丁婷婷，董欣琪，張瑾,2,，班龍科，王磊

1. 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601 2. 清華大學(xué)新興有機(jī)污染物控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

沒有一種污染物是單獨(dú)存在的，而是以各種形式和濃度共存于環(huán)境中的，進(jìn)而形成了各種各樣復(fù)雜的混合污染物?；旌衔廴疚锏穆?lián)合毒性與相互作用對(duì)環(huán)境中的生物生存構(gòu)成了潛在的威脅[1-2]。因此，混合污染物的聯(lián)合毒性評(píng)估是一個(gè)挑戰(zhàn)性與必要性并存的課題[3]，而合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)是有效評(píng)估聯(lián)合毒性的首要條件[4-5]。環(huán)境毒理學(xué)研究中，學(xué)者們常用的混合物設(shè)計(jì)方法主要有析因設(shè)計(jì)(FD)[6]、固定濃度比射線法(FCRR)[7]和直接均分射線設(shè)計(jì)法(EquRay)[8]等。其中FD是研究簡單混合物毒性的經(jīng)典方法，因其實(shí)驗(yàn)工作量隨組分和濃度水平數(shù)呈指數(shù)增加，而不適于多元混合物毒性的研究。FCRR法是將傳統(tǒng)單點(diǎn)毒性評(píng)價(jià)方法轉(zhuǎn)變?yōu)檎麄€(gè)濃度-效應(yīng)曲線(CRC)上評(píng)價(jià)的設(shè)計(jì)方法，且適于3個(gè)以上組分混合物的設(shè)計(jì)。然而，F(xiàn)CRR法只選擇了一種近似真實(shí)的濃度配比，不能全面反映真實(shí)環(huán)境中混合物的濃度分布。EquRay法是在FCRR法的基礎(chǔ)上建立的二元混合物的設(shè)計(jì)方法，但不適于組分在整個(gè)空間濃度配比的多元混合物毒性評(píng)估。均勻設(shè)計(jì)射線法(uniform design ray, UD-Ray)[9]是成功地將FCRR法與均勻設(shè)計(jì)(uniform design, UD)結(jié)合的混合物設(shè)計(jì)方法，該方法能以盡可能少的工作量有效地探索混合物尤其多元混合物在不同組分濃度空間配比的毒性變化情況[9]。

除了合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，合適的聯(lián)合毒性評(píng)估方法也很重要。目前，關(guān)于聯(lián)合作用評(píng)估的經(jīng)典方法主要有等效線圖法(Isobolograms)[10]、毒性單位法(TU)[11]、加和指數(shù)法(AI)[12]和混合物毒性指數(shù)法(MTI)[13]等。但這些指數(shù)方法只研究了混合物體系在某一個(gè)特殊效應(yīng)濃度(通常為50%效應(yīng)時(shí)的濃度)的毒性作用情況，不能表征整個(gè)混合物體系。濃度加和模型(concentration addition, CA)是在混合物整個(gè)CRC上的評(píng)估方法，且能用于大多數(shù)混合物毒性的評(píng)估[14-16]。

越來越多的研究表明，污染物的毒性是隨時(shí)間逐漸產(chǎn)生并發(fā)展的一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，且不同的污染物隨時(shí)間可能有不同的毒性變化規(guī)律[17-18]。如三嗪類除草劑、離子液體、氨基糖苷類抗生素等及其混合物對(duì)發(fā)光菌青?；【鶴67的毒性具有明顯的時(shí)間依賴性，即毒性隨著時(shí)間的延長而逐漸增加，但不同的毒物，其毒性增加的幅度不同，有的污染物甚至出現(xiàn)了明顯的濃度-效應(yīng)曲線(CRC)類型的轉(zhuǎn)化，即從J型轉(zhuǎn)變成S型[19]。王猛超等[15]的研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥三嗪類除草劑及其混合物具有明顯的時(shí)間依賴性。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素及其混合物對(duì)發(fā)光菌具有明顯的時(shí)間依賴毒性。這表明污染物的毒性除與濃度相關(guān)外，與暴露時(shí)間也密切相關(guān)。因此，僅依據(jù)污染物在某一特殊暴露時(shí)間點(diǎn)的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)已不能說明實(shí)際環(huán)境體系的真實(shí)情況，必須全面系統(tǒng)采集這些污染物在不同暴露時(shí)間對(duì)暴露生物的毒性數(shù)據(jù)，并進(jìn)行聯(lián)合毒性作用隨時(shí)間逐漸變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律分析，才能揭示污染物間發(fā)生毒性相互作用的機(jī)制，才能客觀準(zhǔn)確評(píng)價(jià)環(huán)境污染物的潛在風(fēng)險(xiǎn)[21-22]。

