孫晨雨，王 飛，張建玲，李長(zhǎng)婷，閆 楊，欒仙德，孟 超

（泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271000）

銀耳多糖 （Tremella polysaccharides，TP） 是銀耳中一種重要的生物活性物質(zhì)，能夠提高機(jī)體的免疫能力，并誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，經(jīng)常食用銀耳對(duì)預(yù)防癌癥等多種疾病具有非常顯著的效果。銀耳多糖在不同程度上對(duì)細(xì)胞因子IL-1α，IL-6，IL-8的產(chǎn)生起到促進(jìn)作用，且呈劑量依賴性[1]。銀耳多糖具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生白介素IL-1，IL-6和腫瘤壞死因子的作用，而且多糖降解產(chǎn)物具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-1或IL-6的作用，所以銀耳多糖對(duì)細(xì)胞因子的作用可能是通過(guò)各水解片段所共有的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。銀耳多糖通過(guò)對(duì)IL-2，IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)來(lái)促進(jìn)這些細(xì)胞因子的生成[2]。

銀耳多糖是一種免疫增強(qiáng)劑，可以通過(guò)激活免疫細(xì)胞來(lái)提高機(jī)體的免疫功能。根據(jù)聶偉等人[3]的研究可知，銀耳多糖能夠有效地激活淋巴細(xì)胞，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的能力，并且在服用多糖的期間機(jī)體的主要臟器不會(huì)受到一般藥物副作用的損傷。尤其針對(duì)體內(nèi)白細(xì)胞減少的癥狀，Guo F C等人[4]通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行抑制淋巴瘤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖對(duì)小鼠外周白細(xì)胞減少的癥狀有明顯的提高白細(xì)胞數(shù)量的作用。根據(jù)李璐等人[5]的試驗(yàn)研究可以得知，銀耳多糖對(duì)小鼠淋巴瘤有較高的抑制作用，抑制率大約為60%，結(jié)合γ射線，能夠有效治療在腫瘤的放療和化療過(guò)程中所造成的白細(xì)胞減少的癥狀。

根據(jù)銀耳原料的不同，銀耳多糖常用的提取方法有熱水浸提法、堿浸提法、酶法提取法和超聲波輔助提取法等4種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

福建古田銀耳子實(shí)體干品，購(gòu)買量為120g（置于陰涼干燥處，避免陽(yáng)光直射）。

1.1.2 復(fù)合酶液的制備

精密稱取500 U/mg果膠酶0.5 g，10 U/mg纖維素酶1.5 g，100 U/mg中性蛋白酶 2.0 g，并置于100 mL的容量瓶中，加蒸餾水至100 mL刻度線處。搖勻后于50℃下水浴1 h，置于4℃下存放。所使用的果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶，均由濟(jì)南雨同生物科技有限公司提供。

1.1.3 Sevage試劑

氯仿和正丁醇的配比按照5∶1的比例精確量取，置于玻璃瓶中存放，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 其他藥品及試劑

蒽酮/Anthrone，5 g（S19210），純度在 95%～99%的正丁醇，于室溫下避光保存；98%濃硫酸，避光密封保存；純度為99.8%的三氯甲烷，密封遮光，置于陰涼通風(fēng)處保存。

1.1.5 試驗(yàn)儀器

FZ102型高速粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；LQ-A005型電子天平，瑞安市安特稱重設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HH.W21-600型恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海恒平科學(xué)器有限公司產(chǎn)品；燒杯、錐形瓶、容量瓶、研砵、10 mL具塞試管、比色皿等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 銀耳子實(shí)體的處理步驟

（1）稱量、研磨。精確稱取無(wú)雜質(zhì)銀耳子實(shí)體干品2.000 g 2份。其中，1份先按料液比1∶80加水，在室溫下（20～25℃） 浸泡30 min，再置于小型研缽中充分搗碎，制成銀耳漿液；另1份先在高速研磨機(jī)中粉碎2 min，再按料液比1∶80加水在室溫下浸泡30 min，制成銀耳漿液。

（2） 加酶。采用復(fù)合酶浸提法[6]，調(diào)pH值至6.3，加入復(fù)合酶1.5%，于50℃條件下反應(yīng)40 min，迅速升溫至80℃滅酶，并在50，60，70，80，90℃下恒溫浸提1.0，1.5 h。

（3） 離心。以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，取離心后銀耳浸提液4 mL，與Sevage試劑以5∶1的比例加入各離心管中，搖勻。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，除雜蛋白。

（4）測(cè)吸光度度。取2 mL的浸提液置于相應(yīng)的具塞試管中，每個(gè)具塞試管加入6 mL的硫酸蒽酮試液，沸水浴10 min，然后冷水浴15 min，作一空白對(duì)照（2 mL的蒸餾水加入6 mL的硫酸蒽酮試液）。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)量其吸光度；記錄18支樣品溶液的吸光度值，繪出相應(yīng)的折線圖。

1.2.2 硫酸蒽酮法測(cè)定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1） 對(duì)照品溶液的制備。無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10mg，置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

