劉曉光，肖衛(wèi)華，陳佩杰，趙淋淋，曾志剛,2，周永戰(zhàn)，鄭莉芳

?

剔除巨噬細胞可通過抑制肌再生因子和Akt/mTOR信號通路損害骨骼肌再生

劉曉光1，肖衛(wèi)華1，陳佩杰1，趙淋淋1，曾志剛1,2，周永戰(zhàn)1，鄭莉芳1

1. 上海體育學院 運動科學學院, 上海 200438; 2. 井岡山大學 體育學院, 江西 吉安 343009。

目的：探討骨骼肌挫傷修復過程中巨噬細胞與肌再生因子及Akt/mTOR信號通路間的關(guān)系，以深入研究巨噬細胞在骨骼肌挫傷修復中的作用及其機制。方法：80只雄性C57BL/6小鼠隨機分為骨骼肌損傷組（S，n=32），損傷+巨噬細胞剔除組（T，n=32），未損傷對照組（SCon，n=8），未損傷+巨噬細胞剔除對照組（TCon，n=8）。骨骼肌挫傷后1d、3d、7d和14d取雙側(cè)腓腸肌外層。蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨骼肌形態(tài)學變化，熒光定量PCR（RT-PCR）及蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測肌再生相關(guān)因子及Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號分子表達變化。結(jié)果：1）HE結(jié)果顯示，S組和T組骨骼肌在挫傷后第1 d和3 d肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、大量肌纖維壞死、腫脹。S組在損傷第7 d出現(xiàn)大量再生肌纖維，而T組在傷后第7 d僅出現(xiàn)少量再生肌纖維，傷后第14 d仍有大量再生肌纖維出現(xiàn)；2）RT-PCR結(jié)果顯示，S組骨骼肌成肌分化抗原（MyoD）和肌細胞生成素（myogenin）mRNA在挫傷后表達均顯著增加（＜0.01）。而與S組相比，T組損傷骨骼肌中MyoD顯著下調(diào)，myogenin顯著上調(diào)表達（＜0.05）；3）S組骨骼肌損傷后，與SCon組相比，除機械生長因子（MGF）外，多種肌再生因子均顯著上調(diào)表達。與S組相比，T組損傷骨骼肌中多種肌再生因子表達均顯著下調(diào)。4）S組骨骼肌損傷后低氧誘導因子1α（HIF-1α）和血管生成素1（Angpt1）mRNA表達均顯著增加，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA表達下降。與S組相比，T組HIF-1α和Angpt1在損傷后期顯著上調(diào)表達；5）WB結(jié)果顯示，骨骼肌損傷后，S組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6k和p-4EBP1/4EBP1表達均顯著增加，而T組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6k和p-4EBP1/4EBP1與TCon及S組相比均無顯著變化（＞0.05）。結(jié)論：巨噬細胞在骨骼肌挫傷修復過程中發(fā)揮了重要作用，剔除巨噬細胞可損害挫傷骨骼肌再生，其機制可能與肌再生因子表達下調(diào)、蛋白質(zhì)合成信號通路未激活有關(guān)。

骨骼??；損傷修復；巨噬細胞；肌再生因子；血管再生因子；蛋白質(zhì)合成信號通路

骨骼肌是具有高度可塑性的組織，損傷后可進行再生，恢復結(jié)構(gòu)和功能[11]。骨骼肌這種強大的自我再生能力主要依賴于肌衛(wèi)星細胞。肌衛(wèi)星細胞是一類肌源性前體細胞，存在于肌膜和基底膜之間。骨骼肌未損傷時肌衛(wèi)星細胞一般處于靜息狀態(tài)，而當骨骼肌損傷后，肌衛(wèi)星細胞即可被激活，增殖、分化形成新的肌管或與受損肌纖維融合，參與骨骼肌損傷修復[31]。

研究表明，骨骼肌損傷修復過程中，巨噬細胞也發(fā)揮了重要作用[4]。M1型巨噬細胞可分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）等炎性介質(zhì)，吞噬壞死肌肉組織。M2型巨噬細胞可分泌胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、肝細胞生長因子（HGF）、抗炎因子白介素-10（IL-10），及促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），調(diào)控骨骼肌再生和纖維化[32]。此外，巨噬細胞還能分泌VEGF，參與血管再生[23]，即巨噬細胞在損傷骨骼肌再生中發(fā)揮了多重作用，但其作用機制仍遠未闡明。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在mdx小鼠[34]、毒素致傷[41,37,33]、氯化鋇注射致傷[18]等肌損傷動物模型中有重要作用，但在運動醫(yī)學領域常見損傷——骨骼肌挫傷中，巨噬細胞是否發(fā)揮作用及如何發(fā)揮作用，卻少有研究。我們推測，和其他損傷模型相似，巨噬細胞在挫傷骨骼肌修復過程中也具有重要作用，巨噬細胞剔除可能會影響肌再生因子和蛋白質(zhì)合成信號分子表達，從而損害挫傷骨骼肌再生。為驗證上述假設，本研究建立了骨骼肌挫傷模型及巨噬細胞剔除模型，檢測了骨骼肌中多種肌再生因子及蛋白質(zhì)合成信號分子表達變化，深入探索了巨噬細胞在骨骼肌挫傷修復中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

