李　芳，　粟有志，　李艷美，　雷紅琴，　孟　茹，　儲(chǔ)曉剛

（1.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，伊犁 伊寧 835000；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100025）

有機(jī)持久污染物 （POPs）主要包括滴滴涕（DDT）、艾氏劑等有機(jī)氯農(nóng)藥，很多持久性有機(jī)污染物具有致癌、致畸、致突變性，對(duì)人類生存繁衍和可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成重大威脅，對(duì)人類的影響會(huì)持續(xù)幾代。POPs殘效期長(zhǎng)、降解緩慢，因此這些殘留在環(huán)境中可能造成對(duì)新種植物或新儲(chǔ)存食品等的再次污染[1-2]。酵母粉是以甜菜糖蜜原料，以化學(xué)物質(zhì)為氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)源，經(jīng)發(fā)酵罐有氧逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的產(chǎn)物[3]。有機(jī)持久污染物的存在不僅使酵母發(fā)酵過(guò)程中額外損耗原料，破壞原有營(yíng)養(yǎng)條件，增加生產(chǎn)成本，而且嚴(yán)重影響酵母的品質(zhì)、保存與應(yīng)用，甚至?xí)?dǎo)致生產(chǎn)失敗，給企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

加速溶劑萃取 （Accelerated Solvent Extraction，ASE）是在一種高溫度和高壓條件下，設(shè)定溶劑和萃取時(shí)間，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)萃取的方法。該方法大大減少了溶劑用量，方法快速，回收率高，在實(shí)際工作中被廣泛應(yīng)用[4-10]，已被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（EPA）收錄為處理固體樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[11]。QuEChERS技術(shù)以快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、耐用、安全著稱，已廣泛用于農(nóng)藥的檢測(cè)[12-16]。本文作者結(jié)合實(shí)際檢測(cè)工作需要，將ASE萃取和QuEChERS凈化有效結(jié)合，利用GC-MS建立了高活性干酵母粉中12種有機(jī)持久污染物殘留檢測(cè)方法。本方法前處理操作簡(jiǎn)單、快速、對(duì)人體毒害性小、節(jié)省溶劑用量，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均能滿足國(guó)內(nèi)外MRL要求。

1　材料

1.1　儀器和試劑

7890A-7975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （配置7683系列自動(dòng)進(jìn)樣器，增強(qiáng)型化學(xué)工作站），Agilent公司產(chǎn)品；ASE 350型加速溶劑萃取儀，美國(guó)Dionex公司產(chǎn)品；渦旋混合器，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；MG-2200型氮?dú)獯祾邼饪s裝置，日本EYE公司產(chǎn)品；SK8210LHC超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；AIIegra X-22R多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品。

乙腈、正己烷、甲醇、丙酮（均為色譜純），TEDIA天地試劑公司產(chǎn)品；C18散裝吸附劑、N-丙基乙二胺粉（PSA）、氨丙基粉（均為粒徑 40 μm），Agilent公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)品：六氯苯、α-666、β-666、δ-666、p，p′-DDE、狄試劑、γ-666、七氯、艾氏劑、o，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT （純度＞98.5%）， 均購(gòu)自德國(guó) Dr Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，將標(biāo)準(zhǔn)品以丙酮配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存，做樣時(shí)將此溶液依次用正己烷稀釋成 0.025、0.100、0.200、0.500、1.00、2.50 μg/mL 的系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2　色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：DB-1701石英毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min；脈沖壓力為206.8 kPa，脈沖時(shí)間0.75 min，吹掃時(shí)間 1 min；進(jìn)樣口溫度：260℃；柱升溫程序：初始溫度70℃保持1 min，以20℃/min升溫至270℃，保持12.5 min；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源EI（70 eV）；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；輔助加熱器溫度：280℃；溶劑延遲：7 min；采集方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM），條件參見(jiàn)表1。

1.3　加速溶劑萃?。ˋES）條件

以乙腈為提取劑，系統(tǒng)壓力為1 500 psi，溫度80℃，靜態(tài)萃取9 min，循環(huán)次數(shù)1次，沖洗體積為34 mL不銹鋼萃取池的60%，氮?dú)獯祾邥r(shí)間60 s。

表1　12種POPs的保留時(shí)間和特征離子Table 1　Retention times and Selected ions of 12 POPs

1.4　樣品提取與凈化

提取：準(zhǔn)確稱高活性干酵母粉取5.0 g、4.0 g硅藻土混合均勻，全部轉(zhuǎn)入34 mL萃取池中（池底部鋪專用濾膜），按照1.3萃取條件提取。

凈化：將提取溶劑轉(zhuǎn)移至入雞心瓶中于50℃下旋蒸近干，用正己烷定容至10.0 mL，移取8.0 mL于15 mL離心管中加入50 mg PSA，渦旋，離心，吸取上清液5.0 mL置于具塞試管中，氮吹近干，用正已烷準(zhǔn)確定容至1.0 mL，旋渦混合混勻，供氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1　提取溫度的選擇

以乙腈為提取溶劑，靜態(tài)萃取時(shí)間為9 min時(shí)，比較了 30、50、70、80、90 ℃ 5 種溫度條件下的萃取效果，30℃時(shí)部分有機(jī)持久性污染物的回收率達(dá)不到檢測(cè)要求，α-666的回收率僅為48.0%；隨著溫度的增高，大部分的有機(jī)持久性污染物回收率逐漸上升，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，除α-666外12種POPs的回收率不再上升，回收率范圍在74.5%～111.7%；然而當(dāng)提取溫度為90℃時(shí)，雖然α-666的回收率有所改善，但基質(zhì)干擾顯著增加（不同提取溫度下樣品的色譜圖見(jiàn)圖1所示），故提取溫度選擇80℃。隨著溫度的增高，目標(biāo)提取物分子和樣品基體之間的作用力如范德華力、氫鍵減弱，加速了目標(biāo)提取物分子的解析動(dòng)力學(xué)過(guò)程，提取效果改善明顯。

