李韓帥，周秒依 ，楊鳳玲，李 婷 ，白琪林 ，劉 亞

（1.山西大學生物工程學院，山西太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，山西太原 030031；3.北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心，北京 100097）

玉米作為世界上重要的糧食作物和工業(yè)原料之一，在解決糧食安全和資源短缺問題，以及促進國民經(jīng)濟發(fā)展等方面意義重大。FAO統(tǒng)計結(jié)果顯示，玉米產(chǎn)量自2001年以來正式超過水稻和小麥，成為世界上產(chǎn)量最大的作物[1]。自新中國成立以來，常規(guī)育種在玉米遺傳改良中發(fā)揮了重要作用，使得玉米產(chǎn)量至少增加了2倍[2]。隨著分子生物學的日漸成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)逐漸成為玉米品種改良的重要手段。1987年，GRIMSLEY等[3]選擇農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法，成功地用玉米條斑病毒的cDNA感染了玉米植株，首次證明農(nóng)桿菌侵染玉米的可行性；1988年RHODES等[4]首次用基因槍法獲得轉(zhuǎn)基因玉米完整植株；1996年ISHIDA等[5]用含超雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化自交系的幼胚，成功獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株，初步建立農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，在此轉(zhuǎn)化體系下，玉米的轉(zhuǎn)化率能夠達到5%～30%，這是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的一個重要突破。轉(zhuǎn)基因玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究已進入飛速發(fā)展時期。

目前，玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法有很多，包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法、PEG介導法、電激法和子房注射法等[6]。由于農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法具有研究機理相對清楚、外源基因能夠穩(wěn)定表達和遺傳、轉(zhuǎn)基因后代拷貝數(shù)少，且遺傳穩(wěn)定性好、成本低且操作簡單等優(yōu)勢[7]，目前該方法已在全世界范圍內(nèi)廣泛應用。農(nóng)桿菌介導玉米遺傳轉(zhuǎn)化的主要過程包括：農(nóng)桿菌侵染吸附受體幼胚、農(nóng)桿菌體內(nèi)Vir基因激活及T-DNA復合物的產(chǎn)生、T-DNA復合物整合進入植物細胞核的基因組中并表達外源基因[8-9]。影響農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的因素包括外植體的類型、幼胚的大小、農(nóng)桿菌濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間以及抗生素和篩選劑等，都是研究的熱點。其中，愈傷組織誘導和再生主要取決于玉米的基因型[10-11]。通過對離體幼胚的多年研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的玉米幼胚抵抗農(nóng)桿菌侵染的能力差異很大，這直接影響到玉米的轉(zhuǎn)化效率，而且絕大部分基因型的玉米轉(zhuǎn)化效率都不高。SCHALAPPI等[12]深入研究農(nóng)桿菌對玉米幼胚的親和性時發(fā)現(xiàn)，感受態(tài)細胞是整個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中不可或缺的。相比較而言，再生和整合能力強的感受態(tài)細胞更容易得到轉(zhuǎn)化植株。目前，玉米材料A188和HiⅡ取得了不錯的效果，但農(nóng)藝性狀較差。

在前期材料篩選的基礎(chǔ)上，本研究選擇其中遺傳轉(zhuǎn)化效率較高的材料Z21，針對遺傳轉(zhuǎn)化各個環(huán)節(jié)的影響條件進行進一步的優(yōu)化和完善，初步建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得轉(zhuǎn)基因材料，旨在為加快轉(zhuǎn)基因育種進程打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物材料 試驗所用幼胚取自大田種植的玉米材料Z21，根據(jù)氣溫變化情況，選取授粉后8～10 d、幼胚大小為0.5～2.0 mm的玉米幼穗。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 菌株選用農(nóng)桿菌EHA105，質(zhì)粒為pCAMBIA3301，攜帶GUS基因（圖1）。

1.1.3 培養(yǎng)基及成分 培養(yǎng)基及其成分列于表1。

表1 培養(yǎng)基及溶液組分

1.2 方法

1.2.1 活化菌株 從-20℃冰箱取出保存在甘油中的農(nóng)桿菌菌種，置于冰塊上，待甘油解凍，將接種環(huán)經(jīng)酒精燈灼燒片刻后蘸取菌液，在相應抗性YEP固體培養(yǎng)基上劃線，密封置于28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d。2 d后YEP固體培養(yǎng)基上會出現(xiàn)稀疏不同的菌落，選擇菌落稀少且不重疊的的區(qū)域挑取單菌落，接種于50 mL含抗生素（50 μL）的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)16～20 h。第2天將搖好的菌液離心后去上清，用Inf侵染培養(yǎng)基懸浮農(nóng)桿菌并調(diào)節(jié)其 OD600為 0.3，0.5，0.7，0.9，1.0，1.2，1.5 和 2.0。