（2） 蒽酮試液的制備。取蒽酮0.20 g，加入100 mL濃硫酸溶解即得蒽酮試液，現(xiàn)配現(xiàn)用，置于棕色瓶中4℃放置。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別加入蒸餾水至2.0 mL。分別精密量取6.0 mL的蒽酮試液，搖勻后冷卻15 min。沸水浴10 min后，冷水冷卻15 min，測(cè)定波長(zhǎng)620 nm處吸光度值。以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液下測(cè)得的銀耳多糖吸光度所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液下銀耳多糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液下銀耳多糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同條件下銀耳浸提液中銀耳多糖吸光度測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果

浸泡前成粉碎狀態(tài)的銀耳于溫度分別為50，60，70，80℃的條件下，浸提1 h后，銀耳多糖溶液在波長(zhǎng)620 nm處的吸光度分別為0.463，0.657，0.546，0.520；浸提1.5 h后，銀耳多糖溶液在波長(zhǎng)620 nm處的吸光度分別為0.447，0.629，0.521，0.517。

浸泡后，將再研磨的銀耳于溫度分別為50，60，70，80，90℃的條件下，浸提1 h后，銀耳多糖溶液在波長(zhǎng)620 nm處的吸光度分別為0.490，0.501，0.512，0.539，0.520；浸提1.5 h后，銀耳多糖溶液在波長(zhǎng)620 nm處的吸光度分別為0.432，0.503，0.563，0.604，0.591。

2.3 銀耳多糖提取率的計(jì)算

根據(jù)朗伯-比爾定律表示：A=lg（1/T）=Kbc.式中：A——吸光度；

T——透射比；

K——摩爾吸收系數(shù)；

c——吸光物質(zhì)的質(zhì)量濃度；

b——吸收層厚度，為1 cm。

根據(jù)朗伯-比爾定律求得不同條件下銀耳浸提液中銀耳多糖的質(zhì)量濃度。

不同浸提溫度下粉碎狀態(tài)的銀耳多糖質(zhì)量濃度見(jiàn)圖2，不同溫度下浸泡后研磨的銀耳多糖質(zhì)量濃度見(jiàn)圖3。

圖2 不同浸提溫度下粉碎狀態(tài)的銀耳多糖質(zhì)量濃度

圖3 不同溫度下浸泡后研磨的銀耳多糖質(zhì)量濃度

3 結(jié)果分析與討論

3.1 銀耳浸提條件的選擇

銀耳與蒸餾水以1∶80的比例在室溫下浸泡30 min，加入復(fù)合酶1.5%，于50℃條件下酶促反應(yīng)40 min，之后在設(shè)定溫度下浸提1.0，1.5 h。

3.2 銀耳多糖提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)圖2可知，銀耳在浸泡后呈粉碎狀態(tài)時(shí)浸提1 h，在50～60℃條件下浸提，銀耳多糖的質(zhì)量濃度不斷增加，從0.141 mg/mL增加到0.199 mg/mL。在60℃之后，隨著浸提溫度的增加，銀耳多糖的質(zhì)量濃度隨之下降，銀耳多糖的最低質(zhì)量濃度在80℃時(shí)為0.157 8 mg/mL。銀耳在浸泡前呈粉碎狀態(tài)時(shí)浸提1.5 h，也是在60℃下浸泡1.5 h的效率最高，得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度最高為0.191 mg/mL。所以，在相應(yīng)的溫度下浸提1.5 h后所得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度比浸提1 h所得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度要低，雖然相差不大，但是考慮到效率和成本的問(wèn)題，可以選擇在60℃下浸提1 h提取銀耳多糖。

根據(jù)圖3可知，銀耳在浸泡后呈粉碎狀態(tài)時(shí)浸提1 h，在80℃的提取效率最高，為0.164 mg/mL。在50～80℃條件下浸提，銀耳多糖質(zhì)量濃度不斷增加，從0.149 mg/mL增加到0.164 mg/mL。在80℃以后，銀耳多糖質(zhì)量濃度不斷減少。銀耳在浸泡后呈粉碎狀態(tài)時(shí)浸提1.5 h，是在80℃條件下浸泡1.5 h的效率最高，為0.183 mg/mL。

綜上所述，銀耳的不同狀態(tài)在不同溫度和不同浸提時(shí)間下浸提，并根據(jù)計(jì)算得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度綜合比較得知，其在浸泡前呈粉碎狀態(tài)下以料液比1∶80的加水比浸泡，于60℃條件下浸提1 h所得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度最高，銀耳多糖的浸提率也最高。

3.3 影響試驗(yàn)的主要因素

在浸泡前被粉碎，結(jié)構(gòu)被破壞，復(fù)合酶容易發(fā)生作用，使銀耳子實(shí)層、單子層和擔(dān)孢子的表面及連接物充分分解，當(dāng)酶促反應(yīng)達(dá)到一定程度（最適酶促反應(yīng)時(shí)間為40 min），熱水浸提溫度是影響浸提率的關(guān)鍵。通過(guò)提高溫度，起到了滅酶作用，又使得可溶于熱水的胞內(nèi)多糖溶出率增加。

3.4 銀耳多糖提取工藝的細(xì)化

若是沒(méi)有任何試驗(yàn)依據(jù)的情況下，可以采用單因素變量試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果縮小每個(gè)提取條件的范圍，再根據(jù)縮小后的范圍進(jìn)行多因素多水平的正交試驗(yàn)。

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