80 只8 周齡C57BL/6雄性小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）隨機分為骨骼肌損傷組（S，n=32）、損傷+巨噬細胞剔除組（T，n=32）、未損傷對照組（SCon，n=8）和未損傷+巨噬細胞剔除對照組（TCon，n=8）。小鼠腓腸肌損傷后第1 d、3 d、7 d和14 d取材，每組每時間點8只。

1.2 骨骼肌挫傷模型

小鼠用400 mg/kg體重水合氯醛腹腔注射麻醉后，使小鼠固定于平臺上，且膝關(guān)節(jié)伸直0°，踝關(guān)節(jié)背伸90°位。將重16.8 g，直徑1.6 cm的鋼珠，置于一管狀裝置頂端，自125 cm高處釋放，擊中一打擊裝置，打擊裝置底端撞擊小鼠腓腸肌中部（打擊面積28.26 mm2），制作骨骼肌挫傷模型[40,2]。

1.3 巨噬細胞剔除模型

小鼠腓腸肌挫傷前2 d，腹腔注射2 mg脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽（購自www.clodronateliposomes.com），然后在損傷前 2 h小鼠腹腔注射0.5 mg脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽，之后在損傷后第3、6、9和12 d都注射0.5 mg脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽。此法可特異性剔除體內(nèi)巨噬細胞，而不影響其他細胞，是巨噬細胞剔除的最常用方法[39,30,17]。

1.4 動物取材

在骨骼肌損傷修復相關(guān)研究中，通常不對肌纖維類型進行特殊說明，且腓腸肌為研究者最常用部位[14,6]，因此本研究也選取腓腸肌進行相關(guān)實驗。小鼠腓腸肌挫傷后在不同時間點（1 d、3 d、7 d和14 d）取材。小鼠麻醉后頸椎脫位致死，迅速取雙側(cè)受損腓腸肌外層，對照組取腓腸肌相同部位，通過HE染色、RT-PCR及WB檢測相關(guān)指標。

1.5 HE染色

骨骼肌經(jīng)4%多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）固定24 h后，石蠟包埋，橫切3～4 μm厚的連續(xù)薄片，切片脫蠟復水，蘇木精染色，1%鹽酸-酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡（Olympus DX70）下觀察并拍攝。

1.6 RNA 抽提和cDNA合成

取約60 mg肌肉組織，剪碎后加入1 ml Trizol（美國Invitrogen公司），用機械勻漿器（IKA T10，德國IKA公司）粉碎勻漿。靜置10 min后，加入200 μl氯仿（國藥集團化學試劑有限公司）并上下顛倒充分混勻后，靜置5 min，會出現(xiàn)明顯分層。然后12 000 rpm，4℃離心15 min后小心吸取500 μl上清移入一新離心管中，在此離心管中加入等量異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司），顛倒混勻并靜置 20 min。冷凍離心機（centrifuge5417R，德國Eppendorf公司）中12 000 rpm，4℃離心10 min，白色羽毛狀沉淀即為 RNA。該沉淀用75%酒精（國藥集團化學試劑有限公司）洗滌2 次后，加入30 μl DEPC水（生工生物工程（上海）股份有限公司）溶解。測OD值，OD260/280為1.8～2.0的樣品可用。取2 μg總RNA，按cDNA合成試劑盒說明（K1622, Thermo Scientific 公司）加0.2μg隨機引物，20 mM dNTP mix, 5× Reaction buffer，20U RiboLockTMRNase Inhibitor 和200 U of RevertaidTMM-MuLV Reverse Transcriptase總體積是20 μl。在梯度PCR儀（Mastercycler EP，德國 Eppendorf 公司），進行反轉(zhuǎn)錄。反應過程中的溫度控制是25℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，然后，溫度降低到4 ℃，cDNA合成完成。合成的cDNA儲存在-20 ℃?zhèn)溆肹22, 23]。

