曾云龍， 程圓昕， 易守軍， 張 敏， 何 盼， 趙 敏， 唐春然

(1. 湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 理論有機(jī)和功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 湘潭 411201；2. 湖南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 湘潭 411201)

1 引 言

中藥是中國醫(yī)藥學(xué)的瑰寶，是中醫(yī)治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)人類的文明和進(jìn)步做出了偉大貢獻(xiàn)。世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示：世界范圍內(nèi)約70%～80%的人口在一級(jí)疾病治療中使用過傳統(tǒng)藥物，其中主要是中草藥[1]。由于西藥顯示出各種副作用，以及中藥對(duì)疾病尤其是重大疾病如癌癥以及重度燒燙傷等均能顯示出高的療效，歐美等發(fā)達(dá)國家開始使用植物藥，從而引發(fā)植物藥中藥材在國際市場(chǎng)的持續(xù)升溫。真菌毒素是某些真菌的代謝物，具有強(qiáng)毒性，尤其是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素對(duì)中藥材污染很普遍[2-5]，但中藥材中微量黃曲霉毒素一般不表現(xiàn)出急性毒性，然而它們?cè)谌梭w內(nèi)有較強(qiáng)的蓄積性，具有致癌、致畸、致突變、肝毒性等。黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前已知最強(qiáng)的化學(xué)致癌物，其潛在危害巨大，嚴(yán)重影響中藥的安全性。為了保證藥用安全，中藥材中AFB1為必檢項(xiàng)目。歐州藥典規(guī)定草藥中AFB1限量為2 μg/kg，韓國藥典規(guī)定為10 μg/kg，中國藥典為5 μg/kg。

目前，黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有色譜法和酶聯(lián)免疫法等[6-9]。酶聯(lián)免疫法靈敏、選擇性高，但所用抗原/抗體和酶的價(jià)格高，且易失活而失效；薄層色譜掃描法存在不夠靈敏、重現(xiàn)性低、操作繁瑣以及有機(jī)溶劑耗量大的缺點(diǎn)；色譜法及色-質(zhì)聯(lián)用法技術(shù)要求高、所需試劑純度高、儀器設(shè)備昂貴、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的中藥材黃曲霉毒素檢測(cè)方法。核酸適體具有特異性高、穩(wěn)定、價(jià)格低的顯著優(yōu)勢(shì)。近年來，基于核酸適體的生物傳感法[10-11]廣泛用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷和食品中毒物殘留分析，然而，用于檢測(cè)中藥(材)中痕量真菌毒素殘留的報(bào)道較少。CdTe量子點(diǎn)優(yōu)異的光學(xué)特性使其廣泛應(yīng)用于化學(xué)生物傳感[12-14]。本文擬利用核酸適體對(duì)黃曲霉毒素B1呈現(xiàn)的高特異性，以CdTe量子點(diǎn)為熒光探針，建立幾種中藥材中黃曲霉毒素B1的簡(jiǎn)單、快速、靈敏的核酸適體傳感檢測(cè)新方法。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要試劑與儀器

巰基修飾的AFB1核酸適體(Apt)：HS-5′-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCT-CGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′[11]由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素B1(FB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)，氯化鎘、硼氫化鈉、半胱胺鹽酸鹽、氯金酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、TeO2等均為分析純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；TG16B臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；78-1磁力加熱攪拌器(金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 CdTe量子點(diǎn)的制備

CdTe量子點(diǎn)的制備參照文獻(xiàn)[15]方法并稍做改進(jìn)。取1.92 mmol CdCl2和5.76 mmol半胱胺鹽酸鹽置于250 mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌下用160 mL二次蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH=6.0，得到Cd前體溶液；再取0.96 mmol二氧化碲于20 mL二次水中，并向其中加入7.68 mmol的硼氫化鈉，磁力攪拌下置于60 ℃的水浴中避光反應(yīng)1 h，得紫色透明的Te前體溶液；將剛制備的Te前體溶液加入到Cd前體溶液中并在室溫下攪拌反應(yīng)2 h，然后迅速轉(zhuǎn)移至100 ℃水浴中回流反應(yīng)3 h，得到192 mL紅色透明的半胱胺(巰基乙胺)修飾的CdTe量子點(diǎn)(CdTe QDs)。CdTe QDs的濃度為5 mmol/L(按Te量計(jì))，避光保存。臨用時(shí)，先對(duì)CdTe QDs純化。以乙醇將CdTe QDs沉降，離心分離，棄去離心液；沉淀用50%乙醇溶液洗滌，離心分離，棄去離心液，如此處理3次后，超聲分散到二次水中即得到純化的巰基乙胺修飾的CdTe QDs，避光保存，備用。

