湯滌洛，涂修亮，潘國雄，熊 偉，汪紅武

(1.咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北省苧麻工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100)

【研究意義】微生物是地球上多樣性最高的生命形式[1]，幾乎分布到地球上的所有生境[2]，土壤中微生物數(shù)量龐大是最豐富的微生物資源庫[3]，而細(xì)菌是土壤中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的微生物類群[4]，占有絕對(duì)優(yōu)勢[5-6]。土壤細(xì)菌廣泛參與土壤有機(jī)質(zhì)積累，參與土壤中大多數(shù)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[7-8]，所以土壤細(xì)菌被作為評(píng)估土壤環(huán)境變化的指示型標(biāo)志[9]，與土壤理化性質(zhì)、土壤深度等諸多因素有關(guān)[10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的土壤微生物培養(yǎng)方法存在著耗時(shí)、工作量大的缺點(diǎn)，并且大多數(shù)土壤微生物是不可培養(yǎng)的，從而導(dǎo)致無法全面了解土壤微生物信息[11]。Illumina高通量測序技術(shù)為人們認(rèn)識(shí)土壤微生物多樣性提供了新的契機(jī)。Illumina測序技術(shù)不僅具有低成本、高通量和低錯(cuò)誤率的優(yōu)點(diǎn)[12]，還能夠快速、簡單、較準(zhǔn)確地獲取土壤微生物信息。【本研究切入點(diǎn)】本研究使用Illumina測序技術(shù)開展了不同根型苧麻土壤根際微生物多樣性研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討苧麻根際土壤細(xì)菌與土壤養(yǎng)分的關(guān)系，不同根型苧麻土壤細(xì)菌多樣性，不同根型苧麻土壤細(xì)菌在不同分類水平的優(yōu)勢類群、各類群相對(duì)豐度。為苧麻土壤微生物研究、土壤細(xì)菌與苧麻生產(chǎn)性狀相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年1-12月在咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院崇陽縣白霓鎮(zhèn)山坡地示范基地進(jìn)行。

供試苧麻品種分別為湖南中科院麻類研究所的深根型湘苧三號(hào)，湖北華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的中根型華苧四號(hào)，湖南張家界的淺根型黃殼麻。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)區(qū)3個(gè)處理分別(深根型湘苧三號(hào)、淺根型黃殼麻、中根型華苧四號(hào))采用隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)，其投影面積85 m2(17 m×5 m)，種苗全部采用統(tǒng)一繁殖的嫩梢扦插苗，2012年4月移栽。苧麻山坡地管理采用苧麻栽培一般管理方法執(zhí)行。2016年采集不同品種苧麻根際土壤，每個(gè)小區(qū)多點(diǎn)取樣充分混勻，每份土樣分為2份，1份測土壤理化性質(zhì)，1份用于分子生物學(xué)研究。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 土壤成分的測定 土壤理化性質(zhì)試驗(yàn)于2016年三麻測產(chǎn)后分別取 0～20 cm土層混合土樣進(jìn)行分析，分析方法為: 土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀-氧化還原滴定外加熱法；土壤速效磷采用 NaHCO3浸提-鉬銻抗吸光光度法；土壤速效氮含量用堿解堿解擴(kuò)散法；土壤速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定；pH值用酸度劑測定法進(jìn)行測定。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取及細(xì)菌的高通量測序 采用MOBIO公司的強(qiáng)力土壤 DNA 提取試劑盒提取土壤微生物基因組DNA。所提取的土壤總 DNA 濃度和純度經(jīng)過核酸定量儀(NanoDrop ND-1000)檢測并純化后送至上海歐易生物公司進(jìn)行測序。其測序步驟如下：根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物，KAPA 公司的 HiFi Hot Start Ready Mix 高保真酶進(jìn)行 PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。細(xì)菌多樣性鑒定對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V3-V4 區(qū)，采用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')PCR 產(chǎn)物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪 PCR 模板，并進(jìn)行二輪 PCR 擴(kuò)增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 Qubit 定量。根據(jù) PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并上機(jī)測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

使用 Trimmomatic 軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜。去雜后的雙端序列利用 FLASH 軟件進(jìn)行拼接。同時(shí)，利用 usearch 檢測并去除序列中的嵌合體序列。

測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用 UPARSE 軟件，序列相似度大于或等于 97 %，將序列歸1個(gè)OTU(Operational taxonomic units)。使用 QIIME 軟件包挑選出各個(gè) OTU 的代表序列并統(tǒng)計(jì)每個(gè)OTU中的豐度信息。利用 QIIME 軟件計(jì)算Chao1指數(shù)[13]、Shannon指數(shù)[14]和 Simpson 指數(shù)[15]。通過 SPSS 17.0[16]軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根型苧麻種植地土肥狀況

從表 1 可知，不同根型苧麻種植山坡地土壤的有機(jī)質(zhì)、速效氮有顯著性差，且中根型(B)最低。但是中根型(B)速效磷含量在3個(gè)品種是最高，并達(dá)到顯著性差異。速效鉀含量深根型(A)最高，有機(jī)碳淺根型(C)最高，pH值相差不大。

表1 不同根型苧麻種植山坡地土壤養(yǎng)分比較

注：數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同字母表示差異顯著(α=0.05)。下同。

Note: Data in the table are mean±SE. Different small letters in the same row mean significant difference at 0.05 level among treatments.

