熊成文，李曉偉，徐得娟

（1.青海省食品檢驗檢測院，青海西寧 810016；2.青海高遠錦禾生態(tài)農牧科技有限公司，青海西寧 810016）

藜麥（Chenopodium quinoa）是南美洲安第斯山脈地區(qū)的重要作物[1]，藜麥籽實富含大量人體必需的維生素、氨基酸、礦物質、蛋白質和碳水化合物以及天然抗氧化物質，藜麥被聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（FAO）評為21世紀具有保護糧食安全使命的作物之一[2-5]。藜麥籽實是黃酮化合物的良好來源，槲皮素和山柰酚是藜麥的主要黃酮化合物，而常見谷物如小麥、大麥和燕麥等不含有黃酮類化合物[6-8]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎以及防癌抗癌的作用[9-11]，是對健康有益的成分，因此，藜麥可作為提高健康水平的生物活性物質的來源[12-13]。

本試驗通過優(yōu)化提取工藝，進行了方法學考察，建立了藜麥中槲皮素和山柰酚的HPLC測定方法，并對不同產地和不同加工方法的藜麥籽實中槲皮素和山柰酚的含量進行了比較，旨在為更好地評價藜麥的品質提供一種簡便、可行、重復性好的質量控制方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑 供試樣品藜麥為青藜一號，產自海拔3 100 m的青海省海西州都蘭縣香加鄉(xiāng)，由青海高遠錦禾生態(tài)農牧科技有限公司提供；槲皮素對照品，由上海金穗生物科技有限公司提供（批號20160709，含量≥98%）；山柰酚對照品，由上海金穗生物科技有限公司提供（批號20160817，含量≥98%）。甲醇為色譜純，磷酸、鹽酸等其他試劑均為分析純，水為實驗室三級用水。

1.1.2 儀器與設備 高效液相色譜儀（Waters e2695，美國Waters公司），配有二極管陣列檢測器（Waters 2996，美國 Waters公司），色譜工作站（Empower，美國Waters公司）。電子天平（FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州智博瑞儀器制造有限公司）；超聲波清洗機（JP-030S，深圳市潔盟清洗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 取槲皮素對照品20mg、山柰酚對照品10mg，精密稱定，分別置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL中含20 μg槲皮素和10 μg山柰酚的混合對照品溶液。

1.2.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱采用Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（55∶45）；檢測波長 360 nm；流速 1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；進樣量 20 μL。

1.2.3 標準工作曲線的繪制 精密量取混合對照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得系列混合對照品溶液。分別精密量取系列混合對照品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以混合對照品溶液的質量濃度（C，mg/L）為橫坐標，測得峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 供試品溶液的制備 取藜麥樣品適量，研細，過0.25 mm篩，取約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞三角瓶中，加80%甲醇溶液50 mL，搖勻，稱定質量，超聲提取1 h，再回流提取1 h，取出，放至室溫，用80%甲醇溶液補足質量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置100 mL具塞三角瓶中，加濃鹽酸5 mL，回流水解1 h，水解液轉移置100 mL量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45μm）過濾，即得供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇 嘗試使用甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-醋酸溶液等洗脫系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水和乙腈-水洗脫系統(tǒng)所得色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，比較磷酸、冰醋酸等掃尾劑，結果發(fā)現(xiàn)，磷酸改善峰形的效果更好，甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液對色譜峰的分離無明顯差異，因此，使用經濟性較好的甲醇-磷酸溶液洗脫系統(tǒng)，通過調整流動相的比例，選用甲醇-體積分數(shù)0.5%磷酸（體積比55∶45）時，樣品中待測組分分離效果較好，槲皮素、山柰酚二組分能完全分離。色譜圖如圖1所示。

2.1.2 紫外檢測波長的選擇 槲皮素在254，360 nm處、山柰酚在265，360 nm處有最大吸收，比較254，265，360 nm波長處對藜麥樣品含量測定時的影響，槲皮素、山柰酚均在360 nm波長靈敏度較高，并且沒有雜質干擾。因此，確定360 nm作為檢測波長[14]。