2.2.2 金納米粒子的制備

金納米粒子按文獻(xiàn)[16]方法以檸檬酸鈉還原氯金酸制備。取250 mL 0.1 mmol HAuCl4溶液置于潔凈的燒杯中，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol 檸檬酸鈉，溶液顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)反應(yīng)30 min后冷卻至室溫。AuNPs 的濃度按文獻(xiàn)[17]方法測(cè)定為2.7 nmol/L。

2.2.3 金納米粒子表面修飾核酸適體

依據(jù)文獻(xiàn)[18]方法，以巰基修飾的核酸適體對(duì)金納米粒子進(jìn)行表面修飾。先將巰基AFB1核酸適體用 10 mmol/L TCEP(Apt∶TCEP=1∶5) 活化1 h，然后將活化的Apt與2.6 nmol/L AuNPs 混合，再加入500 mmol/L pH 3.0 酒石酸-HCl 緩沖溶液，在室溫下輕搖孵化30 min，轉(zhuǎn)至10 000 r/min離心25 min除去未修飾到金納米粒子表面的Apt，再用pH 為7.0的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，如此3次，得到Apt修飾的金納米粒子(AuNPs/ Apt)，將其分散至水中，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 AFB1分析程序

巰基乙胺修飾的CdTe QDs 2 mmol/mL 與AuNPs/Apt在10 mmol/L PBS(pH 7.2)溶液中混合反應(yīng)10 min,離心除去過量的CdTe量子點(diǎn)，得到AuNPs/Apt/CdTe QDs復(fù)合物。測(cè)定體系熒光強(qiáng)度；然后，向AuNPs/Apt/CdTe QDs復(fù)合物體系中加入不同濃度的AFB1(0～2.0 ng/mL)，混勻，測(cè)定體系的熒光光譜。并按同樣的方法，向AuNPs/Apt/CdTe QDs復(fù)合物中加入其他真菌毒素(AFB2、FB1、OTA、ZEN和DON)，進(jìn)行傳感器的選擇性實(shí)驗(yàn)，AFB1的濃度為1.0 ng/mL，其他真菌毒素的濃度均為10 ng/mL，以460 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長(zhǎng)為575 nm)。所有的光譜測(cè)定都在室溫下10 mmol/L 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鉀(PBS，pH7.2)緩沖溶液中進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)均為三次測(cè)定平均值。

2.2.5 中藥材中AFB1分析

取中藥材樣品研碎粉末5 g(過3號(hào)篩),準(zhǔn)確稱定,準(zhǔn)確加70%甲醇溶液50 mL,超聲處理 30 min,離心5 min(離心速度4 000 r/min),準(zhǔn)確吸取上清液10 mL,用水稀釋至20 mL,搖勻,即得供試品溶液。

取供試品溶液適量置于AuNPs/Apt/CdTe QDs復(fù)合物分散體系中，混勻，再加入PBS緩沖溶液，搖勻，孵化10 min，測(cè)定體系的熒光光譜，確定中藥材中AFB1含量。

用RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光強(qiáng)度(F)。同時(shí)做AFB1試劑空白(F0)。測(cè)定時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)選用460 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫都設(shè)置為5.0 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法原理