1.2.2 幼胚遺傳轉(zhuǎn)化 取授粉10 d左右、幼胚大小為0.5～2.0 mm的玉米幼穗，除去苞葉，切除果穗頂端和基部1～2 cm，在次氯酸鈉溶液中加入0.1%Tween 20后浸泡幼穗，消毒滅菌20 min，每隔5 min左右上下攪動幾次，以消除籽粒表面的氣泡，從而達到最佳的消毒效果。消毒結(jié)束后用無菌水沖洗幼穗籽粒表面，在超凈工作臺內(nèi)進行剝胚操作，將所得幼胚置于含有1 mL Inf侵染培養(yǎng)液的1.5 mL EP管中待用。

用 OD600為 0.3，0.5，0.7，0.9，1.0，1.2，1.5 和 2.0的菌液分別侵染待用的幼胚，20℃條件下各自侵染15 min。

1.2.3 共培養(yǎng) 利用帶細槍頭的移液槍吸除農(nóng)桿菌懸浮液，將幼胚均勻轉(zhuǎn)移至Coc共培養(yǎng)基中，幼胚盾面朝上放置，間隔1 cm，隨后將Coc培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱中，24 ℃分別暗培養(yǎng) 1，2，3，4，5 d。

1.2.4 GUS染色鑒定 分別將共培養(yǎng)1～5 d后的部分幼胚用無菌水清洗干凈，放入含有1 mL GUS染色液的EP管中，置于37℃培養(yǎng)箱24 h。通過肉眼或者顯微鏡觀察統(tǒng)計帶有藍斑的幼胚數(shù)量，計算GUS染色瞬時表達率。

1.2.5 靜息培養(yǎng) 將共培養(yǎng)后的另一部分幼胚洗菌并用濾紙將幼胚周圍水分吸干，轉(zhuǎn)移到Res靜息培養(yǎng)基上面，同時用封口膜封住培養(yǎng)皿，28℃條件下暗培養(yǎng)4 d。

1.2.6 選擇階段 靜息培養(yǎng)后，將幼胚轉(zhuǎn)移至選擇Ⅰ培養(yǎng)基上，大約間隔1.5 cm。培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中28℃暗培養(yǎng)14 d，直至長出1～2 cm的Ⅱ型愈傷組織。統(tǒng)計數(shù)量計算Z21的Ⅱ型愈傷率。

將存活且松散的Ⅱ型愈傷組織塊平鋪至選擇Ⅱ培養(yǎng)基上，簡單分離每個愈傷組織塊，使其仍能保持完整性。隨后將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱的塑料盒中28℃暗培養(yǎng)14 d。再次統(tǒng)計數(shù)量計算Z21的Ⅱ型愈傷率。

每隔20 d將新長出的陽性愈傷繼代選擇培養(yǎng)一次。

1.2.7 再生階段 把選擇出來的Ⅱ型愈傷組織平鋪到再生Ⅰ培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上4個愈傷組織塊，26℃暗培養(yǎng)，直至長出不透明的體細胞胚或不定芽。將體細胞胚或者不定芽轉(zhuǎn)移到再生Ⅱ培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中只放置1個，26℃條件下按16h∶8 h光周期進行光照培養(yǎng)，直至長出約4 cm的綠芽。把綠芽轉(zhuǎn)到RⅢ生根培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)26℃條件下按16 h∶8 h光周期進行光照培養(yǎng)，待長出明顯的根芽為止。

1.2.8 幼苗的生長 將長出根芽的幼苗接到壯苗培養(yǎng)基（長試管）中，26℃條件下按16 h∶8 h光周期培養(yǎng)7～14 d。

1.2.9 轉(zhuǎn)化植株的檢測 取部分葉片，設(shè)計PCR檢測引物（F：GAAGGCACGCAACGCCTACGA；R：CCAGAAACCCACGTCATGCCA），用PCR等分子檢測手段檢測bar基因，通過bar基因的表達情況來驗證目的基因是否被成功導入玉米植株中，記錄陽性植株。等植株長至試管口處時，輕輕移出，室溫下沖洗掉附著在根部的殘余培養(yǎng)基，將植株完整轉(zhuǎn)移到含營養(yǎng)土的育苗紙盆中。取少量葉片，加入緩沖液后研磨，用試紙條進行轉(zhuǎn)基因檢測，進一步驗證所得的陽性植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼胚大小對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

