厲桂香,馬克明

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京　100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京　100049

樹(shù)線是指從郁閉度較高的森林冠層向郁閉度較低的森林冠層過(guò)渡,并且高度≥3m的樹(shù)木所處的位置[1]。樹(shù)線作為生態(tài)交錯(cuò)帶的主要類型,因其特有的敏感性和動(dòng)態(tài)性,可以作為氣候變化監(jiān)測(cè)的早期信號(hào)[2]。樹(shù)線的響應(yīng)特征是表征全球變化的指示器,隨著全球氣候變暖,樹(shù)線上移是備受關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。樹(shù)線上移將對(duì)生物多樣性、地下微生物、乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)都造成嚴(yán)重影響[3- 4]。對(duì)樹(shù)線上下土壤生物群落進(jìn)行研究,將會(huì)為預(yù)測(cè)高海拔生態(tài)系統(tǒng)及其功能對(duì)氣候變化的響應(yīng)提供重要參考價(jià)值。

土壤細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最大、種類最多、功能多樣的類群。作為土壤中重要的分解者,土壤細(xì)菌在整個(gè)土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。土壤細(xì)菌與地上植物有著緊密的聯(lián)系,地上植物可以通過(guò)凋落物的輸入以及根系分泌物來(lái)改變土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)[5- 7],從而間接影響土壤細(xì)菌群落。

土壤微生物的分類學(xué)多樣性與功能多樣性有密切聯(lián)系,但并沒(méi)有顯著相關(guān)性[3, 8]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,土壤細(xì)菌多樣性受到極大關(guān)注,但我們對(duì)土壤細(xì)菌在樹(shù)線處的功能基因變化還不清楚[3, 9]。土壤微生物對(duì)環(huán)境的作用主要是通過(guò)微生物群落代謝功能差異來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此,了解微生物功能特性的分布規(guī)律對(duì)于更好的理解生態(tài)系統(tǒng)功能、生物地球化學(xué)循環(huán)以及微生物對(duì)環(huán)境改變的響應(yīng)具有重要作用[8]。

近幾年發(fā)展起來(lái)的高通量測(cè)序技術(shù),如Illumina平臺(tái)的MiSeq測(cè)序,以及羅氏454等,逐步提高了對(duì)土壤中微生物多樣性的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)標(biāo)記基因如16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序,可以獲得環(huán)境樣品的微生物區(qū)系組成。但是,想要獲得微生物的功能信息就需要對(duì)宏基因組進(jìn)行研究,其數(shù)據(jù)量龐大,成本非常高。隨著計(jì)算軟件的創(chuàng)新,利用預(yù)測(cè)軟件對(duì)標(biāo)記基因數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè),分析樣本中微生物群落代謝和宏基因組,成為一種高效、經(jīng)濟(jì)的方法[10- 12]。PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)是一個(gè)開(kāi)發(fā)于2012年的預(yù)測(cè)宏基因組功能基因的生物信息學(xué)軟件包[11],可以通過(guò)16S rRNA基因序列,預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)細(xì)菌和古菌的代謝功能譜,相關(guān)論文發(fā)表數(shù)量逐年增長(zhǎng)[13-14]。如2016年的一項(xiàng)研究[15]通過(guò)PICRUSt預(yù)測(cè)了吸煙人群和未吸煙人群的口腔菌群,發(fā)現(xiàn)有83個(gè)基因功能代謝通路存在顯著差異；Wu等利用PICRUSt研究了三七根腐病對(duì)應(yīng)的微生物功能的改變[16]。

本研究通過(guò)對(duì)北京東靈山遼東櫟林及草甸的土壤細(xì)菌群落進(jìn)行研究,提出以下科學(xué)問(wèn)題：(1)樹(shù)線如何影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能基因的分布？(2)哪些功能基因?qū)?shù)線這種環(huán)境突變響應(yīng)顯著？

1　材料與方法

1.1　土壤樣品采集

采樣地點(diǎn)位于北京東靈山地區(qū)。東靈山坐落于北京森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站(30°57′29 N, 115°25′33 E)。該區(qū)屬暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,寒冷期長(zhǎng),積溫低,凍土期長(zhǎng),生長(zhǎng)季短,年均溫5—10℃,年降雨500—650mm,70%的降水出現(xiàn)在6到8月[17]。地帶性土壤類型為肥沃褐色土和棕色森林土。從低海拔到高海拔的植被類型有次生灌木(Vitexnegundo,Spiaeaspp)、櫟樹(shù)混交林(Quercusliaotungensis)、樺樹(shù)林(Betuladahurica, platyphylla)、亞高山草甸(Forbmeadows)。