表2不同處理土壤細(xì)菌序列讀數(shù)(reads)及OTUs數(shù)

Table 2 Reads and OTUs numbers of soil bacteria sequences in the different treatments

處理Treatment序列讀數(shù)ValidreadsOTUs數(shù)OUTs_counts深根型(A)28001±5311a2793±192a中根型(B)28416±4115a2473±153ab淺根型(C)28046±6452a2255±99b

2.2 土壤樣品測序

2.2.1 測序 通過測序?qū)?個(gè)樣品中原始序列過濾掉低質(zhì)量的序列后再拼接得到有效序列總數(shù)為278 279，根據(jù)Barcode標(biāo)簽進(jìn)行樣品序列拆分，在對(duì)初始序列進(jìn)行去冗余處理后獲得257 100條Reads，然后在97 %相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU并統(tǒng)計(jì)，得出9個(gè)樣品共產(chǎn)生24 268個(gè)OTUs，測序讀長在 139～543 bp，平均測序長度在420 bp左右。每個(gè)處理的序列讀數(shù)數(shù)量如表2 所示。深根型(A)處理土壤含有最多數(shù)量的OTUs，其次是中根型(B)處理, 淺根型(C)處理OTUs數(shù)量最少。與深根型(A)相比，淺根型(C)處理土壤OUTs數(shù)量減少19.26 %，中根型(B)處理減少14.79 %。

2.2.2 OUT統(tǒng)計(jì)的圖形化展示 Venn 圖可直觀地表現(xiàn)出不同處理間 OTU的重疊情況[11]，而不同 OTU 代表不同物種，所以共有的OTU越多表示共有的細(xì)菌類群越多。從圖1可以看出，不同處理之間共有的細(xì)菌 OTU 數(shù)目為459 個(gè)。深根型(A)與中根型(B)共有OTU 數(shù)目最多623個(gè)，其次深根型(A)與淺根型(C)OTU 數(shù)目614個(gè)，中根型(B)與淺根型(C)OTU 數(shù)目522個(gè)。說明深根型(A)與中根型(B)共有的細(xì)菌類群最多(圖1)。

圖1 不同處理土壤細(xì)菌Venn圖Fig.1 Venn diagrams of soil bacterial in the different treatments

2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性指數(shù)包括Observed Species、Shannon 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Goods Coverage、Simpson 指數(shù)等。Good’s Coverage(Good’s nonparametic Coverage Estimator)指數(shù)用來反映測序深度，首先由 Warren[17]提出；Observed Species 由樣品序列來表征觀測物種的多樣性指數(shù)；Chao指數(shù)用來估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，其計(jì)算方法參見文獻(xiàn)[13]； Shannon指數(shù)反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高；Simpson指數(shù)反映了物種的優(yōu)勢度。本研究在97 %相似度下，選取平均序列為25 010條的序列計(jì)算多樣性指數(shù)(表3)。

表3 不同處理土壤細(xì)菌豐富度及多樣性指數(shù)

表4 土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)與土壤理化因子的相關(guān)性分析

注：*：顯著相關(guān)(P<0.05)；**：極顯著相關(guān)(P<0.01)。

Note:*:Significant level at 0.05 level; **:Significant level at 0.01 level.

3個(gè)處理中Good’s Coverage指數(shù)大于0.930接近1，表明測序深度基本已經(jīng)覆蓋樣品中所有的物種。并且深根型(A處理)Observed species顯著高于其他2個(gè)處理12.31 %，18.52 %。深根型(A處理)Chao 指數(shù)顯著高于淺根型(C處理)13.86 %，與中根型(B)差異不顯著。深根型(C處理)Shannon指數(shù)顯著高于中根型(B)，與淺根型(C處理)差異不顯著。3個(gè)處理間的Simpson 指數(shù)差異不明顯。Observed species指數(shù)、Chao 指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)總體上呈現(xiàn)深根型(A處理)高于其他2個(gè)處理，說明深根型處理土壤細(xì)菌種群豐富度、土壤細(xì)菌優(yōu)勢度高于其他2種處理。