2.1.3 提取方法和溶劑對色譜含量測定的影響比較超聲提取法、索氏提取法和回流提取法結果發(fā)現(xiàn)，索氏提取法與回流提取法測得的含量接近，超聲提取法提取完全，待測組分含量最高?？疾焐V甲醇、體積分數(shù)60%，70%，80%的甲醇溶液、無水乙醇、體積分數(shù)50%，70%，90%的乙醇溶液作提取溶劑，結果發(fā)現(xiàn)，體積分數(shù)80%甲醇溶液的提取效率最高。因此，選擇體積分數(shù)為80%的甲醇溶液作為提取液。

2.2 標準曲線和線性范圍

槲皮素標準曲線的回歸方程為A＝66 688C－21 325（r＝0.999）；山柰酚標準曲線的回歸方程為A＝80 912C＋5 517.4（r＝0.999）。結果表明，槲皮素、山柰酚的質量濃度分別在1.0～20.0 mg/L，0.5～10.0 mg/L范圍內與所測得的相應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3 精密度

取槲皮素和山柰酚的質量濃度分別為4.0，2.0 mg/L的混合對照品溶液，按1.2.2色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.4%和1.3%，說明儀器的精密度良好。

2.4 重復性

取藜麥籽實粉約1 g，精密稱定，按1.2.4步驟平行制備供試品溶液6份，按1.2.2色譜條件進樣分析，記錄槲皮素和山柰酚色譜圖。計算槲皮素和山柰酚的平均含量分別為506.8，91.8 μg/g，相對標準偏差（RSD）所示分別為1.6%和1.6%。說明該方法的重復性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

取室溫放置的供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h，按1.2.2色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。計算槲皮素和山柰酚峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.5%和1.8%。表明室溫放置的供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.6 回收率

稱取含量已知的藜麥籽實粉約0.5 g（槲皮素、山柰酚含量分別為 506.8，91.8 μg/g），精密稱定，共9份，按含量低、中、高分別加入不同體積的槲皮素和山柰酚對照品溶液，使其分別相當于藜麥籽實原有含量的75%，100%，125%，每一質量濃度重復3份，按1.2.4步驟制備供試品溶液，在1.2.2色譜條件下進行分析，記錄色譜圖，計算回收率，結果如表1所示。槲皮素的回收率平均為91.0%，RSD為0.4%（n＝9）；山柰酚的回收率平均為89.3%，RSD為1.6%（n＝9）。表明上述方法的回收率符合要求，準確度良好。

表1 槲皮素和山柰酚的加樣回收結果

2.7 樣品含量測定

分別取9個產地和不同加工工藝處理后的藜麥粉各1 g，精密稱定，按1.2.2色譜條件和方法測定藜麥樣品，計算槲皮素和山柰酚的含量（表2）。

表2 不同地區(qū)藜麥中槲皮素和山柰酚含量測定結果

續(xù)表2

3 結論

本試驗建立了同時測定藜麥中的槲皮素和山柰酚2種黃酮類物質的高效液相色譜方法，樣品用80%甲醇溶液超聲波及回流提取后再加濃鹽酸水解，水解液采用高效液相色譜法測定，可在20 min內完成槲皮素和山柰酚的含量測定。通過對樣品提取方法和溶劑的優(yōu)化，并選擇甲醇-0.4%磷酸（體積比55∶45）為流動相，明顯改善了峰形，以槲皮素和山柰酚均有較高靈敏度且無雜質干擾的360 nm作為檢測波長，方法的線性范圍、精密度、回收率、穩(wěn)定性等均在液相色譜法允許的范圍內，可在較寬濃度范圍內對藜麥中的槲皮素和山柰酚進行同時分析，有助于提高藜麥檢測的分析效率，降低檢測成本，為藜麥的品質評價提供了一種簡便可行、重復性好的質量控制方法。

