袁慧杰，廖紫瓊，歐陽道福，李曉敏，孫常磊，陳明毅，謝智勇，賴志輝,4

(1.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275；2.中山大學藥學院(深圳)，廣東 深圳 518000；3.完美(中國)有限公司，廣東 中山 528400；4.中山大學測試中心，廣東 廣州 510275)

紫外線輻射是導致人體皮膚曬傷、色素沉著、炎癥和光老化等的主要因素[1-2]，高紫外線暴露人群比低暴露人群皮膚老化風險高一倍，老化發(fā)生提前10年，其造成的氧化損傷被認為是光老化的重要原因[3]。長波紫外線(UVA，波長320～400 nm)還會誘導細胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，間接破壞其他重要的細胞結構[4-5]，成纖維細胞是其重要的輻射靶位之一。

目前，從自然資源中尋找天然抗紫外藥物，防治紫外線對皮膚的損傷越來越受到人們的重視。蘆薈(Aloe)作為一種多年生百合科Liliaceae草本植物[6]，富含多種生物活性物質(zhì)，其中具有重要藥用價值的有庫拉索蘆薈、好望角蘆薈、木立蘆薈和中華蘆薈等[7]。蘆薈資源在我國分布廣泛，廣東、廣西、海南、云南等地均有種植。蘆薈葉由兩部分組成，外層的綠色外皮和內(nèi)部透明的葉肉(蘆薈凝膠)，蘆薈凝膠中含有豐富的生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種功效[8-10]。然而關于蘆薈凝膠對紫外輻射保護作用的研究報道較少，為充分利用蘆薈資源，本研究以蘆薈凝膠凍干粉為研究對象，對其抗紫外輻射損傷作用進行研究，旨在為蘆薈的進一步開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 小鼠成纖維細胞株(NIH 3T3)

細胞株由中山大學細胞房提供；實驗所用細胞傳代數(shù)均控制在50代以內(nèi)，以保證細胞活力及實驗數(shù)據(jù)的準確性。

1.2 主要試劑與儀器

蘆薈凝膠凍干粉(云南萬綠生物股份有限公司, 批號：20160704,w(多糖)=64%)；胎牛血清(四季青產(chǎn)品)；青鏈霉素混合液、w=0.05%胰酶、低糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；CCK-8試劑(同仁化學研究所)；RIPA裂解液(碧云天生物技術有限公司)；SOD、MDA、GSH-PX、BCA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

AB135-S電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司, 型號：GB/T 23111)；UVA燈管(飛利浦公司, 型號：TL 8W)；超凈工作臺(上海蘇凈, 型號：SW-CJ-ID)；顯微鏡(日本OLYMPUS公司, 型號：SZ51/SZ61)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋, 型號：MCO-15AC)；酶標儀(美國BIO-RAD公司, 型號：iMark)。

1.3 小鼠成纖維細胞的培養(yǎng)

NIH 3T3細胞以DMEM作為培養(yǎng)基(內(nèi)含w=1%雙抗，w=10%胎牛血清)，接種于含4 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，將其置于37 ℃、φ=5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱。2 d后，倒置顯微鏡下觀察，當細胞融合達80%以上，棄去培養(yǎng)液，用0.05%胰酶潤洗培養(yǎng)瓶，再加入w=0.05%胰酶1 mL，置于培養(yǎng)箱中消化30 s，當細胞變圓、間隙變大時，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細胞移至離心管，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基2 mL吹打40次使成為細胞懸液，按1∶3比例傳代，獲取足夠的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 UVA最適劑量的選擇

隨機將細胞分為兩組：正常對照組和UVA損傷組。取對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，接種細胞密度約為105mL-1，體積為100 μL，每組設6個復孔，另設置6個調(diào)零孔(內(nèi)加100 μL培養(yǎng)基)。于37 ℃，φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，損傷組用8 W UVA紫外線照射細胞，細胞距離輻射光源8 cm，輻射時間分別為20 min、30 min、1 h、2 h，在顯微鏡下觀察輻照后的細胞形態(tài)，更換培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，從培養(yǎng)箱中取出，各孔加入CCK-8試劑10 μL，放入37 ℃，φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)4 h，在波長450 nm處用酶標儀測定細胞液的A值。根據(jù)細胞生長狀態(tài)、細胞液A值確定UVA輻射NIH 3T3細胞的半致死劑量(LD50)。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖活力

實驗分為5組：正常對照組和UVA組(模型組、蘆薈凝膠100 μg·mL-1組、蘆薈凝膠200 μg·mL-1組、蘆薈凝膠400 μg·mL-1組)。

細胞照射方法同1.4，輻射結束后棄上清，樣品干預組加入用培養(yǎng)基配制的蘆薈凝膠溶液100 μL，模型組加入相同量的培養(yǎng)基。將細胞放入37 ℃，φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，24 h后從培養(yǎng)箱中取出，各孔(包括調(diào)零孔)加CCK-8試劑10 μL，放入37 ℃，φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)4 h，在波長450 nm處用酶標儀測定細胞液的A值。

每孔實際A值=每孔實測A值-調(diào)零孔實測A均值

1.6 抗氧化損傷指標的測定

實驗分組同1.5。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每組3個復孔，接種細胞密度約為105mL-1，每孔接種細胞懸液2 mL，于37 ℃，φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，紫外線輻照UVA組損傷細胞，照射方法同1.4，棄上清，樣品干預組加入用培養(yǎng)基配制的蘆薈凝膠溶液2 mL，模型組加入相同量的培養(yǎng)基。將細胞放入37 ℃，φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，24 h后取出，加入RIPA細胞裂解液200 μL，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸，5 s后吸出裂解液，14 000 r/min離心5 min，取上清液，加入500 μL RIPA細胞裂解液稀釋，稀釋液嚴格參照試劑盒說明分別測細胞內(nèi)的SOD、GSH-PX和MDA水平。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 UVA輻射損傷NIH 3T3細胞結果