由圖2可知，Z21在幼胚大小為1.5～2.0 mm時GUS瞬時表達率達到最大值，為63.5%，明顯高于其他3種幼胚。當換用不同濃度的菌液侵染幼胚時，≥1.5＜2.0 mm的幼胚的GUS瞬時表達率均處于最大值，且更易形成愈傷組織。通過對比發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)桿菌濃度逐漸增大的情況下，＜1 mm的幼胚率先大面積染菌，生長停滯甚至褐化死亡，即使存活下來的幼胚也很難形成愈傷組織；而≥2.0 mm的幼胚很容易直接萌發(fā)，其愈傷組織的誘導率隨著幼胚的長大逐漸降低，不利于轉(zhuǎn)基因幼苗的長成。

2.2 農(nóng)桿菌濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

用 OD600分 別 為 0.3，0.5，0.7，0.9，1.0，1.2，1.5和2.0的農(nóng)桿菌菌液侵染大小為1.5～2.0 mm的Z21幼胚15 min，24℃培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 d后進行GUS染色，統(tǒng)計染色數(shù)量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，Z21的GUS瞬時表達率隨農(nóng)桿菌濃度的增大呈先升后降的變化趨勢，其中，在OD600為0.9～1.2的范圍內(nèi)，Z21的GUS瞬時表達率達到峰值，且3個濃度間的瞬時表達率相差很小；雖然在OD600為1.5和2.0時也獲得了較高的GUS瞬時表達率，但在后續(xù)的多次篩選過程中，大量的Z21幼胚染菌死亡。說明高濃度的農(nóng)桿菌對幼胚傷害很大，且容易直接影響后期愈傷的生成。綜合各種因素考慮，最終選取OD600＝0.9～1.2為農(nóng)桿菌最適濃度。

2.3 共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

用OD600為0.9的農(nóng)桿菌菌液侵染1.5～2.0 mm的幼胚15 min，放置24℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1～5 d，進行GUS染色檢驗，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，當共培養(yǎng)1 d時，Z21的GUS瞬時表達率很低，隨著共培養(yǎng)天數(shù)的增加，相應的GUS瞬時表達率也隨之增加；當共培養(yǎng)3 d后，GUS瞬時表達率不再出現(xiàn)顯著的變化。共培養(yǎng)時間的長短能夠直接影響農(nóng)桿菌對幼胚的吸附能力以及T-DNA的轉(zhuǎn)移情況。時間過短會導致吸附的農(nóng)桿菌量少，T-DNA轉(zhuǎn)移過程不能全部完成；而時間過長也不利于農(nóng)桿菌的有效控制，容易出現(xiàn)幼胚褐化和水漬化等問題，影響愈傷組織的生成和分化，從而不能再生出完整植株。綜合來看，共培養(yǎng)3 d是農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的最佳選擇。

2.4 培養(yǎng)基成分對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

2.4.1 基礎(chǔ)鹽對轉(zhuǎn)化效率的影響 影響玉米幼胚愈傷組織誘導的因素很多，其中，培養(yǎng)基的合理選擇是組織培養(yǎng)過程成功的必要條件。本試驗分別選用了MS鹽和N6鹽培養(yǎng)基，最終均穩(wěn)定并成功地培育出了所要的轉(zhuǎn)基因幼苗，且長勢良好。而N6鹽誘導產(chǎn)生的愈傷組織分化再生過程相對較快，更符合試驗需求。所以，在接下來的試驗中均選用N6鹽培養(yǎng)基。

2.4.2 抗生素對轉(zhuǎn)化效率的影響 抗生素是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質(zhì)。本試驗在組織培養(yǎng)過程中選擇培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基中加入100 mg/L的特美汀，能夠在一定程度上抑制殘余農(nóng)桿菌對幼胚和愈傷組織的傷害，提高Ⅱ型愈傷率。

“育人”主要反映教師的管理工作尤其是學生管理工作取得的業(yè)績。有關(guān)評價要素包括：管理工作年限；在師德和管理方面獲得的表彰；育人管理方面的研究成果；指導學生取得的成績。其中，除了“管理工作年限”的認可度為中等外，其他評價要素的認可度均為高。