2.3.2 細(xì)菌多樣性與土壤理化因子的相關(guān)性分析 由表4可知，Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系，與速效磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Chao 指數(shù)與有機(jī)碳、pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)質(zhì)、速效氮呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，于速效磷、速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系?？傮w來看，土壤細(xì)菌多樣指數(shù)與有機(jī)碳、pH值相關(guān)性較高，與速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4 樣品群落組成分析

2.4.1 細(xì)菌門分類水平的比較 在門分類水平上，3種不同根型苧麻根際土壤細(xì)菌分布在23個(gè)已知細(xì)菌門，1個(gè)未分類群體。由圖2可知，在3個(gè)處理中含量最高的門是擬桿菌門(Bacteroidetes)，其深根型(A)、中根型(B)、淺根型(C)相對(duì)豐度依次為(平均數(shù)47.39)48.59 %、47.24 %、46.34 %；其次是厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度依次為(平均數(shù)36.57)36.18 %、36.84 %、 36.68 %；變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度依次為(平均數(shù)11.45)10.80 %、11.24 %、12.31 %；而其他菌類比例相對(duì)較低，例如放線菌門Actinobacteria，梭桿菌門Fusobacteria，綠菌門Chlorobi等。表明在3 種不同根型苧麻根際土壤細(xì)菌中，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門為三大優(yōu)勢菌群(相對(duì)豐度>10 %)，三者豐度之和達(dá)到95 %以上，而其他細(xì)菌類群為非優(yōu)勢菌群。

圖2 細(xì)菌群落門組成Fig.2 Composition of soil bacteria at phylum level

2.4.2 細(xì)菌綱分類水平的比較 在綱的分類水平上,共得到40 個(gè)已知的細(xì)菌綱。如圖3所示，擬桿菌綱(Bacteroidia)，梭菌綱(Clostridia)，芽孢桿菌綱(Bacilli)，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)，ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)，B-變形菌綱(Betaproteobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)類群等在細(xì)菌綱中相對(duì)豐度較大，相對(duì)豐度之和在 3 個(gè)處理土壤樣品中均占到土壤細(xì)菌總量的 80 %以上。相對(duì)豐度>10 %的優(yōu)勢綱為擬桿菌綱(Bacteroidia)，梭菌綱 (Clostridia)，芽孢桿菌綱(Bacilli)；除極少數(shù)相對(duì)豐度極低的細(xì)菌綱,如熱原體綱(Thermoplasmata)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira)、迷蹤菌綱(Elusimicrobia)等在3個(gè)處理 中的分布有所差異,其余已知豐度高的優(yōu)勢細(xì)菌綱在 3 個(gè)不同根型處理中均有分布。

圖3 細(xì)菌群落綱組成Fig.3 Composition of soil bacteria at class level

圖4 細(xì)菌群落屬組成Fig.4 Composition of soil bacteria at genus level

2.4.3 細(xì)菌屬分類水平的比較 在屬分類水平上共得到289種細(xì)菌類群，優(yōu)勢屬(相對(duì)豐度>1 %)有18個(gè)，如圖4所示，其中含量最高的是Other，在3個(gè)處理中相對(duì)豐度分別為21.19 %，24.86 %，22.13 %；其次是不可培養(yǎng)細(xì)菌(uncultured bacterium)，不可培養(yǎng)的擬桿菌屬(unculturedBacteroidalesbacterium)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，含糊不清的分類群(Ambiguous taxa)，毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae NK4A136 group)，普雷沃氏菌屬9組(Prevotella 9)，不可培養(yǎng)菌屬(uncultured)，擬桿菌屬等(Bacteroides)，擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)。

3 討 論

本研究利用 Illumina MiSeq 測序技術(shù)通過對(duì)16S rRNA 基因的 V3～V4 高變區(qū)的測序分析，成功檢測了不同根型苧麻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，獲得了較全面的菌群信息。得到有效序列的總數(shù)為278 279，257 100條讀數(shù)(reads)，30 664個(gè)OTUs。測序讀長在 139～543 bp 之間，平均測序長度在420 bp左右。深根型(A)處理土壤含有最多數(shù)量的OTUs,其次是中根型(B)處理, 淺根型(C)處理OTUs數(shù)量最少。與深根型(A)相比,淺根型(C)處理土壤OTUs數(shù)量減少17.70 %,中根型(B)處理減少10.85 %。

Venn 圖表明不同處理之間共有的細(xì)菌 OTU 數(shù)目為459 個(gè)。深根型(A)與中根型(B)共有OTU 數(shù)目最多623個(gè)，其次深根型(A)與淺根型(C)OTU 數(shù)目614個(gè)，中根型(B)與淺根型(C)OTU 數(shù)目522個(gè)。說明深根型(A)與中根型(B)共有的細(xì)菌類群最多。

