岑秋霖，朱亞先，張 勇*

(1.近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室(廈門大學(xué))，廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102；2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)系，福建 廈門 361005)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)因其“三致效應(yīng)”和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)備受關(guān)注[1-3]。研究表明，PAHs降解過程中的含氧代謝產(chǎn)物比其母體毒性更大[4]，因此須追蹤PAHs微生物降解中間代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，深入了解PAHs降解機制[5]。菲(Phenanthrene,Phe)常作為研究PAHs微生物降解過程的模式化合物[6]，其中1-羥基-2-萘甲酸(1-Hydroxy-2-naphthoic acid,1H2NA)是Phe重要的中間代謝產(chǎn)物[7]。Phe降解通路多樣性主要通過1H2NA的轉(zhuǎn)化和再代謝方式體現(xiàn)[8];當(dāng)雙加氧酶特異性作用于Phe的3,4碳位后可將Phe代謝為1H2NA[9];此外，高環(huán)PAHs(芘[10]、苯并芘[11]等)及PAHs衍生物(1-甲基-菲[12]等)的微生物降解通路研究均可檢出1H2NA。因此，建立Phe、1H2NA的原位、在線檢測方法，有助于深入探討PAHs的微生物降解機制。

現(xiàn)有Phe及其微生物降解產(chǎn)物測定方法多采用氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜法[13-15]。色譜法具有選擇性好、靈敏度高、檢測通量大等特點，但其前處理步驟繁瑣、耗時長、操作復(fù)雜，且破壞了目標(biāo)物在降解過程中的原始賦存狀態(tài)，難以實現(xiàn)溶解態(tài)目標(biāo)物的原位、在線檢測。另外，PAHs微生物降解過程中，大部分中間代謝產(chǎn)物再代謝速度快，不易積累[16]，使原位測定溶解態(tài)PAHs降解過程中代謝產(chǎn)物成為挑戰(zhàn)。熒光分析法具備原位在線檢測的特點[17-18]，而導(dǎo)數(shù)-同步熒光法可窄化譜圖、提高選擇性，能用于多組分的同時測定[19-22]。

本文擬運用導(dǎo)數(shù)-同步熒光光譜法建立一種快速同時測定溶解態(tài)Phe和1H2NA的新方法，以期原位研究PAHs降解過程及其中間代謝產(chǎn)物，為實現(xiàn)原位、在線研究PAHs降解通路提供方法基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Phe(純度>98%，Sigma-Aldrich公司，美國)；1H2NA(純度>98%，東京化成工業(yè)，日本)；MSM無機鹽培養(yǎng)基[23]；富營養(yǎng)培養(yǎng)基2216E(青島海博生物技術(shù)有限公司)；無水乙醇(分析純，西隴化工股份有限公司)；實驗用水為Milli-Q水。

FLS 920型納秒時間分辨熒光光譜儀(Edinburgh Instrument公司，英國)；GI54DWS高壓滅菌器(Zealway公司，美國)；Sky 2102C恒溫振蕩器(上海蘇坤實業(yè)有限公司)；Universal 320R高速冷凍離心機(Hettich公司，德國)；VS-840K-U潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(500 W，昆山公司)。

降解菌NovosphingobiumpentaromativoransUS6-1，由韓國海洋研究與發(fā)展院提供[24]。

圖1 1H2NA在Milli-Q水和MSM溶液中的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Emission fluorescence spectra of 1H2NA in Milli-Q and MSM solution[1H2NA]=1.0×103 μg/L；λex,1H2NA=344 nm

圖2 不同pH值下1H2NA的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Emission fluorescence spectra of 1H2NA at different pH values[1H2NA]=1.0×103 μg/L

1.2 實驗方法

分別準(zhǔn)確稱取0.100 3 g Phe和0.100 5 g 1H2NA配成1.00 g/L的乙醇儲備液，避光置于4 ℃冰箱保存。實驗時采用逐級稀釋法得到Phe和1H2NA不同濃度的工作液。實驗在MSM溶液(pH 7.0)體系中進行。

