Abiesnephrolepis(Trautv.) Maxim.]又名臭松、東陵冷杉，在我國主要分布在東北的長白山脈和小興安嶺地區(qū)[1-4]。現(xiàn)代藥理學研究表明，臭冷杉揮發(fā)油具抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘和清除自由基的作用[5-7]，并可作為食品加香劑、調(diào)味劑、防腐劑和抗氧化劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等行業(yè)，極具市場開發(fā)價值[8]。

檸檬烯和醋酸龍腦酯為臭冷杉揮發(fā)油中兩種主要有效成分，是評價臭冷杉原藥材質(zhì)量的重要指標[9-10]。臭冷杉揮發(fā)油中檸檬烯和醋酸龍腦酯的測定方法文獻報道多為氣相色譜法[11-12]。本文首次建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合選擇性離子檢測技術(shù)同時測定臭冷杉揮發(fā)油中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量的方法，并對采集于小興安嶺不同地區(qū)的樣品進行了測定，為臭冷杉生藥質(zhì)量評價提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 7890GC/5975MSD型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；臭冷杉藥材分別采于小興安嶺10個地區(qū)，經(jīng)佳木斯大學藥學院宗希明高級實驗師鑒定為松科、冷杉屬植物臭冷杉[Abiesnephrolepis(Trautv.) Maxim.]的新鮮枝葉和松脂；檸檬烯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100470-200801)；醋酸龍腦酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110759-200604)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為30 m×0.25 mm×0.25 μm HP-5MS石英毛細管柱，進樣口溫度280 ℃，初始柱溫40 ℃，以4 ℃ ·min-1升至260 ℃，載氣為氦氣，分流比為100∶1，進樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

標準EI源(70 eV)，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為280 ℃，四極桿質(zhì)量分析器，掃描范圍30～450 amu，掃描速度為3.46 scans/s。采用 SIM(選擇離子為68和95) ，采集延遲7.5 min。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制

分別取檸檬烯和醋酸龍腦酯對照品適量(約200 mg)，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為mg ·mL-1的對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的配制

取臭冷杉枝葉粉末約50 g，或松脂約10 g，精密稱定，置于揮發(fā)油提取器中，加水500 mL，按《中國藥典》2015年版(四部) 通則2204揮發(fā)油測定法[13]提取揮發(fā)油 6 h，得淡黃色揮發(fā)油。加適量無水硫酸鈉脫水，振搖，靜置。將脫水后的揮發(fā)油置5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜行為

在上述色譜條件下，檸檬烯和醋酸龍腦酯對照品和樣品的選擇離子掃描色譜圖見圖1A和1B。檸檬烯和醋酸龍腦酯質(zhì)譜圖分別見圖2和圖3。

圖1 檸檬烯和醋酸龍腦酯對照品的選擇離子掃描

圖2 檸檬烯(limonene) 質(zhì)譜圖

圖3 醋酸龍腦酯(bornyl acetate) 質(zhì)譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精確量取檸檬烯和醋酸龍腦酯對照品儲備液，用正己烷制成含檸檬烯濃度分別為400，800，1 600， 2 400，3 200，4 000 μg·mL-1; 醋酸龍腦酯濃度分別為800，1 600，3 000， 4 800， 6 400 μg ·mL- 1的系列混合對照品溶液。按上述色譜條件進樣。以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y=12 042x+ 2 06(r=0.999 7)和y=13 13x+7 06(r=0.999 8)。結(jié)果表明，檸檬烯和醋酸龍腦酯檢測濃度在400～4 000 μg ·mL-1和800～8 000 μg ·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算檸檬烯和醋酸龍腦酯峰面積的RSD分別為 1.2%和1.4%，表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別在 0，2，4，8，16 h時按上述色譜條件進樣1 μL測定。結(jié)果檸檬烯和醋酸龍腦酯峰面積的RSD分別為1.6%和1.4%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一產(chǎn)地(伊春)臭冷杉樣品6份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣1 μL，計算檸檬烯和醋酸龍腦酯含量的RSD分別為1.3%和1.4% ，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一產(chǎn)地 (伊春) 臭冷杉樣品6份，每份500 mg，精密稱定，分別加入一定量的對照品儲備液，按“2.2.2” 項下方法制備，按上述色譜條件進樣1 μL，計算檸檬烯和醋酸龍腦酯平均加樣回收率分別為98.5% 和98.7%；，RSD 分別為1.3%和1.5% 。表明方法回收率良好。