氨基糖苷類抗生素(AG)是一類廣泛應(yīng)用于抗革蘭氏陰性細(xì)菌活性的廣譜性抗生素，因其低成本和高療效，在發(fā)達(dá)國家廣泛應(yīng)用于治療囊性纖維化患者和早產(chǎn)兒，以及各種嚴(yán)重或頑固的細(xì)菌感染，包括結(jié)核病[23]。然而，許多AG抗生素因具有較高的水溶性，很容易進(jìn)入水體，進(jìn)而威脅到水生生物甚至人類的健康和生存[20]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，綠藻和細(xì)菌是食物鏈的2個(gè)重要的環(huán)節(jié)，分別位于位于食物鏈的頂端和末端，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著生產(chǎn)者和分解者的角色。因此，開展AG抗生素對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中2種模式生物綠藻和細(xì)菌具有重要的實(shí)際環(huán)境意義。而目前關(guān)于AG抗生素對(duì)水生生物的在某一特殊暴露時(shí)間點(diǎn)的毒性已有報(bào)道[18,24]，而關(guān)于AG類抗生素的毒性及其聯(lián)合毒性相互作用(協(xié)同或拮抗作用)隨暴露時(shí)間變化的分析則更少[20,25]。

因此，本文擬以廣泛應(yīng)用的3種氨基糖苷類抗生素：硫酸安普霉素(apramycin sulfate, APR)、雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin, DIH)和硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate, STS)為研究對(duì)象，以水生生態(tài)系統(tǒng)中生產(chǎn)者綠藻如蛋白核小球藻(CP)和分解者細(xì)菌如發(fā)光菌青?；【鶴67為受試生物，采用UD-Ray法設(shè)計(jì)三元混合物體系(共安排5條具有不同濃度配比的混合物射線)，應(yīng)用時(shí)間依賴微板毒性分析方法(t-MTA)系統(tǒng)測(cè)定抗生素及其混合物射線在不同暴露時(shí)間分別對(duì)2種指示生物的毒性效應(yīng)，采用CA模型分析AG抗生素在不同暴露時(shí)間的聯(lián)合毒性相互作用(協(xié)同或拮抗作用)，并分析毒性相互作用類型隨時(shí)間的變化規(guī)律，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　材料、儀器及藥品

1.1.1材料

實(shí)驗(yàn)菌種青海弧菌Q67 (Vibrio qinghaiensis sp. ─Q67，簡稱Q67)購自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，菌種的培養(yǎng)與保存參照文獻(xiàn)[19]。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa，簡稱CP)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(FACHB)，編號(hào)為FACHB-5。藻種的培養(yǎng)與保存參照文獻(xiàn)[18]。

表1　3種氨基糖苷類(AG)抗生素的基本理化性質(zhì)Table 1　Basic physicochemical properties of three aminoglycosides (AG) antibiotics

表2　5條抗生素混合物射線的濃度比(pi)Table 2　Concentration ratio (pi) of five anbiotic mixture rays

注：Q67為青海弧菌Q67；CP為蛋白核小球藻。

Note: Q67 stands forVibrio qinghaiensis sp.─Q67; CP stands for Chlorella pyrenoidosa.