金納米粒子具有強(qiáng)烈的熒光猝滅功能[19]。在本工作中，我們選用CdTe量子點(diǎn)作為熒光探針，金納米粒子為熒光猝滅劑。先將帶負(fù)電荷的巰基-AFB1核酸適體修飾金納米粒子表面形成AuNPs/Apt；帶正電荷的CdTe QDs通過靜電作用在AuNPs/Apt表面自組裝形成AuNPs/APt/CdTe QDs復(fù)合物，并使CdTe QDs熒光猝滅。向體系中加入AFB1時(shí)，Apt選擇性地與AFB1作用，并釋放出CdTe QDs，體系熒光恢復(fù)。圖1表明，加入的AFB1量越大，釋放出的CdTe QDs就越多，體系熒光強(qiáng)度就越大，依據(jù)熒光強(qiáng)度與AFB1的量的關(guān)系，可以建立一種基于CdTe量子點(diǎn)熒光恢復(fù)的核酸適體熒光傳感檢測(cè)AFB1的新方法。

圖1 金納米粒子/核酸適體/CdTe量子點(diǎn)+黃曲霉素B1體系的熒光光譜

Fig.1 Fluorescence spectra of AuNPs/aptamer/CdTeQDs+AFB1

3.2 核酸適體用量的影響

在Apt∶AuNPs的摩爾濃度比為50∶1～300∶1范圍，制備AuNP/Apt復(fù)合物，然后向AuNPs/Apt復(fù)合物體系中加入過量的CdTe QDs，離心分離除去未自組裝的CdTe DQs，再將AuNPs/Apt/CdTe QDs分散至二次水中，測(cè)其熒光發(fā)射光譜曲線。結(jié)果見圖2。從圖2可知，Apt∶AuNPs在175∶1～225∶1范圍，體系熒光均能有效猝滅，而225∶1時(shí)猝滅程度最大。

圖2 核酸適體與金納米粒子的量比對(duì)體系熒光猝滅的影響

Fig.2 Influence of aptamer and AuNPs molar ratio on fluorescent quenched

考察Apt修飾量對(duì)CdTe QDs的猝滅后，體系中加入AFB1的熒光恢復(fù)情況。在Apt∶AuNPs為175∶1、200∶1和225∶1復(fù)合物體系中，CdTe QDs熒光恢復(fù)分別為75.9%、79.3%和81.6%。因此，Apt∶AuNPs為225∶1有更為有效的熒光猝滅和熒光恢復(fù)。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇Apt的用量為AuNPs的225倍，依此確定AuNPs/Apt/CdTe QDs之比為1∶225∶900(量比，CdTe QDs濃度以Te量計(jì)算)。

3.3 pH及鹽的濃度的影響

在pH 4.0～9.0范圍，研究了pH對(duì)體系熒光恢復(fù)的影響。在pH 4.0～7.0時(shí)，體系熒光隨pH升高而顯著增強(qiáng)；pH 7.0～7.5范圍，體系熒光緩慢增強(qiáng)，且在pH 7.5時(shí)達(dá)到最大值；之后隨pH值的增大而逐漸降低，當(dāng)達(dá)到pH 9.0時(shí)體系熒光強(qiáng)度顯著下降。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，控制體系pH 值為7.2。

體系熒光強(qiáng)度隨pH值的改變而變化的現(xiàn)象主要是CdTe QDs對(duì)H+離子敏感。在酸性條件下，量子點(diǎn)表面氨基接受質(zhì)子，引起熒光猝滅，隨pH值的升高，氨基接受的質(zhì)子明顯減少，熒光強(qiáng)度顯著提高；在堿性條件下，由于量子點(diǎn)表面的氨基存在，彼此間可以形成氫鍵，從而引發(fā)團(tuán)聚現(xiàn)象，使熒光猝滅，體系的熒光強(qiáng)度顯著降低。

考察了NaCl對(duì)體系熒光的影響。實(shí)驗(yàn)表明，NaCl 濃度在50 mmol/L時(shí)，對(duì)體系熒光無明顯影響。

3.4 孵化時(shí)間的影響

在室溫下，考察了孵化時(shí)間對(duì)熒光恢復(fù)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孵化時(shí)間達(dá)到5 min時(shí)，體系熒光迅速恢復(fù)并在1 h內(nèi)熒光強(qiáng)度無明顯變化，繼續(xù)延長(zhǎng)孵化時(shí)間，體系熒光強(qiáng)度不再變化。故確定孵化時(shí)間為5 min。