土壤樣品采于遼東櫟林向亞高山草甸的過(guò)渡帶,在遼東櫟林內(nèi)取17個(gè)10m×10m的樣方,海拔范圍1676—1770m。在樹(shù)線之上的亞高山草甸共取21個(gè)10m×10m樣方,海拔范圍1790—2280m。去掉土壤表層凋落物后,用環(huán)形土鉆取10cm厚的土壤,在每個(gè)10m×10m的樣方中共取六鉆土混合為一個(gè)樣品。新鮮土樣充分混合,過(guò)2mm的篩,冷凍干燥后放入-80℃冰箱中用于細(xì)菌DNA的提取。

1.2　樣品處理

每個(gè)樣品稱取冷凍干燥后的土壤0.25g。使用MOBIO Power Soil試劑盒(MO Bio Laboratories, USA)來(lái)提取土壤總DNA,依據(jù)試劑盒內(nèi)的操作流程進(jìn)行。將提取好的DNA保存在-40℃冰箱中備用。

采用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因高變區(qū)的V4-V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。合成帶有barcode序列(用于區(qū)分各個(gè)樣品)及接頭序列的特異引物515F/907R(前引物,515F, 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′；后引物,907R, 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。PCR擴(kuò)增體系為(25μL)：4μL 5×FastPfu Buffer,2μL 2.5mmol/L dNTPs,0.4μL前后引物(5mmol/L),0.4μL FastPfu聚合酶(TransGen, Beijing)以及10ng DNA模板。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2min,(95℃/30s,55℃/30s,72℃/45s)×30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè),之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。之后進(jìn)行MiSeq文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序。用Illumina MiSeq platform的(PE 2×300)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3　數(shù)據(jù)分析

對(duì)MiSeq測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,同時(shí)對(duì)序列的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾,并根據(jù)序列末端的box序列校正序列方向。拼接后的數(shù)據(jù)用QIIME v.1.8.0軟件[18]進(jìn)一步質(zhì)控：序列長(zhǎng)度小于200bp,50nt的移動(dòng)窗口中Q值小于30,含有模糊堿基,引物堿基中有大于一個(gè)的錯(cuò)配,以及不能夠被任何的barcode識(shí)別的序列,所有包含這些條件的序列將會(huì)被去掉[19]。用UCHIME[20]軟件基于“RDP Gold”數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)和去除嵌合體序列。對(duì)已去除嵌合體序列的文件依照Galaxy在線平臺(tái)的流程先進(jìn)行OTU聚類分析：首先是用QIIME軟件中的pick_closed_reference_otus.py命令基于97%的相似度,依據(jù)13_5 Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù),得到out_table.biom,并對(duì)其進(jìn)行序列標(biāo)準(zhǔn)化,用于后續(xù)的群落結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)。

將QIIME軟件得到的biom文件上傳到Galaxy網(wǎng)站進(jìn)行PICRUSt功能基因預(yù)測(cè)分析。將得到的功能基因中的信息參考KEGG Orthology的1級(jí)和2級(jí)功能基因類別劃分歸類,可得到預(yù)測(cè)基因組的功能組成。研究表明,PICRUSt對(duì)于土壤中細(xì)菌的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率較高[11]。利用PICRUSt軟件對(duì)已測(cè)得的16S rRNA基因數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè),分析樣本功能基因組成是一種高效的方法。

每個(gè)土壤樣品的細(xì)菌群落豐富度是通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品的OTU(operational taxonomic unit)獲得。細(xì)菌物種數(shù)以及預(yù)測(cè)功能基因和海拔之間的相關(guān)關(guān)系用多元或線性回歸方法進(jìn)行分析。擬合適合度采用調(diào)整的R2和P進(jìn)行判定?；贐ray-Curtis相似性矩陣的PCoA分析用于分析土壤細(xì)菌群落組成和預(yù)測(cè)基因功能多樣性的變異,并用多元的相似性分析方法ADONIS(Adonis test, Vegan package in R)檢驗(yàn)變異的顯著程度[21]。

