徐 新，李佳川，王 元，龍 怡

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸學(xué)校，四川 成都 610075)

藤茶[1-3]是湖南武陵山區(qū)土家族常用的藥食保健資源，也是四川、湖北、貴州等地的彝族、苗族[4-5]少數(shù)民族習(xí)用飲品，具有悠久的應(yīng)用歷史、較高的營養(yǎng)成分和醫(yī)藥保健價值，開發(fā)價值很大.現(xiàn)代研究表明，藤茶富含豐富的多糖類、黃酮類以及多酚類化合物[6]，具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、調(diào)血脂[10-11]等多種藥理活性.近年來，隨著生活水平的提高，心腦血管疾病、代謝性疾病已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，早期防治臨床意義顯著.諸多研究提示，氧化應(yīng)激損傷是諸多心腦血管疾病、代謝性疾病發(fā)生的共同病理生理基礎(chǔ)，這些疾病的發(fā)生與機(jī)體“過量”的氧化應(yīng)激發(fā)生呈正相關(guān).因此，本研究以武陵山區(qū)土家族常用的道地藥食資源藤茶為研究對象，在中醫(yī)藥及民族醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，分別建立DPPH自由基清除法、羥基自由基清除法、超氧陰離子清除法、總抗氧化能力測定法共4種體外抗氧化模型，系統(tǒng)觀察藤茶的體外抗氧化保健活性，以期為藤茶的合理使用和為進(jìn)一步保健產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥物

野生藤茶，產(chǎn)地湖南省張家界，經(jīng)西南民族大學(xué)顧健教授鑒定為顯齒蛇葡萄科Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.wang的干燥嫩莖葉.采用水煎煮提取制備成1 g(原藥材)/mL濃度藥液，-20℃保存?zhèn)溆?抗壞血酸(Vc)，北京百靈威科技有限公司，批號:LDC0Q76.

1.2 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，sigma，批號:D9132；水楊酸，鎮(zhèn)江前進(jìn)化工有限公司，批號:DS0122；抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20170328和20170329.

1.3 儀器

Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀，Thermo Scientific；722N可見分光光度計(jì)，上海萊帕德科學(xué)儀器有限公司.

1.4 方法

1.4.1 DPPH自由基的清除率測定

參考Kumaran等[12]方法并稍作修改，分別精密吸取藤茶供試品溶液，置5 mL離心管中，加入無水乙醇補(bǔ)足至2 mL，搖勻.加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液溶液，搖勻，避光放置30 min，離心，取上清液于517 nm下測定吸光度值，每組平行測定三次，取平均值計(jì)算清除率，公式如下:

(式中A0為DPPH乙醇溶液的吸光度值，As為樣品溶液的吸光度值)

1.4.2 對羥基自由基的清除率的測定

參考彭金龍等[13]和蘇秀蘭[14]等方法并稍作修改，分別精密吸取1 mL藤茶供試品溶液，置5 mL離心管中，在離心管中分別加入1 mL 9 mmol/L的Fe-SO4溶液和1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，加入1 mL 30%H2O2啟動反應(yīng)，放入37℃水浴鍋恒溫反應(yīng)30 min，用待測液空白對照管作為空白對照，以Vc作為陽性對照.蒸餾水調(diào)零，用分光光度計(jì)測定波長為510 nm處的吸光度.每組平行測量三次，取均值.清除率公式如下:

(A1:被測液的吸光度；A0:被測液的空白對照；A2:水楊酸的空白對照)

1.4.3 超氧陰離子自由基(O2-·)清除法率的測定

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備藤茶相應(yīng)濃度供試品溶液，按照抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的要求，分別檢測藤茶對超氧陰離子自由基的影響.

1.4.4 總抗氧化能力的測定

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備藤茶相應(yīng)濃度供試品溶液，按照總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒的要求，制備FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，各OD值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線公式，把樣本測定管測得的OD值代入計(jì)算公式，求得藤茶的總抗氧化能力.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)的IC50值.

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶對DPPH自由基的清除作用

DPPH作為一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基試劑，常被用作體外測定藥物的抗氧化活性篩選使用.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如表1和圖1，隨著藤茶濃度的增加，藤茶對DPPH自由基的清除作用呈濃度依賴性的增加，其IC50值為 33.805 μg/mL，當(dāng)濃度達(dá)到 190.6 μg/mL時，清除率達(dá)到90%以上.

表1 藤茶對DPPH自由基的清除作用(±s)Table 1 Scavenging effect of Vine tea on DPPH radical(±s)

表1 藤茶對DPPH自由基的清除作用(±s)Table 1 Scavenging effect of Vine tea on DPPH radical(±s)

組別 濃度(μg/mL) 樣本數(shù)(n) 清除率(%)藤茶提取物 238.3 3 91.3±2.4 190.6 3 90.9±2.3 152.5 3 89.5±3.1 122.0 3 87.4±2.1 97.6 3 83.7±2.2 78.1 3 79.1±2.5 62.5 3 72.3±2.1 50.0 3 65.2±1.5 40.0 3 55.3±1.6 32.0 3 46.1±1.1 25.6 3 39.1±1.2 20.5 3 32.1±1.8抗壞血酸 50.0 3 88.4±2.6 40.0 3 85.9±2.4 32.0 3 80.7±1.9 25.6 3 74.6±2.1 20.5 3 65.2±1.7

圖1 藤茶提取物清除DPPH自由基濃度-清除率曲線(量效關(guān)系)Fig 1 The concentration-clearance rate curve of Vine tea extractive’s scavenging on DPPH radical(dose-effect relationship)

2.2 藤茶對羥基自由基的清除作用

羥基自由基的清除率是反應(yīng)藥物抗氧化活性的臨床應(yīng)用重要指標(biāo)，羥基自由基能與體內(nèi)多種物質(zhì)相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如表2和圖2所示，藤茶在1.6～200 mg/mL范圍內(nèi)，對羥基自由基的消除率呈濃度依賴性的增加，其IC50值為18.713 mg/mL，當(dāng)濃度達(dá)到150 mg/mL時，清除率達(dá)到90%以上.