1.7 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應體系包括12.5 μl 2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master mix（K0221，Thermo Scientific公司）、1 μl cDNA、無核酸酶水和300 nM的上下游引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，見表1。 使用熒光定量PCR儀（ABI SteponePlus Real Time PCR System7500，USA）進行擴增。反應條件為：預變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 變性15 s，60 ℃1 min退火/延伸，共40個循環(huán)。通過2-△△CT方法計算所測樣本mRNA的相對含量[24,25]。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.8 蛋白質(zhì)印跡實驗

取60～80 mg腓腸肌移入2 ml EP管中，加入含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液（P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）后，剪碎組織并充分勻漿；4 ℃離心機12 000 rpm離心5 min，取上清液；二喹啉甲酸（BCA）法測蛋白樣本濃度（P009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDS-PAGE電泳，5%濃縮膠，70 V恒壓電泳30 min，10%分離膠，110 V恒壓電泳90 min后（Protean tetra電泳槽，美國Biorad公司），用濕轉(zhuǎn)法（Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽，美國 Biorad 公司）轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國默克密理博公司）上；PVDF膜于5%脫脂牛奶（光明乳業(yè)股份有限公司）中室溫封閉1.5 h；分別加入一抗Akt、磷酸化Akt、mTOR、磷酸化mTOR、p70 s6k、磷酸化p70 s6k、4EBP1、磷酸化4 EBP1和GAPDH（所有一抗為兔抗小鼠1:1000，CST公司），4°過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標記二抗（1:5 000，Santa Cruz公司）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光法（Tanon 5200自動發(fā)光儀，中國天能儀器有限公司）檢測蛋白條帶，采用Image J分析軟件測定條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞剔除模型的成功建立

圖1 脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽對損傷骨骼肌巨噬細胞標志物表達的影響

Figure 1 Effects of CL-liposomes on the Specific Markers of Macrophages of Muscle Post-injury.

注：a：CD68；b：CD206； S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細胞剔除組；SCon：未損傷對照組；TCon：未損傷+巨噬細胞剔除對照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時間點比較，c＜0.05；cc＜0.01；CD68：M1巨噬細胞特異標志物；CD206：M2巨噬細胞特異標志物。

RT-PCR結(jié)果顯示，S組骨骼肌中CD68（M1巨噬細胞標志物）[38,34,32,10]mRNA在傷后第1 d、3 d和7 d表達量均顯著增加（＜0.05）。與S組相比，T組CD68 mRNA在傷后1 d、3d和7d表達量均顯著降低（＜0.01），但在損傷后第14 d表達量顯著高于S組（＜0.01）。同時，T組CD206（M2巨噬細胞標志物）[15,24]mRNA在損傷后1 d和3 d表達量均顯著低于S組（＜0.01,圖1）。

同時，本課題組前期通過流式細胞術(shù)檢測損傷骨骼肌中巨噬細胞含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌損傷后第1 d和第3 d脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽處理組中巨噬細胞百分比顯著低于損傷組[39,17]。此結(jié)果和Shen等[27]相似，他們發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽處理，在傷后第1 d骨骼肌中巨噬細胞浸潤減少了73.2%，第2 d減少了80.2%，第3 d減少77.4%，以上結(jié)果證實，巨噬細胞剔除模型得以成功建立。

2.2 骨骼肌挫傷模型的成功建立及巨噬細胞剔除對骨骼肌再生的影響

本研究采用重物擊打腓腸肌，建立骨骼肌挫傷模型。HE結(jié)果顯示，SCon組骨骼肌細胞形態(tài)規(guī)則，肌細胞核位于肌膜下，肌纖維結(jié)構(gòu)完整性較好。損傷后第1 d，肌纖維結(jié)構(gòu)破壞，炎性細胞浸潤。傷后第3 d，大量炎性細胞浸潤到損傷部位，且S組骨骼肌中可見少量再生肌纖維（中央核肌纖維）。骨骼肌損傷后第7 d，壞死肌纖維被大量中央成核肌纖維所代替，損傷后第14 d仍可見部分中央成核肌纖維。提示，骨骼肌挫傷后第14 d損傷骨骼肌未完全恢復。此結(jié)果證實，骨骼肌挫傷模型得以成功建立[40,2]。

雖然S組骨骼肌在傷后第3 d可見少量再生肌纖維，但T組骨骼肌中未見再生肌纖維。S組骨骼肌傷后第7 d可見大量新生肌纖維，T組僅有少量中央成核肌纖維零星分布，且仍有少量炎性細胞浸潤。在傷后第14 d，S組中大部分再生肌纖維已成熟，僅出現(xiàn)少量再生肌纖維，而在T組中出現(xiàn)大量再生肌纖維，表明巨噬細胞剔除使骨骼肌再生得以延遲，有損骨骼肌再生（圖2）。

圖2 巨噬細胞剔除損害骨骼肌再生

Figure 2 Macrophages Depletion Showed Markedly Impaired Muscle Regeneration after Injury.

