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        苜蓿葉蛋白ACE抑制肽的制備

        2018-04-21 05:34:55馬洪鑫李明生高丹丹陳士恩
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2018年7期
        關(guān)鍵詞:解物物質(zhì)量木瓜

        馬洪鑫,余 瓊,李明生,高丹丹,陳士恩

        (西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

        0 引言

        目前,高血壓已成為危害國民身體健康的頭號殺手,也是引起腦血管病、心臟病、腎臟病發(fā)生和死亡的最主要因素。由高血壓造成的相關(guān)并發(fā)癥給社會和家庭造成了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。高血壓是一種人類最常見的慢性病,治療和預(yù)防高血壓是目前人們最為關(guān)注的醫(yī)學(xué)課題。

        高血壓是持續(xù)血壓過高的疾病,是一種以動脈壓升高為特征的疾病,主要原因是體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE) 的調(diào)節(jié)作用[1]。ACE既是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶,也是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,對高血壓有著至關(guān)重要的調(diào)控作用。ACE抑制劑是治療高血壓病的有效藥物,但臨床所用的ACE抑制劑大多為化學(xué)合成劑,會產(chǎn)生許多不良反應(yīng),如咳嗽、味覺功能紊亂、皮疹等。因此,人們越來越傾向于尋找天然來源的ACE抑制劑。苜蓿是一種粗蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富的豆科牧草,其葉片蛋白含量很高。苜蓿葉蛋白是一種具有高開發(fā)價值的新型蛋白質(zhì)產(chǎn)品,苜蓿葉蛋白經(jīng)酶解提取后,可制備出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE) 活性物質(zhì)。目前,國內(nèi)外對苜蓿葉蛋白的研究與開發(fā)主要集中于提取工藝和營養(yǎng)功效上,而有關(guān)其蛋白質(zhì)的功能機理及其酶解后的蛋白肽研究甚少,特別是ACE抑制肽的生物活性研究更是鮮見報道。試驗以苜蓿葉為原料提取苜蓿葉蛋白,并利用不同蛋白酶對其進(jìn)行酶解,以制備出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性物質(zhì)[2],并以酶解溫度、酶解pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo),選出最佳酶解條件,為苜蓿的開發(fā)和利用提供新的途經(jīng)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        紫花苜蓿(品種為阿爾岡金),種植于西北民族大學(xué)校園內(nèi)的紫花苜蓿;胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、馬脲酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、乙酸乙酯,1 mol/L氫氧化鈉、1mol/L鹽酸、ACE。

        1.2 主要設(shè)備

        ISO 9001型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品;JJ-2型組織搗碎勻漿機,江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;H2050R型臺式高速冷凍離心機,湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品;LGJ-10型真空冷凍干燥機,北京松原華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;數(shù)控定時超聲波清洗機,上海聲彥超聲波儀器有限公司產(chǎn)品;微電腦便攜式酸度計;UV-1800型紫外分光光度計,深圳市怡華新電子有限公司產(chǎn)品。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 樣品的采集及預(yù)處理

        苜蓿的最佳收割期為初花期,以2~3茬的苜蓿為試驗材料,收割后的苜蓿應(yīng)在陰涼處存放,存放時間最好不要超過3 d,將收割的苜蓿清洗去除雜物,然后去桿取葉,便于打漿。

        1.3.2 苜蓿葉蛋白的提取

        稱取一定量的苜蓿葉,按適當(dāng)?shù)牧弦罕扔媒M織搗碎機,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min打漿5 min,然后用紗布過濾汁液,再用濾紙過濾,得到含有苜蓿葉蛋白的苜蓿綠色草汁。采用2次水浴加熱的方法,將含有苜蓿葉蛋白的苜蓿綠色草汁加熱到50℃,然后在恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫1 h。冷卻后裝入離心管中,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心25 min,取上清液。再次采用水浴加熱的方法將第1次加熱冷卻離心后的上清液加熱到85℃,然后在恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫7 min。冷卻后裝入離心管,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心25 min,即得到苜蓿葉蛋白濃縮物[3-4]。采用真空冷凍裝置干燥,即得到干燥的苜蓿蛋白粉。

        1.3.3 酶解苜蓿葉蛋白粉制備ACE抑制肽

        取適量苜蓿葉蛋白粉用蒸餾水將其溶解為一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酶解底物,在90℃恒溫水浴鍋中預(yù)處理10 min,冷卻至設(shè)定溫度后,用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至最適范圍內(nèi),酶用量為底物質(zhì)量的3.5%,酶解過程中用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)維持pH值在各種酶最適pH值±0.05之間。酶解結(jié)束后在沸水浴中滅酶10 min,迅速冷卻,并在4℃,10 000 r/min條件下離心20 min,取上清液測定ACE抑制率[5],將上清液冷凍干燥即得苜蓿ACE抑制肽。