1.1.2儀器

實(shí)驗(yàn)中用到的主要設(shè)備包括Synergy 2酶標(biāo)儀(美國BioTek伯騰儀器有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)(三發(fā)儀器有限公司)、FA1004型五位電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)、YX280A手提式壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；Genex移液器(10～100 μL)(寶予德有限公司)和BS-2E數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱(上海梅香儀器有限公司)。

1.1.3藥品

3種抗生素：硫酸安普霉素(APR)、雙氫鏈霉素(DIH)、硫酸鏈霉素(STS)均購自上海原葉生物科技有限公司，其理化性質(zhì)列于表1中。儲(chǔ)備液用Mill-Q水配制，并于4 ℃冰箱中保存、備用。

1.2　混合物設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)考察混合物的毒性隨濃度和時(shí)間的變化規(guī)律，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)射線(UD-Ray)[9]法設(shè)計(jì)3種抗生素三元混合物體系5條射線(R1, R2, …, R5)，每條混合物射線的組分及其濃度配比pi值列于表2中。

1.3　時(shí)間毒性測(cè)試

抗生素及其混合物對(duì)發(fā)光菌和綠藻的時(shí)間毒性測(cè)定分別采用基于青?；【鶴67[20]和蛋白核小球藻CP[18]的時(shí)間毒性微板分析法(t-MTA)。對(duì)于發(fā)光菌，采用不透明的96孔白板作為實(shí)驗(yàn)暴露載體，而對(duì)于綠藻則采用透明的96孔微板作為實(shí)驗(yàn)載體。微板設(shè)計(jì)方法：在微板4周共36個(gè)孔各加入200 μL水防止產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。余下的60個(gè)孔第2、6、7及11列共24個(gè)孔中分別加入100 μL純水作為空白對(duì)照，第3列共6個(gè)孔以及第8列共6個(gè)孔分別加入按稀釋因子設(shè)計(jì)的12個(gè)不同濃度的毒物100 μL，第4和5列為第3列的平行實(shí)驗(yàn)以及第9和10列為第8列的平行實(shí)驗(yàn)，然后在60個(gè)孔中均加入100 μL已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的發(fā)光菌液或綠藻溶液，使各孔中的試液總體積為200 μL，每個(gè)濃度至少重復(fù)3塊板。

對(duì)于加入發(fā)光菌的微板，則置于恒溫培養(yǎng)箱中(22±1) ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在暴露時(shí)間為0.25 h、2 h、4 h、8 h、12 h時(shí)取出并置于讀板機(jī)中測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，并計(jì)算微板中各個(gè)孔中不同濃度的毒物對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光抑制率[20]。

對(duì)于加入綠藻的微板，則置于溫度(22±1) ℃、光強(qiáng)為5 000 lux的光照條件下的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在暴露時(shí)間為12 h、24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)取出，并置入美國Biotek微板光度計(jì)中測(cè)定其光密度OD690的值，并計(jì)算微板各個(gè)孔中不同濃度的毒物對(duì)綠藻的生長抑制率[18]。

1.4　時(shí)間毒性數(shù)據(jù)處理與擬合

為了揭示不同暴露時(shí)間、不同濃度污染物對(duì)發(fā)光菌或綠藻的毒性變化規(guī)律，采用兩參數(shù)非線性函數(shù)Weibull(1)和Logit(2)對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合，擬合相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient，簡稱R)與均方根誤差(root mean square error, RMSE)最小者為最優(yōu)[26]。2個(gè)用于描述實(shí)驗(yàn)毒性數(shù)據(jù)的非線性函數(shù)公式如下：

E=1/(1+exp(-α-β log10(c)))

(1)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(2)

式中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數(shù)，E為效應(yīng)即污染物對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光抑制率或?qū)G藻的生長抑制率；c是污染物的濃度。

1.5　混合物毒性相互作用分析

用于混合毒性評(píng)估參考模型CA見公式(4)[16]，當(dāng)觀測(cè)毒性大于加和參考模型預(yù)測(cè)毒性時(shí)稱混合物產(chǎn)生協(xié)同作用，小于預(yù)測(cè)毒性時(shí)則稱有拮抗作用，若等于預(yù)測(cè)毒性則稱為無相互作用或加和作用。

(3)

式中ci表示混合物中產(chǎn)生某一效應(yīng)x%時(shí)組分i的濃度，ECx,i表示混合物中第i個(gè)化合物單獨(dú)存在時(shí)所產(chǎn)生的效應(yīng)與混合物總效應(yīng)x%相同時(shí)的濃度，E(cmix)表示混合物產(chǎn)生的總效應(yīng)，E(ci)表示表示混合物中第i個(gè)化合物單獨(dú)存在時(shí)所產(chǎn)生的效應(yīng)。