2　研究結(jié)果

2.1　土壤細(xì)菌多樣性

圖1　土壤細(xì)菌物種數(shù)沿海拔的變化(虛線代表樹(shù)線處海拔)Fig.1　Elevational pattern of soil bacterial richness

本研究采取的38個(gè)樣品共計(jì)得到829756條序列,根據(jù)97%的相似度共劃分成11625個(gè)OTU(物種數(shù))。每個(gè)樣品的序列數(shù)在10450到30503條之間。經(jīng)過(guò)分類共計(jì)得到39個(gè)細(xì)菌門分類單元,其中優(yōu)勢(shì)分類門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi),占到總序列數(shù)的90%以上。優(yōu)勢(shì)分類門放線菌門和酸桿菌門在森林和草甸中表現(xiàn)出差異,放線菌門在森林和草甸中的相對(duì)多度分別為17.6%、20.7%,而酸桿菌門分別為17.5%、13.9%。

土壤細(xì)菌物種數(shù)(OTU)沿海拔沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的趨勢(shì),在樹(shù)線處也沒(méi)有明顯的下降(圖1)。

2.2　土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖2　細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在森林和草甸之間差異的PCoA排序分析Fig.2　PCoA analysis of community structure between forest and meadow

基于Bray-Curtis距離的細(xì)菌群落組成在PCoA分析的第一排序軸上明顯分成兩個(gè)區(qū)域(AdonisF1,36=5.116,R2=0.12,P=0.001；圖2),主要是森林和草甸之間的差異,解釋率為22.8%。第二排序軸顯示,在森林和草甸內(nèi)部的細(xì)菌群落組成也有差異,但小于第一排序軸,解釋率僅為10%。

2.3　PICRUSt基因預(yù)測(cè)

通過(guò)對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共獲得6類生物代謝通路功能分析：代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、環(huán)境信息處理(Environmentalin-formation processing)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular processes)、有機(jī)系統(tǒng)(Organismal systems)、人類疾病(Human diseases)。其中代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、人類疾病等的功能基因多度沿海拔呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì),并且在樹(shù)線處明顯的下降(圖3)。

圖3　預(yù)測(cè)功能基因多度沿海拔的變化趨勢(shì)(一級(jí)功能層)Fig.3　Elevational pattern of predicted functional profiles (hierarchy level 1)

二級(jí)功能層共包含39種子功能,根據(jù)Bray-Curtis距離矩陣計(jì)算出預(yù)測(cè)功能基因β多樣性,PCoA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第一排序軸是明顯分成兩個(gè)區(qū)域(AdonisF1,36=5.3815,R2=0.13,P=0.001；圖4),森林和草甸內(nèi)的細(xì)菌功能組成差異顯著。

圖4　土壤細(xì)菌預(yù)測(cè)功能基因在森林和草甸之間差異的PCoA排序分析(二級(jí)功能層)Fig.4　PCoA analysis of predicted functional profiles between forest and meadow (hierarchy level 2)

在39個(gè)二級(jí)預(yù)測(cè)功能中有10個(gè)子功能的相對(duì)多度在森林和草甸中具有明顯差異(圖5)。其中,其他次生產(chǎn)物代謝的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)、轉(zhuǎn)錄(Transcription)、多糖生物合成和代謝(Glycan biosynthesis and metabolism)、酶家族(Enzyme families)、信號(hào)分子及交互作用(Signaling molecules and interaction)、環(huán)境適應(yīng)(Environmental adapation)、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡(Growth and death)等的功能基因在森林中明顯高于草甸中。而維他命及輔因子代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、膜運(yùn)輸(Membrane transport)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(Endocrine system)等的功能基因在草甸中偏高。

圖5　預(yù)測(cè)功能基因在森林和草甸之間的差異(二級(jí)功能層)Fig.5　The variation of predicted functional profiles between forest and meadow (hierarchy level 2)

3　討論

土壤微生物地理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),OTU的多樣性經(jīng)常隨地理或環(huán)境梯度呈現(xiàn)不明顯的變化[22-23],但是群落結(jié)構(gòu)[22]和功能基因[8,24]常表現(xiàn)出明顯的差異和變化趨勢(shì)。本研究顯示,土壤細(xì)菌物種多樣性在樹(shù)線處沒(méi)有顯著變化,也沒(méi)有沿海拔梯度呈現(xiàn)出明顯的分布趨勢(shì),但群落結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)功能基因都在樹(shù)線處發(fā)生了顯著變化,與之吻合。