表2 藤茶對羥基自由基的清除作用(±s)Table 2 Scavenging effect of vine tea on hydroxyl radicals(±s)

表2 藤茶對羥基自由基的清除作用(±s)Table 2 Scavenging effect of vine tea on hydroxyl radicals(±s)

組別 濃度(mg/mL) 樣本數(shù)(n) 清除率(%)藤茶提取物 200.0 3 95.5±3.2 150.0 3 91.7±2.4 100.0 3 86.7±2.6 80.0 3 81.4±2.2 50.0 3 73.1±1.8 25.0 3 56.3±1.7 12.5 3 37.5±1.2 6.3 3 22.2±0.9 3.2 3 13.5±1.2 1.6 3 8.8±0.8抗壞血酸 6.3 3 86.7±3.1 3.2 3 84.4±2.5 1.6 3 75.6±1.7 0.78 3 58.0±1.4 0.39 3 29.0±1.1

圖2 藤茶提取物清除羥基自由基濃度-清除率曲線(量效關(guān)系)Fig 2 The concentration-clearance rate curve of Vine tea extractive’s scavenging on hydroxyl radicals(dose-effect relationship)

2.3 藤茶對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子是活性氧的一種，過量會對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如表3和圖3，藤茶顯示出較好的抗超氧陰離子自由基的作用.藥物在1.6～200 mg/mL范圍內(nèi)，抗超氧陰離子自由基的活力值呈濃度依賴性的增加，當(dāng)藤茶濃度達(dá)到200 mg/mL時，其活力值最高可達(dá)到263.1U/L.

表3 藤茶對超氧陰離子的清除作用(x-±s)Table 3 The scavenging effect of Vine tea on superoxide anion(x-±s)

圖3 藤茶清除超氧陰離子自由基濃度-活力值曲線(量效關(guān)系)Fig 3 The concentration-vitality value curve of Vine tea’s scavenging on superoxide anion radicals(dose-effect relationship)

2.4 藤茶總抗氧化能力(FRAP法)的測定

以FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)品 OD值為橫坐標(biāo)，各 OD值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，用作圖軟件制得曲線公式為 y＝4.9958x-0.5785(R2＝0.999).將各濃度藤茶的測定OD值帶入曲線公式，即得表4，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如圖5所示，藤茶在0.195～6.30 mg/mL的濃度內(nèi)，總抗氧化能力變化幅度較小，但隨著劑量的增加，在12.50～50.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，藥物總抗氧化能力呈濃度依賴性的增加，最高值達(dá)到19.764 mM.

圖4 總抗氧化能力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 The standard curve of total antioxidant capacity

表4 藤茶對總抗氧化能力的影響(x-±s)Table 4 Effect of vine tea on total antioxidant capacity(x-±s)

圖5 藤茶濃度-總抗氧化能力曲線(量效關(guān)系)Fig 5 The concentration-total antioxidant capacity curve of Vine tea(dose-effect relationship)

3 討論與結(jié)論

活性氧與自由基損傷對人體健康的影響深刻而廣泛，生物機(jī)體正常代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子、羥基自由基等多種活性氧自由基，這些過多的自由基是造成機(jī)體組織病理性損傷的病理基礎(chǔ).在正常情況下，機(jī)體的自由基處于正常的動態(tài)平衡，機(jī)體產(chǎn)生的過多自由基會迅速被體內(nèi)的清除劑所清除.但當(dāng)機(jī)體的抗氧化防御體系受到損傷時，人體各系統(tǒng)的代謝發(fā)生紊亂，從而引發(fā)機(jī)體心腦血管疾病、代謝性疾病甚至腫瘤等一系列疾病的發(fā)生[15].尤其隨著生活水平的提高，長期的高血糖、高血脂的作用，加劇造成這一系列病理性的“過氧化”，通過氧化應(yīng)激加速損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮舒縮功能障礙或異常，導(dǎo)致血管壁動脈粥樣硬化版塊形成，從而加劇了冠心病、心肌梗死及腦血栓、腦出血等心腦血管突發(fā)事件的發(fā)生.

藤茶是湖南武陵山區(qū)土家族常用保健飲品，藥食資源道地，開發(fā)價值很大.深入開展民族地區(qū)特色藥食資源保健產(chǎn)品開發(fā)，對發(fā)揮中醫(yī)藥及民族醫(yī)藥“藥食同源”的保健特色優(yōu)勢，促進(jìn)民族地區(qū)特色食藥資源的可持續(xù)發(fā)展具有很大的意義；同時，將民族地區(qū)特色藥食資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的特色產(chǎn)品，可為民族地區(qū)實(shí)現(xiàn)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和良好的社會效益.

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，藤茶提取物對DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基均顯示出明顯的清除或抑制作用，總抗氧化能力明顯增加，且上述作用均呈一定的劑量依賴性.其中藥物對DPPH清除作用的IC50值為0.338 mg/mL，對羥基自由基清除作用的IC50值為18.713 mg/mL，對超氧陰離子抑制的最大活性值高達(dá)263.1 U/L，總抗氧化能力也達(dá)到19.764 mM.上述結(jié)果從不同抗氧化機(jī)制途徑方面證實(shí)了藤茶具有確切的體外抗氧化作用，值得進(jìn)一步研究開發(fā).

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