2.3 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌肌衛(wèi)星細胞增殖分化標志物表達的影響

MyoD通常視為肌衛(wèi)星細胞增殖標志物，myogenin 為肌衛(wèi)星細胞分化標志物[9]。與SCon組相比，S組MyoD mRNA在骨骼肌傷后第1 d和3 d表達顯著增加（＜0.01）。T組MyoD mRNA與S組相比，在傷后第7 d表達顯著降低（＜0.05） （圖3 a）。S組myogenin mRNA在傷后第1 d和3 d表達均顯著增加（＜0.01）。與S組相比，T組myogenin mRNA在傷后第14 d的表達顯著增加（＜0.05,圖3）。

圖3 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌肌衛(wèi)星細胞增殖分化物表達的影響

Figure 3 Effects of Macrophages Depletion on the Marker of Proliferation and Differentiation of Satellite Cell Post Injury.

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細胞剔除組；SCon：未損傷對照組；TCon：未損傷+巨噬細胞剔除對照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時間點比較，c＜0.05；cc＜0.01；

圖4 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌肌再生因子表達的影響

Figure 4 Effects of Macrophages Depletion on Regulatory Factors for Muscle Regeneration

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細胞剔除組；SCon：未損傷對照組；TCon：未損傷+巨噬細胞剔除對照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時間點比較，c＜0.05；cc＜0.01；

2.4 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌肌再生因子表達的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，S組HGF mRNA在傷后第1 d、3 d和7 d表達量均顯著增加（＜0.01）。而T組HGF mRNA在傷后第1 d和3 d表達量均顯著低于S組（＜0.05,圖4 a）。

S組中uPA和IGF-1 mRNA的表達與HGF相似，在損傷后表達量顯著增加，巨噬細胞剔除后T組中uPA和IGF-1的表達顯著低于S組（圖4 b，c）。

骨骼肌損傷后S組MGF的表達與SCon組相比，無顯著變化（＞0.05）。T組MGF mRNA在損傷前顯著高于S組（＜0.01），而在損傷后第1 d和3 d表達量顯著低于S組（＜0.01）。

S組生長分化因子11（GDF11）mRNA在傷后第1 d表達顯著增加（＜0.01），T組GDF11 mRNA在傷后第7 d顯著低于S組（＜0.05）。

S組大麻素受體2（CB2R）mRNA在傷后第1 d和3 d表達均顯著增加（＜0.01），而T組CB2R mRNA在傷后1 d和7 d表達均顯著低于S組（圖4）。

2.5 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌血管再生因子表達的影響

圖 5 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌血管再生因子表達的影響

Figure. 5 Effects of macrophage depletion on the expression of angiogenesis factors

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細胞剔除組；SCon：未損傷對照組；TCon：未損傷+巨噬細胞剔除對照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時間點比較，c＜0.05；cc＜0.01；

熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)，S組HIF-1α mRNA在傷后1 d、3 d和7 d表達顯著增加，而在傷后14d T組HIF-1α mRNA表達顯著高于S組（＜0.05,圖5 a）。

S組Angpt1 mRNA在傷后1-7d表達均顯著增加（＜0.01），傷后14 d雖進行性下降，但仍顯著高于SCon組（＜0.01）。巨噬細胞剔除后T組中Angpt1在損傷前以及損傷后第14 d表達均顯著高于S組（＜0.05,圖5c）。

VEGF mRNA在傷后第7d表達顯著低于SCon組（＜0.05），而TCon組VEGF mRNA顯著高于SCon組（＜0.05,圖5 b）。

2.6 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號分子的影響

圖 6 巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌蛋白質(zhì)合成信號分子表達的影響

Figure. 6 Effects of macrophage depletion on the pathway of protein synthesis

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細胞剔除組；SCon：未損傷對照組；TCon：未損傷+巨噬細胞剔除對照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時間點比較，c＜0.05；ccP＜0.01；

WB結(jié)果顯示，S組骨骼肌p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均在傷后第1d表達顯著增加（＜0.05），p-p70S6K/p70S6k在傷后1d和3d表達均顯著增加，p-4EBP1/4EBP1在傷后1d、3d、7d和14d表達均顯著增加。而T組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1與SCon組及S組相比雖有增加，但并無顯著變化（＞0.05，圖6a，b，c，d）