2　結(jié)果(Results)

2.1　3種AG抗生素對(duì)發(fā)光菌和綠藻的時(shí)間依賴毒性

3種AG抗生素在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)(點(diǎn))以及通過非線性最小二乘擬合方法的擬合結(jié)果列于表3中，其濃度-效應(yīng)曲線繪于圖1中。

從表3可看出，Logit函數(shù)能較好地?cái)M合3種抗生素對(duì)發(fā)光菌Q67和綠藻CP在不同暴露時(shí)間的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，擬合相關(guān)系數(shù)R除在開始的個(gè)別暴露時(shí)間點(diǎn)均在0.9以上，均方根誤差RMSE小于0.9。從圖1可看出，3種抗生素對(duì)2種指示生物的濃度-效應(yīng)曲線(CRCs)均是隨暴露時(shí)間延長從下至上依次排列，表明3種抗生素的毒性均具有明顯的時(shí)間依賴毒性，即隨著暴露時(shí)間的延長，3種抗生素對(duì)2種指示生物的毒性逐漸增強(qiáng)。但不同抗生素對(duì)于同一種指示生物發(fā)光菌或綠藻的毒性隨暴露時(shí)間的延長變化規(guī)律不同，如抗生素APR和DIH對(duì)發(fā)光菌在0～2 h內(nèi)，沒有明顯毒性，但2 h后，毒性迅速增強(qiáng)，8 h后毒性增強(qiáng)緩慢；而STS對(duì)2種指示生物的毒性從暴露開始就逐漸增強(qiáng)，在2 h增加速率最快，此后開始變緩。以半數(shù)效應(yīng)濃度的負(fù)對(duì)數(shù)值(pEC50值)為毒性大小指標(biāo)，3種抗生素對(duì)于Q67和CP在暴露時(shí)間分別為12 h和96 h時(shí)的毒性大小順序均為：STS > DIH > APR (表3)，但2種水生生物對(duì)3種抗生素及其混合物的響應(yīng)不同，總的來說發(fā)光菌的靈敏度要高于蛋白核小球藻(圖1和表3)

表3　3種抗生素對(duì)Q67和CP的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)Logit擬合的參數(shù)、統(tǒng)計(jì)量、半數(shù)效應(yīng)濃度及其負(fù)對(duì)數(shù)值Table 3　The parameters of fitting function Logit, statistics, median effect concentration (EC50) and its negative logarhim for the three antibiotics’ concentration-response data towards Q67 and CP

注：α、β為擬合參數(shù)；RMSE和R分別是均方根誤差和擬合相關(guān)系數(shù)；EC50為半數(shù)效應(yīng)濃度；pEC50為EC50的負(fù)對(duì)數(shù)。

Note:α, β are fitting parameters; RMSE and R are root mean square error and fitting correlation coefficient, respectively; EC50is median effect concentration; pEC50is -logEC50.

2.2　AG抗生素三元混合物對(duì)發(fā)光菌和綠藻的時(shí)間依賴毒性

采用UD-Ray法設(shè)計(jì)的三元混合物體系的5條射線分別對(duì)2種指示生物在不同暴露時(shí)間的擬合，結(jié)果繪于圖2中。圖2顯示CRC與單個(gè)物質(zhì)的毒性具有類似的時(shí)間依賴性。

圖3是5條混合物射線分別對(duì)Q67和CP的pEC50值隨時(shí)間的變化曲線圖。從圖3可以看出，3條混合物射線對(duì)Q67的pEC50值均隨暴露時(shí)間的延長而單調(diào)增加，且增加的趨勢(shì)相似，但3條混合射線對(duì)CP的pEC50值隨時(shí)間單調(diào)增加的規(guī)律不同，R1和R3在72 h才達(dá)到50%的抑制率，而其余3條射線則是在48 h達(dá)到50%的抑制率。圖2和圖3也顯示，2種指示生物對(duì)AG抗生素的三元混合物體系的毒性響應(yīng)有差異，發(fā)光菌的響應(yīng)比綠藻的靈敏。

