程宇坤 ，白建榮 ，2，李 銳 ，侯流沙 ，姚仙玲

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原 030031；3.山西省農(nóng)業(yè)種子總站，山西太原 030006）

玉米雜交種的遺傳變異信息是選育品種的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。玉米雜交種的遺傳多樣性可從已審定的雜交種和雜交種親本的遺傳多樣性2個(gè)方面開展研究。通過親本來評(píng)價(jià)雜交種的遺傳多樣性已有很多報(bào)道[1-7]。近年來也開始重視直接對(duì)雜交種進(jìn)行遺傳多樣性的分析[8-17]。審定品種代表了當(dāng)前玉米育種的動(dòng)向和水平，因此，在不便對(duì)親本自交系進(jìn)行直接研究和系譜分析的情況下，深入分析審定玉米雜交種的遺傳多樣性及其變化趨勢，可以從整體上客觀地掌握當(dāng)前玉米育種現(xiàn)狀和種質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)于育種家進(jìn)一步拓寬品種遺傳基礎(chǔ)、及時(shí)調(diào)整育種策略具有重要意義。

玉米是山西省的重要作物，全省70%以上的糧食產(chǎn)量來自于玉米。山西省獨(dú)特的地理位置和生態(tài)環(huán)境的多樣性，幾乎全國的玉米品種在山西都可以種植，而且在山西選育的品種也可以在其他省份找到合適的種植區(qū)域。近年來，山西省培育了許多優(yōu)良玉米自交系和雜交種，同時(shí)，許多其他省份的品種在山西省經(jīng)區(qū)域試驗(yàn)通過了品種審定，這些品種的交流對(duì)全國玉米育種的發(fā)展產(chǎn)生了積極的影響。目前，山西省審定玉米品種的遺傳多樣性尚未見報(bào)道。利用SSR分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性是目前較為可靠而且普遍采用的方法[11-12]。

本研究利用SSR技術(shù)對(duì)山西省86個(gè)玉米審定品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，研究結(jié)果將有利于育種家熟悉山西省玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)，挖掘、利用與保存該地區(qū)特異種質(zhì)資源，制定更加合理的育種策略。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

山西省審定玉米品種101份，絕大部分為2000—2009年審定的品種，少部分為2000年前審定且大面積推廣、經(jīng)濟(jì)效益好的品種。其中，51份由山西省農(nóng)業(yè)種子總站提供，其余50份從山西省不同的育種單位收集得來。經(jīng)純度檢測后確定86份材料為試驗(yàn)材料（表1）。

表1 試驗(yàn)材料

續(xù)表1

1.2 DNA模板制備

每份材料取10株，單株提取DNA。經(jīng)濃度和質(zhì)量檢測后，將DNA樣品稀釋至20 ng/μL，低溫保存。

1.3 引物選擇

以中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T1432—2007《玉米品種鑒定DNA指紋方法》）的20對(duì)核心引物為基本核心引物；另外增加了近年來山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所分子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室篩選出符合指紋圖譜構(gòu)建的28對(duì)引物。引物信息列于表2。

擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD公司的C1000上完成。PCR反應(yīng)體系為20μL，其中，1×PCRBuffer，25mmol/L Mg2+2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.1 μL，10 μmol/L SSR引物 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 U，DNA模板 80 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性 1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺變性凝膠中進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)硝酸銀染色法染色并室溫干燥，在白熾燈下觀察電泳結(jié)果，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和掃描照相。

1.4 一致性檢測

用2007年國家農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定DNA指紋方法》規(guī)定的20對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物對(duì)5株供試材料進(jìn)行一致性檢測。將每一份材料3株以上在某一位點(diǎn)都有的帶型作為該位點(diǎn)該材料的代表帶型。如20對(duì)引物在每一份材料都能找到代表帶型的單株，則將這些株的DNA混合作為這份材料的模板DNA。如用5株不能確定某個(gè)引物的帶型，則要擴(kuò)大到10株。如果在某份材料不能找到20對(duì)引物都有確定帶型的單株，則這份材料沒有代表株。本研究以代表株的帶型作為統(tǒng)計(jì)帶型。

表2 SSR引物在審定玉米品種中的等位變異及多態(tài)信息量

1.5 數(shù)據(jù)分析

以0，1和9形式統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增帶型，在相同遷移位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9，建立數(shù)據(jù)庫。

其中，Ni為i品種出現(xiàn)的譜帶數(shù)，Nj為j品種出現(xiàn)的譜帶數(shù)，Nij為i，j品種共有的譜帶數(shù)。

多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC）按公式計(jì)算，其中，fi為第i個(gè)等位基因出現(xiàn)的頻率。