3 討論

3.1 巨噬細胞剔除下調(diào)肌再生因子表達，損害骨骼肌再生

MyoD一般作為生肌調(diào)節(jié)因子參與衛(wèi)星細胞激活，而myogenin則參與肌衛(wèi)星細胞分化[40]。本研究中，T組myogenin表達量在傷后1 d、3 d和7 d相比，于S組均不同程度降低，但第14 d卻處于高表達狀態(tài)。結(jié)合形態(tài)學結(jié)果來看，T組在第14天時，仍有較多再生肌纖維（圖2），提示，巨噬細胞剔除可能延遲了肌衛(wèi)星細胞分化，損害了骨骼肌再生。此結(jié)果和Segawa等[26]相似，他們發(fā)現(xiàn)，抑制巨噬細胞活性可影響損傷骨骼肌中肌衛(wèi)星細胞增殖和分化，損害骨骼肌再生。但Summan等[30]的研究認為，剔除巨噬細胞并不影響肌衛(wèi)星細胞增殖和分化。從其實驗設計來看，Summan等僅用傷后第3 d研究巨噬細胞剔除對肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響，存在一定的局限性，本研究采用多點檢測（傷后1-14 d），結(jié)果可能更為客觀。

骨骼肌再生過程中，多種肌再生因子發(fā)揮了重要作用，如IGF-1與骨骼肌蛋白質(zhì)合成有關(guān)，其異構(gòu)體MGF則可能參與了肌衛(wèi)星細胞的激活[29,1]；HGF可激活骨骼肌中靜息態(tài)肌衛(wèi)星細胞[12]，uPA則促進巨噬細胞向損傷骨骼肌趨化[7]；CB2R可調(diào)節(jié)損傷骨骼肌中炎癥反應和纖維化[42]，而GDF11可影響成肌細胞分化[3]。這些因子中，有多種因子如IGF-1[18]、HGF[25]和uPA[21]等可由巨噬細胞分泌。本研究中，巨噬細胞剔除使挫傷骨骼肌修復受損，是否與這些因子有關(guān)？我們對此展開了相關(guān)研究。結(jié)果表明，骨骼肌挫傷后，多種肌再生因子（MGF除外）均顯著上調(diào)表達，參與損傷骨骼肌修復，而巨噬細胞剔除后，這些肌再生因子出現(xiàn)顯著下調(diào)。提示，這些肌再生因子可能參與了巨噬細胞剔除損害骨骼肌再生這一過程。

3.2 巨噬細胞剔除調(diào)節(jié)骨骼肌血管再生因子表達損害骨骼肌再生

血管再生是骨骼肌損傷后修復過程中的一個重要環(huán)節(jié)，骨骼肌損傷后新生的血管不僅能為再生組織提供充足的O2和營養(yǎng)物質(zhì)，還能進一步促進骨骼肌細胞的再生，維持局部組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[35,28]。有研究證實，HIF-1α、Angpt1和 VEGF不僅與血管再生有關(guān)，且可直接參與骨骼肌損傷修復過程[36,20,5]。巨噬細胞也是血管再生所必須的，它可通過分泌一些血管再生因子促進血管內(nèi)皮細胞分化，促進血管形成[44]。剔除巨噬細胞小鼠其血管再生水平顯著降低，骨骼肌損傷修復能力受損[13]。但對于巨噬細胞剔除如何影響挫傷骨骼肌再生過程中血管再生卻鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞剔除可顯著提高傷后第14 d HIF-1α和Angpt1表達。HIF-1α是低氧環(huán)境誘導產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，其高水平表達提示，損傷處氧氣供應不足，血管損傷未完成修復[36,22]。巨噬細胞剔除后，這兩種血管再生因子在損傷修復后期仍處于高表達狀態(tài)，提示，巨噬細胞剔除可能加劇損傷骨骼肌修復后期缺氧狀態(tài)、延長了血管再生過程，進而損害骨骼肌再生。同時，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞剔除后，在骨骼肌損傷修復后期仍有較高水平的炎癥反應和氧化應激反應，提示，巨噬細胞剔除延遲了骨骼肌損傷修復進程[39]。

3.3 巨噬細胞剔除抑制Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號通路損害骨骼肌再生

在骨骼肌損傷后的修復過程中，蛋白質(zhì)合成需大于分解，才能有效完成修復過程。Akt/mTOR信號通路是蛋白質(zhì)合成的主要信號通路，骨骼肌損傷后可能通過激活Akt/mTOR及其下游信號分子促進蛋白質(zhì)合成，加速骨骼肌損傷后修復過程[43,16]。與其他骨骼肌損傷模型相似，本研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌挫傷后第1 d即可激活Akt/mTOR及其下游信號分子p70S6K和4EBP1，提示骨骼肌損傷后，Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號通路被激活，促進蛋白質(zhì)合成[19,8]。但巨噬細胞剔除是否影響挫傷骨骼肌修復過程中蛋白質(zhì)合成信號通路的激活，卻未見相關(guān)報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞剔除后，挫傷骨骼肌中Akt/mTOR及其下游信號分子p70S6K和4EBP1與剔除對照組及損傷組相比均無顯著變化。提示，巨噬細胞剔除后損傷骨骼肌中Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號通路可能未被激活。因此，巨噬細胞剔除損害骨骼肌再生可能與巨噬細胞剔除后未能激活損傷骨骼肌中Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號通路有關(guān)。