孵化實(shí)驗(yàn)表明，溶液中AFB1迅速與納米復(fù)合物中的Apt結(jié)合并釋放出CdTe QDs，使體系熒光強(qiáng)度迅速恢復(fù)并達(dá)到平衡，為樣品中AFB1的快速檢測(cè)提供了保證。

3.5 其他真菌毒素物的影響

控制AFB1濃度為1.0 ng/mL，其他真菌毒素的濃度為10 ng/mL，進(jìn)行了方法的選擇性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。從圖3可知，AFB1核酸適體對(duì)AFB1呈現(xiàn)高選擇性，其他真菌毒素?zé)o明顯干擾。

圖3 核酸適體傳感分析的選擇性，AFB1為1.0 ng/mL，其余真菌毒素濃度為10 ng/mL。

Fig.3 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of AFB1: 1.0 ng/mL, others: 10.0 ng/mL.

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在10 mmol/L PBS(pH=7.2)納米復(fù)合物(AuNPs/Apt/CdTe QDs比為1∶225∶900)分散液中，分別依次加入不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵化5 min，測(cè)定體系熒光光譜，結(jié)果見圖4。從圖4可知，隨著AFB1的濃度增大，體系熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，但最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)不變；進(jìn)一步研究表明，體系的熒光恢復(fù)程度y(y=F-F0)與AFB1濃度在0.005 ～ 2.0 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖4)，其線性回歸方程為y=27.71+274.2C(C為AFB1的濃度，單位：ng/mL)，相關(guān)系數(shù)為0.997 1，方法檢出限(3σ/k)為1.2 pg/mL。

圖4 體系的熒光強(qiáng)度隨AFB1濃度(0,0.005,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.10,0.20,0.40,0.75,1.00,1.50，2.00 ng/mL)的變化情況。插圖：F-F0與AFB1的濃度在0.005～2.0 ng/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

Fig.4 Dependence of FL intensity on the concentration of AFB1(0, 0.005, 0.010, 0.020, 0.040, 0.060, 0.080, 0.10, 0.20, 0.40, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 ng/mL). Inset shows the linear relationship betweenF-F0and AFB1 concentration within the range of 0.005-2.0 ng/mL.

3.7 分析應(yīng)用

將所構(gòu)建的核酸適體傳感體系應(yīng)用于連翹、甘草和山楂等中藥材中的 AFB1 檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表13種中藥材樣品中AFB1的檢測(cè)

Tab.1 Detection of AFB1 in three kind of Chinese traditional medicines (n=3)

中藥材樣品測(cè)定量/(μg·kg-1)加入量/(μg·kg-1)回收率/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差/%連翹10．00550．005105．53．5連翹20．00120．001104．23．2山楂10．861．0102．82．8山楂20．630．597．64．9山楂32．55．0103．22．5甘草113．515．0101．51．6甘草25．85．0102．82．4甘草311．410．0102．52．2甘草42．65．097．33．3

從表1 可知，甘草污染嚴(yán)重，山楂也有一定的污染，連翹僅是輕微污染。另外，回收率和 RSD 的結(jié)果表明，該傳感體系適用于中藥材中殘留黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。

4 結(jié) 論

以黃曲霉毒素B1核酸適體、金納米粒子和CdTe量子點(diǎn)制備了AuNPs/Apt/CdTeQDs核酸適體復(fù)合物；金納米粒子使復(fù)合物中量子點(diǎn)熒光猝滅，而黃曲霉毒素B1與復(fù)合物中核酸適體高選擇性地結(jié)合并釋放出量子點(diǎn)，使其熒光恢復(fù)，據(jù)此，建立了一種高選擇性、高靈敏測(cè)定黃曲霉毒素B1的傳感分析方法。該方法在實(shí)際樣品分析中的回收率在97.3%～105.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差小于5%，能滿足中藥材中痕量黃曲霉毒素B1的檢測(cè)要求。

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曾云龍(1955-)，男，湖南邵東人，博士，教授，2007年于湖南大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事量子點(diǎn)熒光材料的合成及在化學(xué)生物傳感中的應(yīng)用的研究。

E-mail: yunlongzeng1955@126.com