2.5 抗性愈傷組織的獲得率

根據(jù)研究轉(zhuǎn)化效率的影響因素，選擇幼胚大小1.5～2.0 mm，農(nóng)桿菌菌液OD600處于0.9～1.2，20℃侵染15 min，共培養(yǎng)3 d，選擇抗生素特美汀為優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件進行玉米Z21的遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，在第1次選擇培養(yǎng)階段（SⅠ），共有745個愈傷，符合要求的抗性愈傷431個，抗性愈傷率達57.8%；在第2次選擇培養(yǎng)階段（SⅡ），獲得145個抗性愈傷組織，抗性愈傷獲得率為19.5%。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株檢測

對再生出來的玉米植株提取植株葉片DNA，PCR檢測bar基因，結(jié)果如圖5所示，陽性對照出現(xiàn)明亮的條帶，陰性對照無條帶，1～7號符合預期的檢測結(jié)果。且在后續(xù)的試紙條檢測中，1～7號均出現(xiàn)了明顯的檢測線，可以初步判定，1～7號為轉(zhuǎn)基因植株。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

整個試驗中還存在一些缺陷，例如在試管中培養(yǎng)的組培苗轉(zhuǎn)移到育苗盆后，長勢很弱，幼苗容易斷根枯死，其成活率顯著下降。所以，在玉米苗期需要加強對幼苗的監(jiān)管，保證充足的水分、養(yǎng)分和光照供給。

3.1.1 培養(yǎng)基成分對誘導愈傷組織的影響 目前，玉米組織培養(yǎng)體系中按照培養(yǎng)基所含成分不同大體劃分為N6，MS和B5培養(yǎng)基。ISHIDA等[18]成功地選用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因植株；李世潤等[19]研究認為，相較N6而言，MS更容易作用在胚性愈傷組織的誘導和分化方面；王宏偉等研究發(fā)現(xiàn)，用MS培養(yǎng)基培育出的愈傷組織質(zhì)量相對優(yōu)于N6培育出的愈傷組織。但是也有研究表明，在組織誘導過程中MS鹽容易產(chǎn)生Ⅰ型愈傷組織，N6鹽更利于產(chǎn)生Ⅱ型愈傷組織[20-21]，而Ⅱ型愈傷組織結(jié)構(gòu)松脆，生長旺盛，色澤鮮艷且增殖很快，符合優(yōu)良標準的愈傷組織。

3.1.2 殘余農(nóng)桿菌對幼胚的傷害及影響 在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化中，共培養(yǎng)后在幼胚的表面和淺層組織中會殘留大量的農(nóng)桿菌，可能會對幼胚產(chǎn)生額外的傷害，褐化、水漬化甚至死亡，嚴重影響組織培養(yǎng)的過程，所以需要選擇合適的抗生素來抑制農(nóng)桿菌的生長。目前，使用較多的是頭孢菌素類和青霉素類，但不同的材料和組織對抗生素的敏感程度不同。本試驗選用的特美汀雖然在一定程度上取得了很好的抑菌效果，但部分幼胚仍會出現(xiàn)染菌死亡的情況，較大程度地降低了遺傳轉(zhuǎn)化率。

3.2 結(jié)論

本研究通過對玉米材料Z21的幼胚進行農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化，在幼胚大小、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間以及抗生素等方面進行深入地探索，初步建立了適用于Z21的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系。以GUS染色瞬時表達率為依據(jù)，對影響農(nóng)桿菌介導的主要因素采取控制單一變量的方法，不斷改變變量的大小進行試驗對比探究。本試驗研究表明，在幼胚大小為1.5～2.0 mm，農(nóng)桿菌菌液OD600處于0.9～1.2，20℃侵染15 min，共培養(yǎng)3 d，選擇合適的抗生素（特美?。┑葪l件下，Z21的GUS染色瞬時表達率均達到最高值，且在后續(xù)的組織培養(yǎng)過程中，愈傷組織的形成和再分化表現(xiàn)良好，能夠穩(wěn)定地長出轉(zhuǎn)基因幼苗，證明此遺傳轉(zhuǎn)化系適用于玉米自交系Z21，符合實際需要。通過該體系可以將抗蟲、抗除草劑、抗旱等有益外源基因?qū)胗衩鬃越幌担S富轉(zhuǎn)基因種質(zhì)資源。

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