顯微鏡下觀察，UVA輻射組與正常細胞對照組相比，NIH3T3細胞均有不同程度的損傷，且呈現(xiàn)出劑量依賴性：輻射20 min時損傷程度最輕，只有約10%的細胞損傷；2 h時損傷最重，已有超過60%的細胞死亡。綜合分析實驗結果，選擇1 h的UVA輻射時間作為實驗造模的理想劑量。結果見圖1。

圖1 UVA輻射損傷NIH 3T3細胞結果Fig.1 Damage results of NIH 3T3 cells irradiated by UVA

2.2 蘆薈凝膠對UVA輻射損傷NIH 3T3細胞修復作用的結果

在圖2所示的質(zhì)量濃度下，蘆薈凝膠對UVA損傷的NIH 3T3細胞有顯著的修復作用。經(jīng)方差分析，不同組間的測量指標總的來講差別有統(tǒng)計學意義，UVA輻照組A值顯著低于正常對照組(P<0.01)，細胞存活率僅為73.14%；蘆薈凝膠干預組A值雖仍低于正常對照組，但已明顯高于UVA輻照組(P<0.05)，且蘆薈凝膠的紫外修復作用呈劑量依賴性。結果表明，UVA輻射對NIH 3T3細胞造成明顯損傷，而蘆薈凝膠可以提高受UVA損傷NIH 3T3細胞的增殖活性。

圖2 不同質(zhì)量濃度蘆薈凝膠對UVA輻射NIH 3T3細胞增殖活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Aloe vera gel on the proliferation of NIH 3T3 cells irradiated by UVA(與UVA照射組比較 *P<0.05**P<0.01與正常對照組比較 ##P<0.01)

2.3 蘆薈凝膠抗氧化損傷檢測結果

表1經(jīng)方差分析，不同給藥組的測量指標與模型組相比，總的來講差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。UVA照射組、蘆薈凝膠處理組的SOD、GSH-Px值均較正常對照組低，但蘆薈凝膠組的SOD、GSH-Px含量雖然低于正常對照組，卻明顯高于UVA照射組(P<0.05)，且呈劑量依賴性，提示了蘆薈凝膠可以對抗UVA輻射所致的SOD、GSH-Px消耗；MDA結果顯示，UVA輻射組顯著高于正常對照組(P<0.01)，蘆薈凝膠高、中、低劑量組較UVA照射組MDA含量均有不同程度的下降，說明UVA照射引起了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的顯著升高，UVA產(chǎn)生的氧自由基大量攻擊細胞生物膜，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，而蘆薈凝膠可以減少MDA的生成，阻止大量氧自由基對生物膜的攻擊。

UVA照射使NIH 3T3細胞受損，生長受到抑制，加入一定量的蘆薈凝膠可以減輕NIH 3T3細胞的損傷，說明了蘆薈凝膠對細胞受到的光損傷有保護作用。

表1 不同質(zhì)量濃度蘆薈凝膠對UVA輻射NIH 3T3細胞內(nèi)的SOD、MDA及GSH-Px含量的影響1)(n=6)Table 1 Effects of different concentrations of Aloe vera gel on the contents of SOD,MDA and GSH-Px in NIH 3T3 cells irradiated by UVA (n=6)

1)表中SOD, MDA 和GSH-Px的含量均以每mg蛋白計；與UVA照射組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論和結論

皮膚是最早反映機體衰老的組織，而紫外輻射是誘發(fā)皮膚老化重要的，也是最常見的環(huán)境因素之一。成纖維細胞是真皮層的結構基礎，是主要的功能細胞，同時也是紫外線輻射的重要靶位之一。UVA輻射是一種重要的氧化應激因素[11]，UVA照射皮膚能夠增加細胞中活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生，生物膜是ROS的主要攻擊目標，ROS攻擊生物膜上磷脂中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈式反應[12-13]。

蘆薈多糖是蘆薈凝膠中的主要成分[14]，研究表明，中藥多糖具有廣泛的抗氧化活性，可以通過提高皮膚組織或細胞中的抗氧化酶活性、增強其清除自由基的能力、降低脂質(zhì)過氧化物水平，從而改善紫外線輻射引起的細胞損傷[15]。本研究中，經(jīng)UVA照射后，模型組細胞增殖受到了顯著抑制；蘆薈凝膠不同劑量組給藥后均有一定的促進細胞增殖作用，說明蘆薈凝膠在體外研究中能夠促進成纖維增殖，延緩皮膚光老化。

正常皮膚細胞中有比較完善的氧化與抗氧化系統(tǒng)，如：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、抗壞血酸、維生素E等，它們可以快速清除細胞內(nèi)的ROS，保持細胞與組織的穩(wěn)定與平衡[16]。SOD是機體抗自由基損傷的重要物質(zhì)基礎，其活力的提高，有利于機體抗氧化，能保護細胞免受損傷；MDA的量常用來反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度；GSH-Px是廣泛存在于機體中的一種催化過氧化氫分解的酶，起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。本實驗結果表明，紫外線可以通過抑制細胞內(nèi)SOD、GSH-Px的酶活性，降低其清除ROS的能力，使機體中脂質(zhì)過氧化物含量增多，造成細胞及組織損傷；而加入蘆薈凝膠后，藥物干預組細胞內(nèi)SOD、GSH-Px含量均較模型組顯著提升，MDA含量下降，提示一定量的蘆薈凝膠可以對抗UVA引起的成纖維細胞氧化損傷，為開發(fā)天然防曬劑提供科學的理論依據(jù)。

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