4 結(jié)論

巨噬細胞在骨骼肌挫傷修復過程中發(fā)揮了重要作用，剔除巨噬細胞可損害挫傷骨骼肌再生，其機制可能與肌再生因子表達下調(diào)、蛋白質(zhì)合成信號通路未激活有關(guān)。

[1] 劉曉光, 徐苗苗, 陳佩杰, 等. IGF-1在治療骨骼肌損傷中的應用潛能及其相關(guān)機制[J]. 生命的化學, 2016, (04): 496-502.

[2] 劉曉光, 趙淋淋, 曾志剛, 等. 骨骼肌損傷修復過程中肌再生調(diào)節(jié)因子和血管再生因子表達規(guī)律研究[J]. 中國康復醫(yī)學雜志, 2016, (12): 1294-1300.

[3] 劉曉光, 趙淋淋, 田向陽, 等. 生長分化因子11在延緩衰老中的作用[J]. 中國老年學雜志, 2015, (17): 5016-5019.

[4] 肖衛(wèi)華, 陳佩杰, 劉宇. 巨噬細胞在骨骼肌急性損傷修復中的作用研究進展[J]. 中國運動醫(yī)學雜志, 2014, (3): 269-274.

[5] ARSIC N, ZACCHIGNA S, ZENTILIN L,. Vascular endothelial growth factor stimulates skeletal muscle regeneration in vivo[J]. Mol Ther, 2004, 10(5): 844-854.

[6] BEDAIR H S, KARTHIKEYAN T, QUINTERO A,. Angiote-nsin II receptor blockade administered after injury improves musc-le regeneration and decreases fibrosis in normal skeletal muscle [J]. Am J Sports Med, 2008, 36(8): 1548-1554.

[7] BRYER S C, FANTUZZI G, VAN ROOIJEN N,. Urokinase-type plasminogen activator plays essential roles in macrophage chemotaxis and skeletal muscle regeneration[J]. J Immunol, 2008, 180(2): 1179-1188.

[8] CONTE T C, SILVA L H, SILVA M T,. The beta2-adrenocep-tor agonist formoterol improves structural and functional regener-ative capacity of skeletal muscles from aged rat at the early stages of postinjury[J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2012, 67(5): 443-455.

[9] CORNELISON D D, WOLD B J. Single-cell analysis of regulato-ry gene expression in quiescent and activated mouse skeletal mus-cle satellite cells[J]. Dev Biol, 1997, 191(2): 270-283.

[10] DENG B, WEHLING-HENRICKS M, VILLALTA S A,. IL-10 triggers changes in macrophage phenotype that promote muscle growth and regeneration[J]. J Immunol, 2012, 189(7): 3669-3680.

[11] ENDO T. Molecular mechanisms of skeletal muscle development, regeneration, and osteogenic conversion[J]. Bone, 2015, 80: 2-13.

[12] GRASMAN J M, DO D M, PAGE R L,. Rapid release of growth factors regenerates force output in volumetric muscle loss injuries[J]. Biomaterials, 2015, 72: 49-60.

[13] KOH Y J, KOH B I, KIM H,. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dyna-mic reassembly of blood endothelial cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(5): 1141-1150.

[14] KOWALSKI K, ARCHACKI R, ARCHACKA K,. Stromal derived factor-1 and granulocyte-colony stimulating factor treatm-ent improves regeneration of Pax7-/- mice skeletal muscles [J]. J Cachexia Sarcopenia Muscle, 2016, 7(4): 483-496.

[15] LEE K C, LIN H C, HUANG Y H,. Allo-transplantation of mesenchymal stem cells attenuates hepatic injury through IL1Ra dependent macrophage switch in a mouse model of liver disease [J]. J Hepatol, 2015, 63(6): 1405-1412.

[16] LI H Y, ZHANG Q G, CHEN J W,. The fibrotic role of phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway in injured skeletal muscle after acute contusion[J]. Int J Sports Med, 2013, 34(9): 789-794.

[17] LIU X, LIU Y, ZHAO L,. Macrophage depletion impairs skeletal muscle regeneration: The roles of regulatory factors for muscle regeneration[J]. Cell Biol Int, 2017, 41(3): 228-238.

[18] LU H, HUANG D, SAEDERUP N,. Macrophages recruited via CCR2 produce insulin-like growth factor-1 to repair acute skeletal muscle injury[J]. FASEB J, 2011, 25(1): 358-369.