2.3　AG抗生素混合物的時(shí)間依賴毒性相互作用

三元混合物的5條射線對(duì)Q67和CP的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)及其CRC曲線以及CA預(yù)測(cè)結(jié)果繪于圖4中和圖5中(由于在開始的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，所有的混合物射線都沒有明顯的毒性，故圖4和圖5中沒列出)。

圖1　3種抗生素對(duì)Q67和CP在不同暴露時(shí)間的濃度-效應(yīng)曲線(CRCs)Fig. 1　Concentration-response curves of three antibiotics at different time points for Q67 and CP

圖2　三元混合物射線不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)Q67和CP的CRCs關(guān)系Fig. 2　The CRCs of ternary mixture rays at different exposure times for Q67 and CP

圖4顯示，所有混合物射線的CA預(yù)測(cè)線基本上都在實(shí)驗(yàn)觀測(cè)CRC的置信區(qū)間內(nèi)，且?guī)缀跖c實(shí)驗(yàn)觀測(cè)CRC重疊，表明CA能很好地預(yù)測(cè)所有混合物射線在不同暴露時(shí)間對(duì)發(fā)光菌的毒性，即3個(gè)抗生素的三元混合物對(duì)青?；【鶴67的毒性呈經(jīng)典的加和作用，且不隨暴露時(shí)間的延長和濃度的增加而發(fā)生變化。圖5顯示三元混合物的5條射線中，CA對(duì)R2、R3和R4的預(yù)測(cè)線也落在實(shí)驗(yàn)觀測(cè)CRC的置信區(qū)間，即3條射線也為加和作用，且不隨暴露時(shí)間和暴露濃度的變化而變化。而CA對(duì)R1和R5的預(yù)測(cè)線在72 h和96 h落在了觀測(cè)CRC的上方，表明2條射線在這2個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)的毒性呈現(xiàn)拮抗作用，且隨暴露時(shí)間的變化而變化，其中R1在暴露時(shí)間48 h呈加和作用，在72 h則呈明顯的拮抗作用，然后拮抗作用開始減弱；R5則從48 h的加和作用，變化為96 h的弱拮抗作用，2條射線的拮抗作用均發(fā)生在中濃度區(qū)。

3　討論(Discussion)

越來越多的研究表明部分污染物具有明顯的時(shí)間依賴毒性，但不同的污染物具有不同的時(shí)間毒性變化規(guī)律[18, 27]。本研究中的3種抗生素及其三元混合物射線對(duì)2種指示生物的毒性均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性，但不同抗生素對(duì)于指示生物的毒性隨暴露時(shí)間的延長變化規(guī)律不同。因此在進(jìn)行污染物生態(tài)毒性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)同時(shí)考慮濃度與時(shí)間2個(gè)因素[18]，才能全面了解污染物的毒性效應(yīng)，更深入地了解污染物的毒性作用機(jī)制與途徑。

不同的水生生物對(duì)同一種化合物或混合物的毒性響應(yīng)可能不同[28]。因此，本研究比較3種抗生素及其混合物對(duì)2種指示生物發(fā)光菌和綠藻的毒性，結(jié)果如圖1和表3顯示，2種水生生物對(duì)3種抗生素的響應(yīng)不同，發(fā)光菌的靈敏度要高于蛋白核小球藻。這可能是由于綠藻的毒性指標(biāo)為生長抑制率，是通過測(cè)定藻溶液在某一特定波長的吸光度值來計(jì)算得到的，實(shí)驗(yàn)中死亡的藻細(xì)胞可能對(duì)結(jié)果有一定的影響，而發(fā)光菌的毒性指標(biāo)為發(fā)光抑制毒性，通過計(jì)算暴露前后發(fā)光菌的發(fā)光值而得到的，受損或死亡的菌體發(fā)光很弱或不發(fā)光，而對(duì)于菌落的發(fā)光值影響很小。馮曉娜等[29]也研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)污染物對(duì)不同模式生物的毒性有差異，對(duì)發(fā)光菌的毒性明顯高于對(duì)魚的毒性。