采用NTSYS-PC2.02軟件的不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法（Unweighted pair group method rithmetic averages，UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

特有等位變異是指該等位變異只在一個(gè)檢測材料中出現(xiàn)；稀有等位變異是指該等位變異的頻率小于5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記檢測結(jié)果

首先選用覆蓋玉米全基因組的20對(duì)SSR核心引物（P1～P20，每個(gè)染色體臂1對(duì)）對(duì)101份玉米品種進(jìn)行一致性檢測，由于P3和P6的擴(kuò)增效果不理想，只取了18對(duì)SSR引物的結(jié)果，有86份材料能夠找出該材料的代表株。將這些代表株的DNA等量混合作為每一份材料的模板。然后用46對(duì)SSR引物對(duì)86份玉米品種擴(kuò)增并進(jìn)行電泳分析（圖1，2）。從表2可以看出，選用的SSR引物在所有的供試材料中都有多態(tài)性，共檢測出307個(gè)等位變異，每對(duì)引物檢測出的等位變異為3～11個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)6.67個(gè)，檢測到等位變異最多（11個(gè)）的位點(diǎn)是mmc0191。所有位點(diǎn)的平均PIC為0.71，變幅為0.25～0.86。

2.2 品種中檢測到的稀有和特有等位基因

在86個(gè)雜交種中，稀有等位變異是等位變異數(shù)為2～4個(gè)的等位變異，特有等位變異是等位變異數(shù)為1的等位變異（表3）。從表3可以看出，其中55個(gè)品種出現(xiàn)稀有等位變異，共計(jì)86個(gè)，有17個(gè)品種的稀有等位變異數(shù)為2個(gè)，4個(gè)品種為3個(gè)，2個(gè)品種（屯玉10341和大豐2號(hào)）為4個(gè)。15個(gè)品種發(fā)現(xiàn)特有等位變異，共計(jì)18個(gè)，其中，晉鮮糯6號(hào)、晉糯8號(hào)和屯玉60各有2個(gè)特有等位變異。

表3 不同審定玉米品種中檢測出的稀有和特有等位變異

續(xù)表3

2.3 聚類分析結(jié)果

依據(jù)46個(gè)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，應(yīng)用UPGMA對(duì)86份雜交種進(jìn)行了聚類分析（圖3），各品種間的遺傳相似系數(shù)為0.71～0.96。以0.74為閾值，86個(gè)品種大體劃分為7類群：最大的一類群為Ⅲ群，包含有48個(gè)品種；Ⅶ群只有大豐1號(hào)和大豐2號(hào)；Ⅳ群有屯玉的8個(gè)品種；Ⅰ群中有9個(gè)品種，其中，5個(gè)是利馬格蘭種業(yè)的品種；屯玉青貯50、屯玉68和安森7號(hào)形成了Ⅵ群；Ⅱ群和Ⅴ群分別有11，5個(gè)品種。

3 討論

利用SSR分子標(biāo)記來研究玉米種質(zhì)遺傳多樣性是目前較為可靠而且普遍采用的方法。在這類研究中，提取DNA的方法既有混合取樣[7，10]，也有單株取樣[6]，還有將每個(gè)品種隨機(jī)取20粒種子，以16～19對(duì)SSR引物進(jìn)行一致性分析，將有代表性的5粒種子DNA混合建立該品種的DNA指紋圖譜及遺傳多樣性分析[8]。玉米為二倍體作物，理論上，雜交種在每個(gè)SSR位點(diǎn)的帶型或?yàn)?條、或?yàn)?條。山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所分子設(shè)計(jì)育種實(shí)驗(yàn)室科研人員在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，混合取樣后在SSR分析時(shí)有些位點(diǎn)在某些材料產(chǎn)生的帶型則為3條，如果這種情況發(fā)生在多個(gè)位點(diǎn)及多個(gè)材料，這樣的結(jié)果不準(zhǔn)確，可能在自交系繁育時(shí)也可能在雜交時(shí)混入了其他花粉所至。單粒取樣作為供試材料的代表，所取材料也有可能無法代表供試材料。雖然以20粒種子和19對(duì)引物作一致性檢測的方法比較準(zhǔn)確，但是大大增加了工作量。本研究首先采用一致性檢測，選出代表植株的方法，這樣既保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，也減少了工作量。

