李俊峰,張揚揚,李 明
(通化師范學院食品科學與工程學院,吉林通化 134001)
香菇為擔子菌亞門,擔子菌綱,傘菌目,側耳科。香菇屬真菌,因其口味鮮美、香味濃郁、營養(yǎng)豐富,有顯著的藥用及滋補作用而被譽為“蘑菇皇后”“抗癌新兵”“菌中之秀”[1]。香菇多糖是從香菇中分離出的一種高純度、高分子結構的葡聚糖[2],在免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒和抗感染等方面有很強的活性,其療效高、毒副作用小,具有很高的研究和開發(fā)價值。因此,香菇多糖被廣泛應用于食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健等領域[5-6]。目前,多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、稀酸稀堿浸提法、微波提取法、酶解法等幾種方法[7]。傳統(tǒng)的浸提法時間長、得率低、能耗大,為克服傳統(tǒng)提取方法的缺點,許多學者研究了亞臨界水提取法[8],超臨界二氧化碳萃取技術與熱水浸提法[9-10],超濾膜技術提取法[11]、纖維素酶協(xié)同超聲波法[12]、響應面法優(yōu)化熱水浸提法[13]等。
研究顯示,在香菇等真菌類食品原料中,活性多糖主要存在于由纖維素和幾丁質(zhì)構成的細胞壁中[14]。為了提取活性多糖,首先必須破壞纖維素和幾丁質(zhì)在細胞壁中構成的網(wǎng)絡結構,從而將活性多糖釋放出來,才能充分并有效地提取活性多糖。但是,在現(xiàn)有的酶法提取香菇多糖的試驗中,主要研究纖維素酶、果膠酶和蛋白酶對香菇多糖提取的影響,而幾丁質(zhì)酶在香菇多糖的提取研究中還沒有報道,而幾丁質(zhì)酶的存在可能會阻礙一部分活性多糖的釋放,導致活性多糖不能被充分提取。
試驗首次采用幾丁質(zhì)酶輔助提取香菇多糖,并與纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶進行對比,從而考查幾丁質(zhì)酶對酶法提取香菇多糖得率的影響。研究結果對補充香菇多糖提取的研究內(nèi)容、促進香菇多糖的開發(fā)與應用具一定的意義。
干香菇(市售);苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純;幾丁質(zhì)酶(活力≥200 U/g)、纖維素酶(活力≥400 U/mg)、果膠酶(活力≥50 U/g)、木瓜蛋白酶(活力≥800 U/mg),上海一基實業(yè)有限公司提供。
FW-200型高速萬能粉碎機,北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品;SY200型振動篩,新鄉(xiāng)市特昌振動機械有限公司產(chǎn)品;TDL-40B型離心機,上海安婷科學儀器廠產(chǎn)品;RE-2000型旋轉蒸發(fā)儀,鄭州市煜城儀器有限公司產(chǎn)品;722S型可見分光光度計,上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品。
1.3.1 香菇多糖的提取
(1)工藝流程。粉碎→過篩→稱量→提取→抽濾→旋轉蒸發(fā)→醇沉→離心→多糖。
(2) 香菇多糖的提取。將干香菇粉碎過80目篩,稱取一定量香菇干粉,回流提取,將提取液進行抽濾,濃縮至1/3左右,用4倍體積的95%乙醇浸提12 h,離心后得到香菇多糖。1.3.2 熱水浸提法單因素試驗
(1)不同料液比對香菇多糖得率的影響。固定提取溫度55℃,提取時間2 h,物料粒度80目,考查料液比為 1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,1∶35時,對香菇多糖得率的影響。
(2)不同提取溫度對香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25,提取時間2 h,物料粒度80目,考查溫度為55,75,85,95,105℃時,對香菇多糖得率的影響。
(3)不同提取時間對香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25,提取溫度55℃,物料粒度80目,考查提取時間為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h時,對香菇多糖得率的影響。
(4)不同物料粒度對香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25,提取溫度55℃,提取時間2 h,考查物料粒度為40,60,80,100,120目時,對香菇多糖得率的影響。
1.3.3 正交試驗設計
選取料液比、提取時間、提取溫度、原料粒度4個因素,進行四因素三水平正交試驗,每組試驗做3次平行?;趩我蛩卦囼灲Y果,選擇料液比分別為1∶25,1∶30,1∶35;提取時間分別為 1.5,2.0,2.5 h;粒度60,80,100目;提取溫度分別為75,85,105℃進行正交試驗。
正交試驗設計見表1。
1.3.4 酶法輔助提取香菇多糖