混合物的毒性相互作用可能具有濃度或濃度比依賴性[30]。因此，為了解混合物組分在整個(gè)空間濃度配比的相互作用情況，混合物的設(shè)計(jì)顯得極其重要的。在混合物的設(shè)計(jì)方法中，UD-Ray[9]是將簡單的混合物聯(lián)合毒性研究推向真正的多組分的復(fù)雜混合物領(lǐng)域，且能以最少的實(shí)驗(yàn)工作最有效地考察具有各種組分濃度空間配比的混合污染物的聯(lián)合毒性。因此，在本研究中，采用均勻設(shè)計(jì)射線法(UD-ray)，設(shè)計(jì)了一組三元混合物體系共計(jì)5條具有不同組分濃度配比的混合物射線，并應(yīng)用時(shí)間毒性微板分析法系統(tǒng)測(cè)定了5條混合物射線分別對(duì)2種指示生物在不同暴露時(shí)間的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示具有不同濃度配比的混合物射線對(duì)發(fā)光菌Q67呈經(jīng)典的加和作用。Zhang等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素二元混合物對(duì)發(fā)光菌Q67在不同暴露時(shí)間的毒性均呈經(jīng)典的加和作用。但三元混合物體

圖3　三元混合物射線的pEC50值隨時(shí)間變化曲線Fig. 3　The changing curves of pEC50 values with the time for the ternary mixture rays

系A(chǔ)PR-DIH-STS的5條射線對(duì)蛋白核小球藻CP的毒性，既有加和作用也有拮抗作用，且拮抗作用隨暴露時(shí)間和暴露濃度的變化而變化。這表明抗生素聯(lián)合毒性相互作用與指示生物和暴露時(shí)間有關(guān)。Liu等[28]也報(bào)道同一組混合物可能對(duì)不同的指示生物呈現(xiàn)出不同甚至是截然相反的毒性相互作用類型。

圖4　三元AG抗生素混合物體系對(duì)Q67的實(shí)驗(yàn)觀察濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)及其95%置信區(qū)間以及CA預(yù)測(cè)結(jié)果注：圖中黑色分散的點(diǎn)(·)，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)；黑色實(shí)線(—)，擬合線；紅色虛線(---)，CA預(yù)測(cè)線；藍(lán)色虛點(diǎn)線(--)，95%置信區(qū)間；下同。Fig. 4　The observed concentration-response data together with their 95% confidence intervals and predicted curves by CA for the ternary AG antibiotic mixture systems towards Q67Note: The black dispersed point, black solid line, red dash line and the blue dash dot line in figure refer to the observed data, fitted line, CA prediction line and 95% confidence interval, respectively; the same below.

同一指示生物CP，UD-Ray設(shè)計(jì)的不同濃度配比射線的毒性相互作用也不相同，有的射線呈加和作用，而有的射線呈拮抗作用，且不同射線，拮抗作用的程度不同，AG抗生素毒性及其聯(lián)合毒性相互作用與暴露的生物、混合物組分的濃度配比、暴露時(shí)間等有關(guān)。同時(shí)表明，UD-Ray法與固定組分濃度配比的FCRR法和FD相比，更適于多組分混合物聯(lián)合毒性作用的研究。

綜上，3種AG抗生素APR、DIH和STS及其三元混合物射線對(duì)2種指示生物發(fā)光菌Q67和蛋白核小球CP具有明顯的時(shí)間依賴毒性，但Q67對(duì)3種抗生素及其混合物射線的響應(yīng)比CP的靈敏。以半數(shù)效應(yīng)濃度的負(fù)對(duì)數(shù)pEC50值為毒性大小指標(biāo)，3種AG抗生素對(duì)2種指示生物的毒性大小順序隨暴露時(shí)間而變化，對(duì)于Q67和CP在暴露時(shí)間分別為12 h和96 h時(shí)的毒性大小順序均為：STS > DIH > APR。5條具有不同組分濃度配比的AG抗生素混合物射線對(duì)Q67在不同暴露時(shí)間的毒性均呈加和作用，但對(duì)CP的毒性既有加和作用也有拮抗作用，且拮抗作用具有濃度比依賴性和時(shí)間依賴性，表明AG抗生素毒性及其聯(lián)合毒性相互作用與暴露的生物、混合物的濃度、組分的濃度配比、暴露時(shí)間等有關(guān)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]徐永剛, 宇萬太, 馬強(qiáng), 等. 環(huán)境中抗生素及其生態(tài)毒性效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(3): 11-27