所有供試品種之間的遺傳相似性系數(shù)＞0.70，有些超過了0.85，有極個(gè)別的甚至超過了0.9。這表明山西省審定玉米品種之間的親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)趨同化。值得注意的是，1/2以上的品種（48個(gè)）聚為一類，山西省的各育種單位在此類里都有品種，說明各育種單位有些育種思路相似，育種材料也有可能互相交流。同時(shí)也反映了大量使用具有某些優(yōu)良性狀的遺傳材料育成的新品種大幅度增加，造成了生產(chǎn)上品種遺傳基礎(chǔ)趨于單一化。但是，有些種業(yè)公司的品種有自己的特色，如大豐種業(yè)、利馬格蘭種業(yè)和屯玉種業(yè)，其品種獨(dú)立聚群。

本研究還發(fā)現(xiàn)，來源于同一育種單位選育出的品種優(yōu)先聚為一類，一方面這些品種共同使用一個(gè)親本，如Ⅶ群中大豐1號(hào)和大豐2號(hào)；另一方面，親本是來源相近的姊妹系，如Ⅳ群中屯玉的8個(gè)品種，Ⅰ群中利馬格蘭種業(yè)的品種。這表明，育種單位創(chuàng)新的優(yōu)良自交系少，改良與重復(fù)利用的較多。

稀有等位變異和特有等位變異從另一個(gè)方面反映了供試材料的異質(zhì)性。本研究檢測到55個(gè)（63%）品種中都有數(shù)目不等的稀有等位變異，其中，屯玉10341和大豐2號(hào)有4個(gè)稀有等位變異。這說明，近年來山西省各育種單位，特別是各種業(yè)公司注重引進(jìn)和利用外源種質(zhì)。15個(gè)品種有特有等位變異（特征引物帶），其中，屯玉60和晉鮮糯6號(hào)有2個(gè)特有等位變異，這些可作為鑒定這些品種的標(biāo)簽，同時(shí)暗示含有這些特有等位變異的親本自交系可能蘊(yùn)涵著獨(dú)特的重要優(yōu)良基因，需進(jìn)一步深入、細(xì)致地研究，使其成為培育新的優(yōu)良骨干自交系的材料來源。

參考文獻(xiàn)：

［1］李新海，傅駿驊，張世煌，等.利用SSR標(biāo)記研究玉米自交系的遺傳變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（2）：1-9.

［2］XIE C，ZHANG S，LI M，et al.Inferring genome ancestry and estimatingmolecular relatedness among187 Chinese maize inbred lines[J].Journal ofGenetics and Genomics，2007，34（8）：738-748.

［3］肖木輯，李明順，李新海，等.黃淮海地區(qū)主要玉米自交系的SSR遺傳多樣性分析[J].玉米科學(xué)，2008，16（2）：1-7.

［4］聶永心，張麗，潘光堂，等.四川省常用玉米自交系SSR遺傳多樣性分析[J].分子植物育種，2005，3（1）：43-51.

［5］李銳，白建榮，張叢卓，等.山西中晚熟玉米區(qū)玉米自交系的遺傳多樣性及雜種優(yōu)勢群分析 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：311-316.

［6］趙文博，白建榮，王陸軍，等.山西省主推玉米品種自交系的SSR遺傳多樣性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：19-22.

［7］石海春，袁昊，李東波，等.82份玉米自交系遺傳多樣性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29（6）：84-93.

［8］李俊芳，孫世賢，王守才.國家玉米主產(chǎn)區(qū)預(yù)試品種的SSR分析Ⅱ.預(yù)試品種的遺傳多樣性[J].玉米科學(xué)，2007，15（1）：16-20.

［9］葛建镕，劉曉鑫，易紅梅，等.吉林省42份主推玉米雜交種的遺傳分析[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2008，28（5）：37-42.

［10］高玉倩，田紅麗，王鳳格，等.吉林省玉米新品種SSR標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及其分析[J].玉米科學(xué)，2012，20（3）：43-47.

［11］朱志成.不同玉米品種SSR遺傳多樣性分析的研究[J].種子世界，2013（8）：30-31.

［12］劉云婷，張秋蘭，王倩，等.河北省玉米種子質(zhì)量評(píng)價(jià)及遺傳多樣性分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（4）：8-12.

［13］高永鋼，高軍，賈晉，等.內(nèi)蒙古地區(qū)主要推廣玉米品種遺傳多樣性研究[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（1）：78-81.

［14］吳毅歆，劉春明，毛自朝，等.云南省222個(gè)玉米新品種DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析 [J].分子植物育種，2012，10（28）：1199-1205.

［15］王鳳格，田紅麗，趙久然，等.中國328個(gè)玉米品種（組合）SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（5）：856-864.

［16］趙久然，王鳳格，郭景倫，等.中國玉米新品種指紋庫建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的核心引物的確定[J].玉米科學(xué)，2003，11（2）：3-5.

［17］WANG F G，TIAN H L，ZHAO J R，et al.Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis ofChinese maize varieties[J].Maydica，2011，56（1）：7-17.