        不同蛋白酶用量及反應(yīng)條件見表1。

        表1 不同蛋白酶用量及反應(yīng)條件

        (1) 酶解溫度對苜蓿葉蛋白提取的影響。以ACE抑制率為指標(biāo),設(shè)45,50,55,60,65℃5個處理水平進(jìn)行試驗,按1.3.3操作考查酶解溫度對苜蓿葉蛋白提取的影響。

        (2) 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苜蓿葉蛋白提取的影響。以ACE抑制率為指標(biāo),設(shè)定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,3%,4%,5%,6%5個處理水平進(jìn)行試驗,按1.3.3操作考查底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苜蓿葉蛋白提取的影響。

        (3)酶解pH值對苜蓿酶葉蛋白提取的影響。以ACE抑制率為指標(biāo),以pH值6.5~8.5作為沉降苜蓿葉蛋白的最佳范圍。以1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值,設(shè)定pH值6.5,7.0,7.5,8.0,8.5共5個處理水平進(jìn)行試驗,考查pH值對苜蓿葉蛋白提取的影響,方法同上。

        1.3.4 ACE抑制肽的抑制率測定

        ACE在37℃,pH值8.3的條件下催化分解血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的底物Hip-His-Leu(HHL)產(chǎn)生馬尿酸,該物質(zhì)在波長228 nm處具有特征吸收峰。當(dāng)加入ACE抑制劑時,ACE對HHL的催化分解作用受到抑制,馬尿酸的生成量減少。通過測定加入抑制劑前后生成馬尿酸紫外吸收的大小差別,即可計算出抑制率的大小[6-9]。

        吸取 80 μL 酶解物加入 200 μL,5 mmol HHL(含有200 mmol/L NaCl硼酸緩沖液,pH值8.3) 中,于37℃條件下水浴預(yù)熱5 min。立即加入20 μL ACE(0.002 U/mL) 啟動反應(yīng),恒溫保持30 min后,加入0.25 mL濃度為1 mol/L的HCl終止反應(yīng),然后取1.5 mL乙酸乙酯加入各管,均勻混合15 s,以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min后,取出1.0 mL酯層轉(zhuǎn)入另一試管,在95℃的烘箱中經(jīng)30 min烘干,再重新溶于3.0 mL去離子水中,測定OD228處光密度[10]。

        酶活單位定義:1單位酶活定義為在37℃,1 min內(nèi)催化HHL形成1 mol馬尿酸的酶用量?;钚砸种坡拾聪率接嬎悖?/p>

        式中:A——ACE及ACE抑制肽都加入的條件下測得的吸光度;

        B——不加ACE抑制肽條件下測定的吸光度;

        C——不加ACE條件下測得的吸光度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同蛋白酶酶解物的ACE抑制率不同蛋白酶酶解物的ACE抑制率見圖1。

        圖1 不同蛋白酶酶解物的ACE抑制率

        采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶6種商品蛋白酶酶解苜蓿蛋白,對其4 h酶解物的ACE抑制率進(jìn)行測定。從圖1可知,不同蛋白酶的酶解物的ACE抑制率是有一定差異的,蛋白酶的選擇在生產(chǎn)生物活性肽的過程中十分重要。其中,木瓜蛋白酶水解物的ACE抑制效果最好,抑制率達(dá)到90.69%±2.77%,其他蛋白酶水解物也有一定的ACE抑制活性,抑制率如下:風(fēng)味蛋白酶55.36%±0.98%,堿性蛋白酶54.39%±2.38%,胰蛋白酶48.01%±1.07%,中性蛋白酶41.74%±1.22%,胃蛋白酶39.28%±1.87%。因此,選擇木瓜蛋白酶酶解苜蓿蛋白制備ACE抑制肽。

        2.2 酶解單因素試驗結(jié)果

        2.2.1 酶解溫度對ACE抑制率的影響

        酶解溫度對ACE抑制率的影響見圖2。

        圖2 酶解溫度對ACE抑制率的影響

        在酶解溫度分別為45,50,55,60,65℃,酶解時間為4 h時,酶解溫度對ACE抑制率如圖2所示。當(dāng)酶解溫度從45℃升高到55℃,ACE抑制率逐漸升高;當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高時則ACE抑制率呈逐漸下降趨勢。這表明一定范圍內(nèi)酶解溫度上升有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行,但酶解溫度過高,會導(dǎo)致蛋白酶變性,從而使酶活性減弱。當(dāng)酶解溫度為55℃時,ACE抑制率最高(83.26%±0.61%),因此確定最佳酶解溫度為55℃。