PCoA分析顯示,森林和草甸之間以及森林和草甸內(nèi)部的土壤細(xì)菌群落組成均有差異,說(shuō)明可能存在海拔的影響。從森林到草甸,植物群落結(jié)構(gòu)一直隨海拔梯度在變化,土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化可能與植物群落變化有關(guān)。雖然很多研究認(rèn)為土壤微生物物種多樣性與植物群落往往并沒(méi)有顯著相關(guān)[23, 25-26],但是土壤微生物可以通過(guò)改變土壤養(yǎng)分來(lái)影響植物生長(zhǎng)和初級(jí)生產(chǎn)力[27]。進(jìn)而,植物群落通過(guò)凋落物輸入與根系分泌物等過(guò)程改變土壤的理化性質(zhì)。這一過(guò)程不僅會(huì)影響土壤微生物在群落中的有無(wú),還會(huì)影響到其在群落中的多度,從而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[28- 29]。

PICRUSt基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、人類疾病等4類功能基因的多度沿海拔呈線性下降趨勢(shì),并且功能基因的組成也在樹(shù)線上下明顯不同。以往的研究利用基因芯片的技術(shù)也發(fā)現(xiàn)了林線交錯(cuò)群落功能基因多樣性的變化,例如Ding等[3]在神農(nóng)架的研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)線上下的灌木和針葉林群落中土壤微生物功能基因結(jié)構(gòu)組成具有明顯差異；Shen等[8]在長(zhǎng)白山的研究也發(fā)現(xiàn)林線交錯(cuò)群落土壤微生物功能基因多樣性發(fā)生變化。這些結(jié)果均表明,海拔梯度可能通過(guò)影響植物群落的變化進(jìn)而影響土壤微生物的功能基因。

已有研究表明,植物群落對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致土壤微生物群落功能組成的差異[30]。樹(shù)線上下的氣候環(huán)境條件顯著差異,植被群落明顯不同,導(dǎo)致微生物生活的微生境及養(yǎng)分需求有差異,從而對(duì)土壤微生物具有篩選作用[9],進(jìn)而影響微生物的功能組成。一方面,森林和草甸因?yàn)榈蚵湮镙斎氲牟町惗鴮?duì)土壤養(yǎng)分及其他生態(tài)過(guò)程產(chǎn)生不同的影響,從而導(dǎo)致土壤微生物的功能差異。森林土壤環(huán)境中存在著豐富的木質(zhì)纖維資源,土壤微生物中存在著大量與木質(zhì)纖維素代謝相關(guān)的菌系。而草甸群落植物多樣性低,凋落物類型簡(jiǎn)單,根系不發(fā)達(dá),根系分泌物種類及數(shù)量相對(duì)較少,因此可供微生物利用的資源較少。降雨淋溶、太陽(yáng)光輻射等非生物因素在凋落物的分解過(guò)程中扮演重要的角色,而土壤微生物分解相對(duì)弱[31]。另一方面,從森林到草甸,隨海拔上升溫度下降,低溫可能導(dǎo)致土壤微生物活動(dòng)減弱。Ding等的研究也發(fā)現(xiàn)溫度是影響林線兩側(cè)土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能的重要因素,本研究中一些和代謝相關(guān)的功能基因分類如其他次生產(chǎn)物代謝的生物合成、多糖生物合成和代謝、酶家族等在草甸中明顯下降,總體微生物功能基因多度在樹(shù)線處有明顯的下降。但是也有一些二級(jí)分類的功能基因在草甸中明顯高于森林,如膜運(yùn)輸、內(nèi)分泌系統(tǒng)等,這些功能基因可能有助于微生物在相對(duì)嚴(yán)酷的環(huán)境中有效利用土壤養(yǎng)分[16]。

4　結(jié)論

在本項(xiàng)研究的海拔梯度上,土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能基因組成在樹(shù)線上下顯著差異,且功能基因多度隨海拔呈下降趨勢(shì),敏感地反映了海拔梯度及樹(shù)線的環(huán)境變化,揭示了土壤和植被對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響規(guī)律。未來(lái)土壤微生物生態(tài)學(xué)研究,應(yīng)該更加關(guān)注群落組成與功能而非物種多樣性,加強(qiáng)微生物群落功能和結(jié)構(gòu)的分布規(guī)律及機(jī)制研究。

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