4 討論

如果樣品不經水解，測得各產地藜麥籽實中槲皮素和山柰酚的含量普遍較低，這與文獻中報道[15]的槲皮素和山柰酚在藜麥中多以苷的形式存在的結果相一致，所以，需要用鹽酸水解的方法水解得到槲皮素和山柰酚?？疾?5 mL供試品提取溶液中加入不同體積的濃鹽酸5，10，15 mL，結果加入濃鹽酸5 mL時提取液中的槲皮素和山萘酚即可完全水解，因此，采用25 mL供試品提取液中加入5 mL濃鹽酸水解。

試驗結果表明，國內藜麥中槲皮素含量明顯高于山柰酚，進口原產地藜麥中槲皮素和山萘酚的含量相當，甚至山萘酚含量會高于槲皮素。不同產地藜麥籽實中2種黃酮苷元含量存在明顯差異，其中，青海省海西州都蘭縣香加鄉(xiāng)種植的青藜一號中槲皮素含量最高，原產地玻利維亞的藜麥中山柰酚含量最高，這可能與藜麥品種及其產地的海拔、氣候、土壤條件等有關[16]。

由于藜麥籽實的外殼中含有大量的皂苷類物質[17-19]，味苦澀且為有抗營養(yǎng)的作用，因此，使用前需先除去藜麥外殼[20]，常采用的方法有水洗、研磨和混合法。水洗法由于產生大量的污水而不適合現(xiàn)代工業(yè)加工生產；研磨法由于加工過程中為徹底除去藜麥外殼長時間研磨產生高溫而破壞了藜麥中的活性成分，同樣不適合藜麥的生產加工。采用短時研磨加水洗的混合法，通過短時研磨除去大部分藜麥外殼，再用一定溫度的水洗滌藜麥籽實，徹底除去殘余的藜麥外殼，這種混合處理的方式既不會產生高溫也不會產生大量的污水，是一種理想的藜麥加工方法。本研究通過測定水洗法和混合法加工后藜麥中槲皮素和山萘酚的含量發(fā)現(xiàn)，混合法加工過后的藜麥中槲皮素含量稍有降低，降低了約7%，山萘酚含量不但沒有降低反而比水洗法高，提高了約28%，這可能與藜麥加工時產生的熱量促進了山萘酚的生成有關。

測定了藜麥籽實、葉、莖稈和種皮中槲皮素和山萘酚的含量，其中，藜麥葉片中槲皮素和山萘酚的含量最高，莖稈中2種物質的含量最低。說明藜麥葉片作為植物的營養(yǎng)器官[21]，黃酮類物質含量較高，而莖稈是植物的結構支撐器官，其所含的黃酮類物質很少。研究結果為今后藜麥植物的綜合開發(fā)利用奠定了基礎。

參考文獻：

［1］ STIKIC R，GLAMOCLIJA D，DEMIN M，et al.Agronomical and nurtional evaluation of quinoa seed（Chenopodium quinoa Willd.）as an ingredient in bread formulations[J].Journal of Cereal Science，2012，55：132-138.

［2］陳樹俊，胡潔，龐震鵬，等.藜麥營養(yǎng)成分及多酚抗氧化活性的研究進展[J].山西農業(yè)科學，2016，44（1）：110-114.

［3］MENEGUETTI QA，BRENZANMA，BATISTA MR，et al.Biological effects of hydrolyzed quinoa extract from seeds of Chenopodium quinoa Willd[J].Journal ofMedicinal Food，2011，14（6）：653-657.

［4］王黎明，馬寧，李頌，等.藜麥的營養(yǎng)價值及其利用前景[J].食品工業(yè)科技，2014，35（1）：381-385.