        2.2.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ACE抑制率的影響

        底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ACE抑制率的影響見圖3。

        圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ACE抑制率的影響

        觀察了不同酶用量與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%,3%,4%,5%,6%;酶解溫度50℃,酶解pH值7.5,酶解時間4 h時進(jìn)行酶解。從圖3可看出,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)從2%增加到4%時,酶解物的ACE抑制率明顯增加(68.85%±0.04%~81.18%±0.04%);而當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增加到6%時,酶解物的ACE抑制率反而有所下降(51.03%±0.07%)。由此可見,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%(抑制率81.18%±0.04%) 最為適宜。

        2.2.3 酶解pH值對ACE抑制率的影響

        酶解pH值對ACE抑制率的影響見圖4。

        圖4 酶解pH值對ACE抑制率的影響

        木瓜蛋白酶的作用pH值范圍較廣,所以酶解pH值從6.5~8.5的梯度進(jìn)行分析。從圖4可看出,木瓜蛋白酶在不同pH值條件下酶解苜蓿蛋白,其酶解產(chǎn)物的ACE抑制率有顯著差異。在酶解pH值從6.5~7.5時,酶解物的ACE抑制率逐漸增加;當(dāng)酶解pH值為7.5時,ACE抑制率達(dá)到最大(64.87%±0.49%)。當(dāng)酶解pH值繼續(xù)增加時,ACE抑制率隨著酶解pH值的增加而下降。由此可見,木瓜蛋白酶酶解苜蓿蛋白酶的最適pH值為7.5。

        3 結(jié)論

        苜蓿葉蛋白來源廣泛、營養(yǎng)豐富,不含動物性膽固醇,蛋白質(zhì)中氨基酸含量豐富,是一種營養(yǎng)價值豐富且能降血脂的保健食品成分。試驗?zāi)康氖呛Y選酶解制備ACE抑制肽的最佳用酶,根據(jù)試驗結(jié)果可知,在這6種商品蛋白酶中,木瓜蛋白酶抑制率為90.69%±2.77%,是酶解苜蓿蛋白制備ACE抑制肽的最佳用酶,其最佳酶解反應(yīng)條件為酶解pH值7.5,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,酶解時間4 h。試驗僅是對苜蓿葉蛋白ACE抑制肽酶解用酶的初步篩選,試驗中各酶解用酶均在其最適酶解溫度和酶解pH值條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。試驗未進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗,因此無法獲得更精確的影響結(jié)果,這些問題將在接下來的研究中完成。

        參考文獻(xiàn):

        [1]張焱.大豆蛋白ACE抑制肽的酶法制備及分離純化 [D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2007.

        [2]賀玉薇,王松柏,許俊,等.苜蓿天然成分的營養(yǎng)保健功能及其開發(fā)前景 [G]//第二屆中國苜蓿發(fā)展大會暨牧草種子、機械、產(chǎn)品展示會.北京:中國草學(xué)會,2003.

        [3]劉青廣.苜蓿葉蛋白的提取及深加工技術(shù)的研究 [D].石河子:石河子大學(xué),2005.

        [4]王峰.紫花苜蓿葉蛋白四種提取工藝比較研究 [D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2005.

        [5]陳飛平.莧籽ACE抑制的分離純化及其性質(zhì)評價 [D].重慶:西南大學(xué),2013.

        [6]高丹丹.棉籽抗氧化多肽和ACE抑制多肽的研究 [D].南昌:南昌大學(xué),2010.

        [7]Cushman D W,Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung.[J].Biochemical Pharmacology,1971,20 (7):1 637-1 642.

        [8]Chang B W,Chen R L,Huang I J,et al.Assays for angiotensin converting enzyme inhibitory activity.[J].Analytical Biochemistry,2001(1):84-88.

        [9]Shihabi Z K.Analysis of angiotension-converting enzyme by capillary electrophoresis.[J].Journal of Chromatography,1999(5):185-188.

        [10]姚成虎,王志耕,梅林,等.胃蛋白酶水解珠蛋白獲得ACE抑制肽的工藝優(yōu)化 [J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2008,24(5):284-288.◇

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