黨珍珍，紀得勇，田 銳,2*，馬紅燕,2*

(1.延安大學 化工學院，陜西 延安 716000；2.延安市分析技術與檢測重點實驗室，陜西 延安 716000)

甲巰咪唑(Thiamazole，2-mercapto-1-methylimidazole，MMI)，為咪唑類抗甲狀腺藥物，是臨床上用于各種類型的甲狀腺功能亢進癥的一線治療藥物，長期服用或者劑量過大均會使人體血液系統(tǒng)、骨及關節(jié)和消化系統(tǒng)產(chǎn)生不良反應[1]。因此，建立準確、靈敏地測定甲巰咪唑含量的方法對指導臨床用藥有著重要意義。目前測定甲巰咪唑的方法有化學發(fā)光分析法[2]、紫外分光光度法[3]、高效液相色譜法[4-5]、光度法[6-8]、電化學法[9-10]等。這些方法或使用儀器昂貴，或穩(wěn)定性、重現(xiàn)性不好，或操作不便，所以建立一種簡便，快速，靈敏測定甲巰咪唑的方法尤為重要。

羅丹明B(RhB)是一種常用的熒光染料，可以通過靜電作用吸附到帶負電的金納米粒子(AuNPs)表面，AuNPs能夠通過與RhB間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及分子間碰撞使其熒光猝滅[11]，而不同粒徑、不同尺寸的金納米粒子對羅丹明B的熒光猝滅程度不同[12]。據(jù)此，本文通過向AuNPs、RhB體系中加入甲巰咪唑分子使體系中AuNPs聚集產(chǎn)生熒光信號變化，建立了一種測定甲巰咪唑的熒光分析新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2700型熒光分光光度計、JEM-2100型透射電鏡(日本日立公司)；TU1901紫外-可見分光光度計(普析光學儀器有限公司)。

氯金酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；檸檬酸三鈉(分析純，西安化學試劑廠)。實驗用水為超純水。甲巰咪唑藥片(10 mg/tablet，Merck KGaA)。

甲巰咪唑標準溶液(0.876×10-2mol/L)：準確稱取甲巰咪唑標準品(含量99.5%，中國藥品生物制品檢定所，批號100030-200504)100 mg，用超純水溶解后定容于100 mL容量瓶中，使用時逐級稀釋。

羅丹明B標準儲備溶液(1.0×10-3mol/L)：準確稱取47.9 mg羅丹明B(分析純，西安化學試劑廠)，用超純水溶解后，定容于100 mL容量瓶中。

1.2 實驗原理

由檸檬酸鈉還原氯金酸得到的AuNPs被檸檬酸根保護，表面帶負電荷，通過靜電排斥作用使其保持穩(wěn)定。將AuNPs與RhB混合后，RhB分子可通過靜電作用吸附在AuNPs表面，此時，由于AuNPs對RhB分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光猝滅效應[13]；當AuNPs發(fā)生團聚時，其對RhB的熒光猝滅程度減弱[12]。實驗發(fā)現(xiàn)甲巰咪唑可使分散態(tài)AuNPs發(fā)生團聚形成聚集態(tài)AuNPs，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{紫色(圖1)，從而使其對RhB的熒光猝滅作用減弱，體系熒光信號增強，且增強程度在一定范圍內(nèi)與甲巰咪唑分子濃度成正比。

圖1 甲巰咪唑的熒光測定機理Fig.1 Schematic digram of the mechanism for thiamazole detection insert：the image of system with and without MMI;A:AuNPs+RhB,B:AuNPs+RhB+MMI

1.3 實驗方法

1.3.1AuNPs的制備AuNPs按文獻方法[14]制備：將50 mL 1 mmol/L氯金酸加入100 mL圓底燒瓶中攪拌、加熱，待溶液開始回流后快速向其中加入5 mL 38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)回流15 min后停止加熱，待溶液冷卻后用0.45 μm濾膜過濾，濾液置于棕色試劑瓶中，于4 ℃冰箱保存。

1.3.2實驗方法取1.0 mL 1.0×10-5mol/L RhB溶液于10 mL比色管中，加入1.0 mL AuNPs溶液，搖勻，靜態(tài)作用1 h后，得到AuNPs-RhB測定液。分別取2.0 mL測定液于比色管中，然后分別向其中加入超純水和甲巰咪唑溶液定容，放置反應50 min后，在熒光分光光度計上測定對照組(FB)和樣品組(FS)的熒光信號值，根據(jù)兩者的熒光信號差值ΔF(ΔF=FS-FB)與甲巰咪唑濃度的關系來定量測定甲巰咪唑含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的表征及實驗機理驗證

為確定所制備AuNPs的尺寸和形貌，對其進行透射電鏡(TEM)和吸收光譜表征，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示合成的AuNPs在520 nm左右有強吸收，表明該AuNPs的直徑約13 nm且無團聚[15]，由TEM結(jié)果(內(nèi)插圖)可見AuNPs粒徑的均一分散性良好。

圖2 AuNPs的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of AuNPs insert:TEM photograph of AuNPs

圖3 吸收光譜(A)及熒光光譜(B)Fig.3 Absorption(A) and fluorescence spectra(B)A：a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.RhB;d.AuNPs-RhB-MMI;e.MMI;B：a.AuNPs-RhB-MMI;b.AuNPs-RhB