Xu Y G, Yu W T, Ma Q, et al. The antibiotic in environment and its ecotoxicity: A review [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 11-27 (in Chinese)

[2]張瑾, 劉樹深. 離子液體與有機(jī)磷農(nóng)藥間的毒性相互作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2012, 7(4): 408-414

Zhang J, Liu S S. Toxicity interaction between ionic liquids and organophosphate pesticides [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(4): 408-414 (in Chinese)

[3]楊蓉, 李娜, 饒凱鋒, 等. 環(huán)境混合物的聯(lián)合毒性研究方法[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2016, 11(1): 1-13

Yang R, Li N, Rao K F, et al. Review on methodology for environmental mixture toxicity study [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(1): 1-13 (in Chinese)

[4]方開泰, 馬長興. 正交與均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 1

Fang K T, Ma C X. Orthogonal and Uniform Experimental Design [M]. Beijing: Science Press, 2001: 1 (in Chinese)

[5]劉樹深, 易忠勝. 基礎(chǔ)化學(xué)計(jì)量學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 6-7

Liu S S, Yi Z S. Basic Chemometrics [M]. Beijing: Science Press, 1999: 6-7 (in Chinese)

[6]Groten J P, Schoen E D, Feron V J. Use of factorial designs in combination toxicity studies [J]. Food and Chemical Toxicology, 1996, 34(11-12): 1083-1089

[7]Meadows S L, Gennings C, Carter W H, et al. Experimental designs for mixtures of chemicals along fixed ratio rays [J]. Environmental Health Perspectives, 2002, 110(Suppl 6): 979-983

[8]竇容妮, 劉樹深, 劉海玲, 等. 部分含J-型劑量-效應(yīng)關(guān)系二元混合物的毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2010, 5(4): 498-504

Dou R N, Liu S S, Liu H L, et al. Toxicities of binary mixtures including at least one component with J-shaped dose-response curve [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(4): 498-504 (in Chinese)

[9]Liu S S, Xiao Q F, Zhang J, et al. Uniform design ray in the assessment of combined toxicities of multi-component mixtures [J]. Science Bulletin, 2016, 61(1): 1-7

[10]Howard G J, Webster T F. Generalized concentration addition: A method for examining mixtures containing partial agonists [J]. Journal of Theoretical Biology, 2009, 259(3): 469-477

[11]Marking L. Method for assessing additive toxicity of chemical mixtures [J]. ASTM Special Technical Publication, 1977, 634: 99-108

[12]Sprague J B, Ramsay B A. Lethal levels of mixed copper-zinc solutions for juvenile salmon [J]. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1965, 22(2): 425-432

[13]Prakash J, Nirmalakhandan N, Sun B, et al. Toxicity of binary mixtures of organic chemicals to microorganisms [J]. Water Research, 1996, 30(6): 1459-1463

[14]劉樹深, 劉玲, 陳浮. 濃度加和模型在化學(xué)混合物毒性評(píng)估中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 71(10): 1335-1440

Liu S S, Liu L, Chen F. Application of the concentration addition model in the assessment of chemical mixture toxicity [J]. Acta Chimica Sinica, 2013, 71(10): 1335-1440 (in Chinese)

[15]王猛超, 劉樹深, 陳浮. 拓展?jié)舛燃雍湍Ｐ皖A(yù)測(cè)三種三嗪類除草劑混合物的時(shí)間依賴毒性[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 72(1): 56-60

Wang M C, Liu S S, Chen F. Predicting the time-dependent toxicities of three triazine herbicide mixtures to V. qinghaiensis sp.-Q67 using the extended concentration addition model [J]. Acta Chimica Sinica, 2014, 72(1): 56-60 (in Chinese)