儀器激發(fā)和發(fā)射狹縫均為3 nm；測量精度為0.5 nm。

Phe微生物降解實驗參考文獻[23]，以600 nm吸光值(OD600)表示微生物量。設(shè)置3組平行實驗，每隔一定時間移取適量降解液至比色皿中進行熒光光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 1H2NA的熒光光譜

2.1.11H2NA的熒光光譜分析Sivakumar等[25]的研究表明，1H2NA水溶液在342 nm處有最大吸收峰。本實驗降解體系溶液為MSM溶液。為考察降解體系是否影響單組分1H2NA的測定，比較了Milli-Q水和MSM溶液中1H2NA的熒光發(fā)射光譜(圖1)。結(jié)果表明，MSM溶液中1H2NA的熒光發(fā)射強度、峰位置未受影響。

圖3 Phe和1H2NA的熒光發(fā)射光譜(A)和同步光譜(B)Fig.3 Emission fluorescence spectra(A) and synchronous fluorescence spectra(B) of Phe and 1H2NA[Phe]=4.0×102 μg/L,[1H2NA]=4.0×102 μg/L；λex,Phe=293 nm,λex,1H2NA=344 nm,Δλ=69 nm

圖4 Phe和1H2NA混合體系的導(dǎo)數(shù)-同步熒光光譜Fig.4 Derivative synchronous fluorescence spectra of Phe and 1H2NA[Phe]=4.0×102 μg/L,[1H2NA]=4.0×102 μg/L；Δλ=69 nm,number of scans:5

2.1.2體系pH值對1H2NA熒光光譜的影響1H2NA含有羧基和羥基，體系pH值可能影響其熒光光譜的形狀和強度[26]。圖2結(jié)果表明，溶液pH>8.0或pH<6.0時，1H2NA的熒光發(fā)射信號強度降低，且酸性介質(zhì)使1H2NA的最大發(fā)射峰紅移。另外，Phe降解過程中的三羧酸循環(huán)過程會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，基于此考察溶解態(tài)Phe降解過程中體系pH值的變化。實驗結(jié)果顯示，在整個實驗周期內(nèi)，降解體系的pH值可保持在中性(pH 6.9～7.1)。因此，選取pH 7.0為實驗條件。

2.2 導(dǎo)數(shù)-同步熒光光譜同時測定Phe與1H2NA

2.2.1Phe與1H2NA共存下的同步熒光光譜Phe、1H2NA在MSM溶液中的熒光發(fā)射光譜如圖3A所示。體系中Phe與1H2NA的發(fā)射光譜部分重疊，影響傳統(tǒng)熒光方法對二者的同時測定。考察不同Δλ下(Δλ=45～79 nm，間隔2 nm)Phe和1H2NA的同步熒光光譜特征。當(dāng)選取Δλ=69 nm為Phe、1H2NA混合組分的同步熒光光譜測定條件(圖3B)時，Phe和1H2NA的熒光光譜分辨率較好且熒光強度最強，可實現(xiàn)二者的同時測定。

2.2.2Phe與1H2NA共存下的導(dǎo)數(shù)-同步熒光光譜由圖3B可知，1H2NA的同步熒光光譜譜峰寬，且降解過程中其含量低、變化快[12]。本實驗研究結(jié)果表明，當(dāng)1H2NA的質(zhì)量濃度為10.0 μg/L時，其信噪比(S/N)僅為12。因此有必要進一步改善方法的靈敏度。同步熒光法結(jié)合導(dǎo)數(shù)技術(shù)可改善分辨能力，排除基體干擾，有利于提高方法選擇性和靈敏度[26]。Phe和1H2NA的導(dǎo)數(shù)-同步光譜如圖4所示，選定296 nm和352 nm分別為Phe和1H2NA的導(dǎo)數(shù)-同步熒光峰，此時目標(biāo)物的信噪比最大，1H2NA的檢測靈敏度明顯改善。