[19] MIYABARA E H, CONTE T C, SILVA M T,. Mammalian target of rapamycin complex 1 is involved in differentiation of regenerating myofibers in vivo[J]. Muscle Nerve, 2010, 42(5): 778-787.

[20] MOFARRAHI M, MCCLUNG J M, KONTOS C D,. Angiopoietin-1 enhances skeletal muscle regeneration in mice[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2015, 308(7): R576-589.

[21] NOVAK M L, BRYER S C, CHENG M,. Macrophage-specific expression of urokinase-type plasminogen activator prom-otes skeletal muscle regeneration[J]. J Immunol, 2011, 187(3): 1448-1457.

[22] ONO Y, SENSUI H, SAKAMOTO Y,. Knockdown of hypoxia-inducible factor-1alpha by siRNA inhibits C2C12 myoblast differentiation[J]. J Cell Biochem, 2006, 98(3): 642-649.

[23] PERDIGUERO E, SOUSA-VICTOR P, RUIZ-BONILLA V,. p38/MKP-1-regulated AKT coordinates macrophage transitions and resolution of inflammation during tissue repair[J]. J Cell Biol, 2011, 195(2): 307-322.

[24] SACLIER M, YACOUB-YOUSSEF H, MACKEY A L,. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precur-sor cell fate during human skeletal muscle regeneration[J]. Stem Cells, 2013, 31(2): 384-396.

[25] SAWANO S, SUZUKI T, DO M K,. Supplementary immun-ocytochemistry of hepatocyte growth factor production in activat-ed macrophages early in muscle regeneration[J]. Anim Sci J, 2014, 85(12): 994-1000.

[26] SEGAWA M, FUKADA S, YAMAMOTO Y,. Suppression of macrophage functions impairs skeletal muscle regeneration with severe fibrosis[J]. Exp Cell Res, 2008, 314(17): 3232-3244.

[27] SHEN W, LI Y, ZHU J,. Interaction between macrophages, TGF-beta1, and the COX-2 pathway during the inflammatory phase of skeletal muscle healing after injury[J]. J Cell Physiol, 2008, 214(2): 405-412.

[28] SHIMIZU-MOTOHASHI Y, ASAKURA A. Angiogenesis as a novel therapeutic strategy for Duchenne muscular dystrophy through decreased ischemia and increased satellite cells[J]. Front Physiol, 2014, 5: 50.

[29] SONG Y H, SONG J L, DELAFONTAINE P,. The therapeut-ic potential of IGF-I in skeletal muscle repair[J]. Trends Endocrin-ol Metab, 2013, 24(6): 310-319.

[30] SUMMAN M, WARREN G L, MERCER R R,. Macrophages and skeletal muscle regeneration: a clodronate-containing liposo-me depletion study[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2006, 290(6): R1488-1495.

[31] TIDBALL J G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regener-ation [J]. Compr Physiol, 2011, 1(4): 2029-2062.

[32] TIDBALL J G, VILLALTA S A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2010, 298(5): R1173-1187.

[33] TYNER J W, UCHIDA O, KAJIWARA N,. CCL5-CCR5 interaction provides antiapoptotic signals for macrophage survival during viral infection[J]. Nat Med, 2005, 11(11): 1180-1187.

[34] VILLALTA S A, RINALDI C, DENG B,. Interleukin-10 reduces the pathology of mdx muscular dystrophy by deactivating M1 macrophages and modulating macrophage phenotype[J]. Hum Mol Genet, 2011, 20(4): 790-805.

[35] WAGATSUMA A. Endogenous expression of angiogenesis-related factors in response to muscle injury[J]. Mol Cell Biochem, 2007, 298(1-2): 151-159.

[36] WAGATSUMA A, KOTAKE N, YAMADA S. Spatial and tempo-ral expression of hypoxia-inducible factor-1alpha during myogen-esis in vivo and in vitro[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 347(1-2): 145-155.

[37] WANG H, MELTON D W, PORTER L,. Altered macrophage phenotype transition impairs skeletal muscle regeneration[J]. Am J Pathol, 2014, 184(4): 1167-1184.

[38] XIAO W, CHEN P, DONG J. Effects of overtraining on skeletal muscle growth and gene expression[J]. Int J Sports Med, 2012, 33(10): 846-853.

[39] XIAO W, LIU Y, CHEN P. Macrophage depletion impairs skele-tal muscle regeneration: the roles of pro-fibrotic factors, inflam-mation, and oxidative Stress[J]. Inflammation, 2016, 39(6): 2016-2028.