[16]Rodney S I, Teed R S, Moore D R. Estimating the toxicity of pesticide mixtures to aquatic organisms: A review [J]. Human and Ecological Risk Assessment: An International Journal, 2013, 19(6): 1557-1575

[17]Hatano A, Shoji R. A new model for predicting time course toxicity of heavy metals based on Biotic Ligand Model (BLM) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2010, 151(1): 25-32

[18]陳瓊, 張瑾, 李小猛, 等. 幾種抗生素對(duì)蛋白核小球藻的時(shí)間毒性微板分析法[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 190-197

Chen Q, Zhang J, Li X M, et al. Time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) of several antibiotics toChlorella pyrenoidosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 190-197 (in Chinese)

[19]Zhang J, Liu S S, Yu Z Y, et al. Time-dependent hormetic effects of 1-alkyl-3-methylimidazolium bromide onVibrio qinghaiensis sp.-Q67: Luminescence, redox reactants and antioxidases [J]. Chemosphere, 2013, 91(4): 462-467

[20]Zhang J, Liu S S, Dong X Q, et al. Predictability of the time-dependent toxicities of aminoglycoside antibiotic mixtures to Vibrio qinghaiensis sp.-Q67 [J]. RSC Advances, 2015, 5(129): 107076-107082

[21]Baas J, Jager T, Kooijman B. Understanding toxicity as processes in time [J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(18): 3735-3739

[22]Margerit A, Gomez E, Gilbin R. Dynamic energy-based modeling of uranium and cadmium joint toxicity to Caenorhabditis elegans [J]. Chemosphere, 2016, 146(C): 405-412

[23]Coffin A B, Rubel E W, Raible D W. Bax, Bcl2, and p53 differentially regulate neomycin-and gentamicin-induced hair cell death in the zebrafish lateral line [J]. Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 2013, 14(5): 645-659

[24]Bohm D A, Stachel C S, Gowik P. Confirmatory method for the determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in honey by LC-MS/MS [J]. Food Additives & Contaminants: Part A, 2012, 29(2): 189-196

[25]董欣琦, 陳敏, 張瑾, 等. 氨基糖苷類抗生素混合物對(duì)蛋白核小球藻的時(shí)間依賴毒性[J]. 安徽建筑大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2016, 24(6): 67-73

Dong X Q, Chen M, Zhang J, et al. Time-dependent toxicity of aminoglycoside antibiotics to Chlorella pyrenoidosa [J]. Journal of Anhui Jianzhu University: Natural Science Edition, 2016, 24(6): 67-73 (in Chinese)

[26]劉樹深, 張瑾, 張亞輝, 等. APTox: 化學(xué)混合物毒性評(píng)估與預(yù)測(cè)[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 70(14): 1511-1517

Liu S S, Zhang J, Zhang Y H, et al. APTox: Assessment and prediction on toxicity of chemical mixtures [J]. Acta Chimica Sinica, 2012, 70(14): 1511-1517 (in Chinese)

[27]林楠, 張晶, 劉樹深. 污染物對(duì)青海弧菌Q67的時(shí)間依賴微板毒性分析[Z]. 中國科技論文在線精品論文, 2013, 6(24): 2321-2328

Lin N, Zhang J, Liu S S. Time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) of pollutant to Vibrio qinghaiensis sp. Q67 [Z]. Science Paper Online, 2013, 6(24): 2321-2328 (in Chinese)

[28]Liu S S, Wang C L, Zhang J, et al. Combined toxicity of pesticide mixtures on green algae and photobacteria [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013, 95(1): 98-103

[29]馮曉娜, 楊芷, 孫潔, 等. 有機(jī)污染物對(duì)發(fā)光菌和魚的毒性相關(guān)性研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2017, 12(3): 687-694

Feng X N, Yang Z, Sun J, et al. Investigation of toxicity correlation of organic pollutants between Vibrio fischeri and fish [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 687-694 (in Chinese)

[30]Jonker M J, Svendsen C, Bedaux J J M, et al. Significance testing of synergistic/antagonistic, dose level-dependent, or dose ratio-dependent effects in mixture dose-response analysis [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2010, 24(10): 2701-2713