將干香菇粉碎過80目篩,稱取5.00 g香菇干粉,加入125 mL蒸餾水中,加入酶制劑,在一定條件下酶解,酶解后于85℃條件下提取2 h,將提取液進行抽濾,在濃縮至1/3左右,用4倍體積的95%乙醇浸提12 h,離心后得到香菇多糖。
表1 正交試驗設計
1.3.5 檢測方法
利用苯酚硫酸法[15]測定提取物中多糖含量,先制作葡萄糖標準曲線,然后在相同條件下測定樣品吸光度,通過代入標準曲線換算出樣品得率。
以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制標準曲線如圖1所示。標準曲線方程為Y=1.528 9X+0.054 4,R2=0.979 6。
葡萄糖標準曲線見圖1。
圖1 葡萄糖標準曲線
2.2.1 不同料液比對香菇多糖得率的影響
不同料液比對香菇多糖得率的影響見圖2。
圖2 不同料液比對香菇多糖得率的影響
由圖2可知,提取過程中,料液比為1∶15~1∶25時,香菇多糖得率逐漸增高,可能是因為隨著液料比的增加,提高了多糖從物料顆粒內(nèi)部向溶劑擴散的傳質(zhì)效率,從而使多糖得率不斷上升。當料液比在1∶25~1∶35時,得率的上升具有漸漸放緩的趨勢。根據(jù)試驗所得結果,同時考慮提取成本,選擇為1∶25為最佳提取料液比。
2.2.2 不同提取溫度對香菇多糖得率的影響
不同提取溫度對香菇多糖得率的影響見圖3。
圖3 不同提取溫度對香菇多糖得率的影響
由圖3可知,當提取溫度為55~105℃時香菇多糖得率逐漸增高,之后放緩。當提取溫度為105℃時達到最大值。這可能是由于溫度的上升提高了多糖在水中的溶解度,從而提高了多糖的得率。但是,當提取溫度高于85℃時,多糖得率的上升并不顯著。因此,為了不增加提取過程的能耗,確定提取溫度為85℃。
2.2.3 不同提取時間對香菇多糖得率的影響
不同提取時間對香菇多糖得率的影響見圖4。
由圖4可知,當提取時間在1~2 h時,隨提取時間的增加,香菇多糖得率也隨之增高。當提取時間為2 h時,香菇得率最高。當提取時間在2~3 h時,隨提取時間的增加,香菇多糖得率降低。這可能是因為提取時間過長,香菇中的其他水溶性成分溶出增加,抑制了香菇多糖的溶出。因此,根據(jù)試驗結果確定提取時間為2 h。
2.2.4 不同物料粒度對香菇多糖得率的影響
不同物料粒度對香菇多糖得率的影響見圖5。
由圖5可知,粒度為40~80目時,香菇多糖得率隨物料粒度的增加而上升,當物料粒度為80目時,香菇多糖得率最高。當物料粒度在80~100目時,隨物料粒度的增加,香菇多糖得率不斷降低。這可能是因為粒度過低,在粉碎過程中破壞了香菇多糖的結構,導致多糖得率降低。因此,根據(jù)試驗結果確定物料粒度為80目。
根據(jù)正交試驗設計表,選取料液比、提取時間、提取溫度、原料粒度4個因素,進行四因素三水平正交試驗。
正交試驗結果見表2。
表2 正交試驗結果
由表2可知,對香菇多糖得率影響因素由大到小為提取時間>料液比>物料粒度>提取溫度。水平2的香菇得率最高,試驗結果最好,試驗水平組合為A1B2C2D2,而由K值可知,試驗最佳組合為A3B2C2D2。驗證試驗結果為1.678%,得率高于A1B3C2D2。由正交試驗可得,香菇多糖最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶35,提取溫度105℃,提取時間2 h,物料粒度80目,香菇多糖得率為1.678%。
為了得出幾丁質(zhì)酶對香菇多糖的影響,試驗中將幾丁質(zhì)酶與木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的酶法輔助提取結果進行了比較。
不同酶法輔助提取香菇多糖的結果見表3。
表3 不同酶法輔助提取香菇多糖的結果
通過查閱酶法提取香菇多糖的研究文獻,歸納得出木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶的最佳酶解條件為酶解溫度40℃左右,酶解pH值5左右,酶使用量0.5%左右。因此,為了將不同酶的提取結果進行比較,試驗中將4種酶的酶解條件保持一致。
由表3可知,酶法輔助提取香菇多糖的得率都高于水提法,且?guī)锥≠|(zhì)酶輔助提取法的得率最高。這一結論說明,為了充分提取存在于香菇細胞壁中的活性多糖,必須破壞纖維素和幾丁質(zhì)在細胞壁中構成的網(wǎng)絡結構,僅破壞纖維素、蛋白質(zhì)和果膠還不足以充分提高多糖的得率。因此,研究結果證明,幾丁質(zhì)酶在提高香菇多糖的得率方面具有顯著作用。
通過單因素試驗和正交試驗,考查了不同料液比、提取溫度、原料粒度和提取時間對香菇得率的影響,從而得出熱水提香菇多糖最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶35,提取溫度105℃,提取時間2 h,物料粒度80目,香菇多糖得率為1.678%。酶法提取試驗得出,木瓜蛋白酶提取香菇多糖得率為1.916%,果膠酶提取香菇多糖得率1.926%,纖維素酶提取香菇多糖得率1.684%,幾丁質(zhì)酶提取香菇多糖得率2.05%。研究結果可以證明,幾丁質(zhì)酶對香菇多糖的提取具有顯著的影響。
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