[40] XIAO W, LIU Y, LUO B,. Time-dependent gene expression analysis after mouse skeletal muscle contusion[J]. J Sport Heal Sci, 2016, 5(1): 101-108.

[41] ZHANG C, LI Y, WU Y,. Interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) pathway is essential for macrophage infiltration and myoblast proliferation during muscle regeneration[J]. J Biol Chem, 2013, 288(3): 1489-1499.

[42] ZHANG M, JIANG S K, TIAN Z L,. CB2R orchestrates fibrogenesis through regulation of inflammatory response during the repair of skeletal muscle contusion[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(4): 3491-3502.

[43] ZHANG P, LIANG X, SHAN T,. mTOR is necessary for proper satellite cell activity and skeletal muscle regeneration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 463(1-2): 102-108.

[44] ZORDAN P, RIGAMONTI E, FREUDENBERG K,. Macro-phages commit postnatal endothelium-derived progenitors to angi-ogenesis and restrict endothelial to mesenchymal transition during muscle regeneration[J]. Cell Death Dis, 2014, 5: e1031.

Depletion of Macrophage Impairs Skeletal Muscle Regeneration by Inhibited the Expression of Muscle Regeneration Regulatory Factors and Akt / mTOR Protein Synthesis Signaling Pathway

LIU Xiao-guang1, XIAO Wei-hua1, CHEN Pei-jie1, ZHAO Lin-lin1, ZENG Zhi-gang1,2, ZHOU Yong-zhan1, ZHENG Li-fang1

1.Shanghai University of Sport, Shanghai 200438, China; 2.Jinggangshan University, Ji’an 343009, China

Objective: The purpose of this study is to explore the relationship between macrophage and muscle regeneration regulatory factors and Akt/mTOR signaling pathway, in order to investigate the role and mechanism of macrophages in the regeneration of injured skeletal muscle. Methods: Eighty C57BL/6 mice were randomly divided into muscle contusion (S, n=32), muscle contusion+ macrophages depleted (T, n=32), control (SCon, n=8), and macrophages depleted control groups (TCon, n=8). Their outer layer of the gastrocnemius muscles were harvested at the time points of 1, 3, 7 and 14d post-injury. The changes of skeletal muscle morphology were assessed by hematoxylin and eosin (HE) stains. The gene and protein expression was analyzed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blotting (WB). Results: 1) The HE results showed that skeletal muscle fibers were significantly impaired and the injured fibers had almost degenerated at 1d and 3d post-injury in both S and T groups. At 7d after injury, the damaged muscle area in the group S had been replaced mostly by newly formed muscle fibers, whereas numerous necrotic myofibers and inflammatory cells dominated the injured muscle regions of group T. In addition, a large number of regenerated muscle fibers were observed at 14d after injury in the group T. 2) The Myogenic Differentiation Antigen (MyoD) and myogenin mRNA increased significantly post-injury (p<0.01). As compared to the S group, macrophage depletion significantly inhibited MyoD mRNA level and increased myogenin mRNA level in the group T post-injury (p<0.05). 3) The regulatory factors of muscle regeneration (except mechano growth factor, MGF) mRNA increased significantly in the group S post-injury. However, compared with group S, the expression of regulatory factors of muscle regeneration of T group was significantly down regulated. 4) Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) and angiopoietin1 (Angpt1) mRNA increased significantly post-injury in group S. Compared with group S, HIF-1 and Angpt1 in T group were significantly up-regulated in the later stage of muscle regeneration. 5) WB analysis showed that p-Akt/Akt, p-mTOR/mTOR, p-p70S6K/p70S6k and p-4EBP1/4EBP1 increased significantly post-injury in group S. However, there were no significantly change in the expression of p-Akt/Akt, p-mTOR/mTOR, p-p70S6K/p70S6k and p-4EBP1/4EBP1 in the group T after injury. Conclusion: Macrophages play important roles in muscle regeneration after injury. Macrophage depletion impairs muscle regeneration and that the inhibition of muscle regeneration regulatory factors and Akt/mTOR pathway may involve in the process.

1000-677X(2018)03-0056-09

10.16469/j.css.201803006

G804.7

Ａ

2017-10-10；

2018-02-03

國家自然科學基金資助項目(31300975, 31271273); 上海市人類運動能力開發(fā)與保障重點實驗室資助項目(11DZ2261100)。

劉曉光,男,在讀博士研究生,主要研究方向為運動健康促進的生物學機制,E-mail:xiaoguangliu2008@126.com;肖衛(wèi)華,男,博士,副教授,研究方向為運動健康促進的生物學機制,E-mail: xiaoweihua@sus.edu.cn; 陳佩杰,男,博士,教授,研究方向為運動免疫與運動健康促進,E-mail:chenpeijie@sus.edu.cn。