王伏偉、楊娟等[18-19]的研究表明土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落組成有顯著的影響。本文Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)與PH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系，與速效磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Chao 指數(shù)與有機(jī)碳、pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)質(zhì)、速效氮呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，于速效磷、速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系?？傮w來看，土壤細(xì)菌多樣指數(shù)與有機(jī)碳、pH值相關(guān)性較高，與速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系。

樣品群落組成分析表明每個(gè)處理的土壤根際細(xì)菌優(yōu)勢門(相對(duì)豐度>10 %)、優(yōu)勢綱(相對(duì)豐度>10 %)、優(yōu)勢屬(相對(duì)豐度>1 %)基本相同。土壤細(xì)菌優(yōu)勢門(相對(duì)豐度>10 %)擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和 變形菌門(Proteobacteria)；優(yōu)勢綱(相對(duì)豐度>10 %)擬桿菌綱(Bacteroidia)，梭菌綱 (Clostridia)，芽孢桿菌綱(Bacilli)；優(yōu)勢屬(相對(duì)豐度>1 %)有18個(gè)。

本研究還發(fā)現(xiàn)苧麻根際土壤細(xì)菌中還有很多未分類物種，但其功能和特點(diǎn)尚不清楚，有待更深入的研究探索。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fierer N，Jackson R B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA，2006，103: 626-631.

[2]郭良棟．中國微生物物種多樣性研究進(jìn)展[J]．生物多樣性，2012，20(5)：572-580．

[3]蔡晨秋，唐 麗，龍春林． 土壤微生物多樣性及其研究方法綜述[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(28)：17274-17276．

[4]周德慶． 微生物學(xué)教程[M]． 北京：高等教育出版社，1993：281-282．

評(píng)估城市綜合災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)，首先要根據(jù)城市災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)的可接受程度，對(duì)城市災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)的等級(jí)進(jìn)行劃分，構(gòu)建城市綜合災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)語集。具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

[5]顧峰雪，文啟凱，潘伯榮，等．塔克拉瑪干沙漠腹地人工植被下土壤微生物的初步研究[J]. 生物多樣性，2000(8)： 297-303.

[6]趙先麗，周廣勝，周 莉，等．盤錦蘆葦濕地土壤微生物特征分析[J]. 氣象與環(huán)境學(xué)報(bào)，2006，22(4)：64-67．

[7]吳建峰，林先貴．土壤微生物在促進(jìn)植物生長方面的作用J]．土壤，2003，35(1)：18-21．

[8]陳國華，弭寶彬，李 瑩，等．轉(zhuǎn) mapk 雙鏈 RNA 干擾表達(dá)載體黃瓜對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33(4)：1091-1097．

[9]Nacke H， Thürmer A， Wollherr A， et al．Pyrosequenc-ing-based assessment of bacterial community structure along different management types in German forest and grassland soils[J].PLoS ONE，2011(6): 0-17.

[10]Sharma S K，Ramesh A，Sharma M P，et al.Microbial community structure and diversity as indicators for evaluating soil quality//Lichtfouse E. ed.Biodiversity，Biofuels，Agroforestry and Conservation Agriculture[J]. Springer Netherlands， 2010(5): 317-358.

[11]曹萬舉， 隋 心，韓士杰，等．分子生物學(xué)技術(shù)在土壤微生物多樣性中的應(yīng)用[J]. 生物過程，2013(3)：23-28．

[12]Chen H，Boutros P C. Venn Diagram: a package for the generation of highly-customizable Venn and Euler diagrams in R[J].BMC Bioinformatics，2011，12(1): 35.

[13]Chao A N. Non-parametric estimation of the number of classes in a population[J]. Scandinavian Journal of Statistics，1984，11(4): 265-270．

[14]Hill M O.Diversity and evenness: a unifying notation and its consequences[J]. Ecology, 1973，54(2): 427-432.

[15]Esty W W. The efficiency of Good’s nonparametric coverage estimator[J]. The Annals of Statistics, 1986，14(3): 1257-1260.

[16]Landau S， Everitt B S. A Handbook of Statistical Analyses Using SPSS[M]. Florida: Chapman & Hall，2004．

[17]Esty W W. The Efficiency of Good's Nonparametric Coverage Estimator[J]. Annals of Statistics，1986,14(3): 1257-1260．

[18]王伏偉，王曉波，李金才，等．施肥及秸稈還田對(duì)砂姜黑土細(xì)菌群落的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2015， 23(10)：1302-1311．

[19]楊 娟，郝志成，張亞平． 基于MiSeq測序分析新疆泥火山土壤細(xì)菌群落多樣性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2016，43(12)：2609-2618．