［5］REPO-CARRASCO-VALENCIA R A，ENCINA C R，BINAGHI M J，et al.Effects of roastingand boilingof quinoa，kiwicha and ka?iwa on composition and availabilityofminerals in vitro[J].Journal ofthe Science ofFood&Agriculture，2010，90（12）：2068-2073.

［6］ PASKO P，BARTON H，ZAGRODZKI P，et al.Anthocyanins，total polyphenols and antioxidant activity in amaranth and quinoa seeds and sprouts during their growth[J].Food Chemistry，2009，115（3）：994-998.

［7］ ALVAREZ-JUBETE L，WIJNGAARD H，ARENDT E K，et al.Polyphenol composition and in vitro antioxidant activity of amaranth，quinoa，buckwheat and wheat as affected by sprouting and backing[J].Food Chemistry，2010，119（2）：770-778.

［8］HIROSE Y，F(xiàn)UJITAT，ISHILLT，et al.Antioxidative properties and flavonoid composition of Chenopodium quinoa seeds cultivated in Japan[J].Food Chemistry，2010，119（4）：1300-1306.

［9］湯容，樊瑞霞.大豆異黃酮抗癌作用的研究進展[J].中國藥學雜志，1999，34（7）：3-6.

［10］王文平，梁海玲，姚元華.木瓜提取物中總黃酮含量的測定[J].貴州醫(yī)藥，2005，29（6）：546-548.

［11］LAUS MN，GAGLIARDI A，SOCCIO M，et al.Antioxidant activity of free and bound compounds in quinoa（Chenopodium quinoa Willd.）seeds in comparison with durum wheat and emmer[J].J Food Sci，2012，77（11）：1150-1155.

［12］ ABUGOCH J L E.Quinoa（Chenopodium quinoa Willd.）：composition，chemistry，nutritional，and functional properties [J].Advances in Food and Nutrition Research，2009，58：1-31.

［13］GAWLIK-DZIKI U，MICHASWIECA，SUKOWSKI M，et al.Antioxidant and anticancer activities of Chenopodium quinoa leaves extracts-in vitro study [J]．Food and Chemical Toxicology，2013，57（6）：154.

［14］李化，于艷秋，楊濱.黃酮化合物與Fe（II）絡合反應的動力學研究[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（17）：99-100.

［15］李正言，翟延君，滕宇，等.不同商品柘木中槲皮素和山萘酚的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（9）：2186-2187.

［16］ NASCIMENTO A C，MOTA C，COELHO I，et al.Characterisation of nutrient profile of quinoa（Chenopodium quinoa），amaranth（A-maranthus caudatus）and purple corn （Zea mays L.）consumed in the north of Argentina:Proximates，minerals andtrace elements[J].Food Chemistry，2014，148（4）：420.

［17］GóMEZ-CARAVACA A M，SEGURA-CARRETERO A，F(xiàn)ERNáNDEZGUTIéRREZ A，et al.Simultaneous determination of phenolic compounds and saponins in quinoa（Chenopodium quinoa Willd）by a liquid chromatography-diode array detection-electrospray ionization-time-of-flight mass spectrometry methodology[J].J Agric Food Chem，2011，59（20）：10815-10825.

［18］ WOLDEMICHAEL G M，WINK M.Identification and biological activities of triterpenoid saponins from Chenopodium quinoa[J].J Agric Food Chem，2001，49（5）：2327-2332.

［19］ GóMEZ-CARAVACA A M，IAFELICE G，VERARDO V，et al.Influence of pearling process on phenolic and saponin content in quinoa（Chenopodium quinoa Willd）[J].Food Chem，2014，157：174-178．

［20］任卓偉，倪文杰，劉森.藜麥皂甙的測定研究[J].山西農業(yè)科學，2015，43（8）：932-935.

［21］陸敏佳，蔣玉蓉，陳國林，等.藜麥葉片黃酮類物質的提取及基因型差異[J].浙江農林大學學報，2014，31（4）：534-540.