2.2　靜態(tài)萃取時(shí)間的選擇

以乙腈為提取溶劑，萃取溫度為80℃時(shí)，進(jìn)一步確定最佳的萃取時(shí)間，比較了靜態(tài)萃取時(shí)間為3、6、9、12 min的提取效果。結(jié)果如圖2所示，靜態(tài)萃取時(shí)間小于6 min時(shí)，部分分析物的回收率達(dá)不到檢測(cè)要求；當(dāng)前萃取時(shí)間超過(guò)9 min時(shí)，12種分析物的回收率無(wú)明顯的提升。綜合考慮，靜態(tài)萃取9 min可滿足分析測(cè)試的需求，故選擇靜態(tài)萃取時(shí)間為9 min。

圖2　靜態(tài)萃取時(shí)間的影響Fig.2　Effect of static extraction time

2.3　循環(huán)次數(shù)

增加萃取循環(huán)次數(shù)，目標(biāo)物的回收率增加，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為1次時(shí)，目標(biāo)物的回收率達(dá)到檢測(cè)要求，再增加循環(huán)次數(shù)會(huì)增加萃取時(shí)間，浪費(fèi)溶劑，因此循環(huán)次數(shù)選擇1次。

2.4　凈化條件的選擇

活性干酵母富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)分析物的測(cè)定[17-18]，在QuEChERS凈化方法中，PSA、C18及石墨化炭黑（GCB）是常用的吸附劑。其中PSA吸附在硅膠鍵合了乙二胺-N-丙基官能團(tuán)，主要作用力是極性相互作用及弱陰離子交換作用，可去除提取液中的脂類和糖類物質(zhì)，去除色素、甾醇和維生素效果一般，C18具有良好的除脂能力。

按照1.4處理樣品，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較了未凈化、50 mg氨丙基粉、100 mg氨丙基粉、50 mg PSA、100 mg PSA、200 mg PSA、50 mg C18+100 mg PSA 凈化時(shí)的效果。如圖3所示，加入凈化劑均能改善樣品基質(zhì)干擾，加入 100 mg氨丙基粉、200 mg PSA、50 mg C18+50 mg PSA在12.5～13.5 min譜圖基線起伏，結(jié)合加標(biāo)回收率結(jié)果如圖4所示，加入氨丙基粉凈化α-666回收率偏低；加入50 mg C18+50 mg PSA凈化 p，p′-DDT的回收率僅為43.8%；加入PSA的量增加，p，p′-DDT的回收率降低較明顯；加入50 mg PSA時(shí)12種POPs的回收率在74.5%～111.7%，能達(dá)到較好的凈化效果，故確定添加50 mg PSA凈化。

圖3　高活性干酵母粉樣品不使用及使用不同凈化劑的提取效果圖Fig.3　Chromatogram of purification by without or using differents purification in highly active dry yeast powder

圖4　高效活性干酵母粉中添加12種POPs不同凈化方式的回收率Fig.4　Recoveries of 12 POPs spiked in highly active dry yeast powder using different purification method

2.5　線性關(guān)系與檢出限

配制12種有機(jī)持久性污染物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度在0.025～2.5 μg/mL之間，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，12種POPs線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.992。以信噪比（S/N）≥3時(shí)確定方法的檢出限，12種POPs的檢出限在0.002～0.009 mg/kg，線性系數(shù)、方法檢出限詳見(jiàn)表2。圖5為高活性干酵母粉中添加12種POPs的選擇離子（SIM）色譜圖。

圖5　高效活性干酵母粉中添加持久有機(jī)12種POPs的SIM色譜圖Fig.5　SIM Chromatogram of 12 POPs spiked in Highly active dry yeast powder

2.6　回收率和精密度

按照1.4，用高活性干酵母粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平6次重復(fù)，3個(gè)加標(biāo)水平添加質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.25、1.00 mg/kg，12 種 POPs的回收率在74.5%～111.7%之間，見(jiàn)表3。

2.7　實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)36批高活性干酵母中上述12種有機(jī)持久污染物進(jìn)行分析，結(jié)果均未檢出目標(biāo)分析物，應(yīng)用本方法能有效降低基質(zhì)干擾，加標(biāo)回收率良好，滿足實(shí)際樣品分析的要求。

3　結(jié)　語(yǔ)

本文中建立了QuEChERS-加速溶劑萃取測(cè)定高活性干酵母粉中12種有機(jī)持久污染物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析方法，應(yīng)用該方法進(jìn)行對(duì)高活性干酵母粉進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，標(biāo)回收率為74.5%～111.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～11.3%，結(jié)果表明，此方法操作簡(jiǎn)便、快速、節(jié)省溶劑、加標(biāo)回收率良好、方法穩(wěn)定，能有效降低基質(zhì)干擾，能夠滿足實(shí)際樣品分析的要求。

表2　12種POPs的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 2　Linear equations，correlation coefficients and LODs of 12 POPs（n=6）

表3　高活性干酵母粉中添加12種POPs的平均回收率（n=6）Table 3　Average recoveries and RSDs of 12 POPs spiked in highly active dry yeast powder（n=6）

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