2.9 樣品含量測定

取小興安嶺地區(qū)10個不同產(chǎn)地的臭冷杉不同部位揮發(fā)油樣品，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣1 μL，依法測定各產(chǎn)地中的檸檬烯和醋酸龍腦酯含量。結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地樣品中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量測定結(jié)果(n=10)

3 討 論

3.1 相對于全掃描技術(shù)，選擇性離子檢測(Selected Ion Monitor) 技術(shù)使質(zhì)譜儀將更多的時間用于檢測選定質(zhì)荷比離子的離子流，因而提高了分析靈敏度。該方法被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和環(huán)境監(jiān)測等研究領(lǐng)域[14-16]。本文首次采用GC-MS/SIM法同時測定了臭冷杉揮發(fā)油中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量。使用SIM模式使得該方法靈敏度更高，分析結(jié)果更為準確可靠。研究結(jié)果為臭冷杉藥材的質(zhì)量標準建立奠定了基礎(chǔ)。

3.2 測定結(jié)果表明小興安嶺地區(qū)臭冷杉樣品中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量較高，明顯高于文獻[11-12]報道的吉林延邊地區(qū)及長白山地區(qū)臭冷杉揮發(fā)油中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量。其中伊春產(chǎn)地臭冷杉揮發(fā)油中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量最高，是否與地理、氣候等綜合因素有關(guān)，還有待進一步研究。

3.3 測定結(jié)果表明臭冷杉不同部位揮發(fā)油中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量不同，松葉>松枝>松脂，其中松葉和松枝中檸檬烯和醋酸龍腦酯含量較接近，但均大于松脂中含量，原因可能是由于采集的松脂暴露于空氣中產(chǎn)生化學變化所致。

參考文獻：

[1] Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical of Jilin Provincial Medicinal Plant. Flora of Changbai Mountain[M]. Changchun: Jilin People’s Publishing House, 1982.

[2] 周恩寶. 松科植物松葉揮發(fā)油化學成分的研究[D].佳木斯：佳木斯大學,2009.

[3] 任恒鑫,蘇瑞,張舒婷,等. GC-MS結(jié)合化學計量學解析法分析臭冷杉針葉揮發(fā)油成分[J]. 中草藥,2012(8):1499-1502.

[4] 徐永紅,申仁花,李東浩,等. 延邊地區(qū)臭冷杉精油化學成分的研究[J]. 延邊大學學報(自然科學版),1994(4):39-42.

[5] LIU W, ZHOU Z C, SHI H B, et al . Actions of relieving cougher moving phlegm and antiasthma of essential oil in Abies nephrolepis[J]Chin Tradit Herb Drugs, 1990, 2(6) : 268-271.

[6] BAKKALI F, AVERBECK S, AVERBECK D, et al. Biological effects of essential oils - A review[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(2): 446-475.

[7] 尹有干. 冷杉針葉提取物促生長作用及抑菌活性研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學,2014.

[8] 方紀,侯林英,侯祥瑞. 冷杉的開發(fā)與利用概況[J]. 長春大學學報,2006(2):67-69.

[9] 方洪壯,趙晨曦,周恩寶. 小興安嶺7種松葉揮發(fā)油GC-MS數(shù)據(jù)的分析[J]. 計算機與應(yīng)用化學,2010(4):480-484.

[10] 薄采穎,鄭光耀,宋強. 馬尾松、樟子松、臭冷杉針葉精油的化學成分比較研究[J]. 林產(chǎn)化學與工業(yè),2010(6):45-50.

[11] 王威,閆喜英,師海波,等. 氣相色譜法測定臭冷杉揮發(fā)油中醋酸龍腦酯含量[J]. 藥物分析雜志,2004(3):244-246.

[12] 王威,趙志蘭，牛志多,等.毛細管氣相色譜法測定臭冷杉揮發(fā)油中檸檬烯含量 [J].中草藥,2003,34(7):605-607.

[13] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(四部)[S]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2015: 通則2204.

[14] 孫嘯濤,張鋒國,董蔚,等. GC-MS/SIM法測定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇[J]. 中國食品學報,2015(2):214-222.

[15] 雷書鳳,王海燕,苑泉,等. SPE-GC-MS/SIM測定水節(jié)霉發(fā)生地河水中半揮發(fā)性有機物[J]. 環(huán)境科學研究,2014(6):670-675.

[16] 關(guān)皓月,趙霞,孫會敏. GC-MS/SIM法測定明膠空心膠囊中的鄰苯二甲酸酯類化合物[J]. 中國新藥雜志,2013(4):482-485.