實驗分別對AuNPs、AuNPs-RhB、AuNPs-RhB-甲巰咪唑、RhB進行了光譜掃描，結(jié)果如圖3所示。由圖3A可見，向AuNPs中加入RhB后吸收光譜的形狀未發(fā)生變化，加入甲巰咪唑分子后，AuNPs在520 nm左右的吸收峰逐漸消失，而在720 nm處出現(xiàn)1個新峰，這是由于甲巰咪唑的加入引起了AuNPs的團聚。圖3B為加入甲巰咪唑前后AuNPs-RhB體系的熒光光譜，圖中曲線a、b的峰形及最大發(fā)射波長一致，表明AuNPs、甲巰咪唑未與RhB作用生成新物質(zhì)。但比較曲線a、b可發(fā)現(xiàn)，加入甲巰咪唑后體系的熒光信號明顯增強，這是由于加入甲巰咪唑后,AuNPs發(fā)生團聚，而聚集態(tài)AuNPs對RhB熒光的猝滅作用較分散態(tài)AuNPs小[12]，所以體系熒光強度增強。因此體系熒光信號的變化是由于不同聚集態(tài)AuNPs對RhB熒光的猝滅作用所致。

2.2 分析條件的選擇

2.2.1溶液pH值溶液pH值是影響分析檢測的重要因素，實驗考察了不同pH值(pH 4.0～8.0)對測定的影響，結(jié)果顯示，不同pH值體系中加入甲巰咪唑后其熒光增加值ΔF不同，當體系pH值為7.0時ΔF最大。這可能是由于：pH值過低時，一方面RhB質(zhì)子化程度高使其與AuNPs的吸附作用增強，不利于RhB從AuNPs表面脫落；另一方面，甲巰咪唑分子中的巰基也可能質(zhì)子化使其與AuNPs的作用減弱，不能更有效地使AuNPs發(fā)生聚集。而當pH值過高時，溶液中所含的OH-濃度逐漸增大，使得納米金表面吸附了一定量的OH-從而減少了納米金對RhB分子的吸附[13]，體系背景值增大，所以加入甲巰咪唑后，熒光增強較小。故選擇pH 7.0為最優(yōu)實驗條件。

2.2.2反應時間在優(yōu)化條件下，按“1.3.2”方法配制溶液，每隔10 min測定其熒光。結(jié)果表明，40 min內(nèi)ΔF隨著時間的延長不斷降低，在50～70 min內(nèi)ΔF基本不變，此后，又隨著時間的延長而降低。綜合考慮選擇反應時間為50 min。

2.2.3AuNPs與RhB的濃度AuNPs和RhB的濃度直接影響測定的靈敏度，由于游離RhB自身有很強的熒光，如果其濃度太高，會使背景信號增大；反之，若RhB濃度太低，加入甲巰咪唑后形成的聚集態(tài)AuNPs使熒光增強減小，導致測定靈敏度降低。因此，實驗考察了AuNPs和RhB的濃度對測定結(jié)果的影響。選取1.0 mL 1.0×10-5mol/L RhB與不同體積AuNPs混合，靜態(tài)吸附1 h，加入2.0 mL甲巰咪唑，定容至10 mL，放置50 min后測定ΔF。結(jié)果表明，隨著AuNPs用量的不斷增加，ΔF急劇增加，當AuNPs用量為1.0 mL時ΔF最大，隨后緩慢減小。所以本實驗選擇AuNPs與1.0×10-5mol/L RhB等體積混合，稀釋10倍后測定。

2.3 標準曲線與檢出限

優(yōu)化實驗條件下，采用本方法對甲巰咪唑進行測定，結(jié)果表明，在4.38×10-8～0.876×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)體系的ΔF值與甲巰咪唑濃度呈良好的線性關系，線性方程為ΔF=4.54×107c+9.72，相關系數(shù)r=0.999，檢出限(S/N=3)為3.30×10-8mol/L。優(yōu)化的實驗條件下，對0.876×10-6mol/L甲巰咪唑標準溶液平行測定11次，其相對標準偏差(RSD)為2.5%。

2.4 干擾試驗

在優(yōu)化的實驗條件下，考察了可能存在的添加劑對甲巰咪唑測定的影響。當甲巰咪唑的濃度為0.876×10-6mol/L，1 400倍的Zn2+、Al3+、Mn2+、 Mg2+、 Ca2+、D-果糖，1 100倍的Cu2+、 Co2+，570倍的Fe3+、 Cr6+、Ba2+、蔗糖以及110倍的葡萄糖不干擾測定。

2.5 樣品測定

表1 藥品中甲巰咪唑含量測定結(jié)果(n=5)Table 1 Determination results of thiamazole in tablets(n=5)

隨機抽取10片甲巰咪唑藥片，研細混勻后準確稱取適量(相當于甲巰咪唑100 mg)，加入超純水溶解后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容、靜置，依次用濾紙和0.45 μm濾膜過濾，按本方法測定。測定結(jié)果表明，該法測得的甲巰咪唑含量與藥品的標示量基本一致。為了進一步驗證方法的準確性，采用標準加入法測得樣品回收率為96.2%～101.8%，表明該法用于甲巰咪唑片劑中甲巰咪唑含量的測定結(jié)果準確。

3 結(jié) 論

在RhB與AuNPs的混合體系中，AuNPs可通過共振能量轉(zhuǎn)移作用使RhB熒光猝滅，體系呈弱熒光，加入甲巰咪唑后，AuNPs發(fā)生團聚，其對RhB的熒光猝滅作用減弱，體系熒光增強，據(jù)此建立了基于不同聚集態(tài)AuNPs與RhB間熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定甲巰咪唑的熒光分析新方法。該方法線性范圍為4.38×10-8～0.876×10-5mol/L，檢出限為3.30×10-8mol/L，對藥物中甲巰咪唑的測定結(jié)果令人滿意。

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