2.3 工作曲線、線性范圍及檢出限

在Phe和1H2NA的混合液中固定其中一種組分濃度，配制另一組分的一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化實驗條件下，Phe和1H2NA的測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，混合物體系中目標(biāo)物濃度(x，μg/L)與其導(dǎo)數(shù)-同步熒光信號(y)呈良好的線性關(guān)系；方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于1.0%；以3倍空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率，得Phe和1H2NA的檢出限(LOD)分別為0.08 μg/L和0.07 μg/L。1H2NA的LOD較氣相色譜法[27]的0.3 μg/L明顯改善。

表1 導(dǎo)數(shù)-同步熒光光譜法的分析特性Table 1 Analytical merits of the derivative synchronous fluorescence spectroscopy

2.4 回收率實驗

取降解8 h后的樣品過0.22 μm濾膜，分別向樣品中加入一定濃度Phe和1H2NA混合物的標(biāo)準(zhǔn)品進行回收率實驗，每組設(shè)置3個平行樣，結(jié)果見表2。本方法同時測定Phe和1H2NA的回收率分別為96.5%～105.3%和99.2%～106.5%，均可滿足實驗要求。

表2 樣品的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of standard addition experiments

圖5 導(dǎo)數(shù)-同步熒光法同時測定Phe微生物降解過程中的Phe和1H2NAFig.5 Simultaneous determination of Phe and 1H2NA by the derivative synchronous fluorescence spectroscopy during the biodegradation process of Phe OD600=0.002,[Phe]init=4.0×102 μg/L

2.5 Phe降解過程中Phe與1H2NA的同時測定

溶解態(tài)Phe的微生物降解實驗結(jié)果見圖5。空白實驗結(jié)果表明，降解菌不干擾Phe和1H2NA的測定。實驗周期內(nèi)，隨著Phe的降解，1H2NA不斷積累，在Phe近乎完全降解時，1H2NA積累量達到最大，之后降解菌繼續(xù)降解1H2NA。參考文獻[7]，根據(jù)α=n(1H2NA)max/n(Phe)init(其中n(1H2NA)max表示1H2NA的最大積累摩爾濃度，n(Phe)init表示Phe的初始摩爾濃度)計算可知，本實驗過程中約有33.2%的Phe被降解菌轉(zhuǎn)化成1H2NA。

綜上，所建方法實現(xiàn)了降解過程中溶解態(tài)Phe及其中間代謝產(chǎn)物1H2NA的同時測定，且可用于1H2NA的動態(tài)變化測定；方法操作簡便，具備原位在線研究PAHs微生物降解機理的應(yīng)用潛力。

3 結(jié) 論

上述實驗結(jié)果表明，運用導(dǎo)數(shù)-同步熒光光譜法可同時測定Phe和1H2NA，方法靈敏度高、檢出限較色譜法改善近4倍。本方法無需前處理分離，操作簡便，省時省力，為原位在線測定PAHs及其中間代謝產(chǎn)物并進一步研究PAHs降解機制提供了可能。在此基礎(chǔ)上，今后將進一步研究多種代謝產(chǎn)物的原位同時測定，為PAHs微生物降解通路機制的原位研究提供新方法。

參考文獻：

[1] Zheng B H,Wang L P,Lei K,Nan B X.Chemosphere,2016,149:91-100.

[2] Yin S S,Tang M L,Chen F F,Li T L,Liu W P.Environ.Pollut.,2017,220:1429-1437.

[3] Zhang Y Y,Dong S J,Wang H G,Tao S,Kiyama S.Environ.Pollut.,2016,213:809-824.

[4] Wolfgang W,Mario K,Benjamin M B.Environ.Pollut.,2014,184:385-390.

[5] Mai Q N,Hong Y N,Wen C,Xiao D W,Yu T G,Xiao T T,Xi H Y,Yan W.PolycyclicAromat.Compd.,2016,36:132-151.

[6] Waigi M G,Kang F X,Goikavi C,Ling W T,Gao Y Z.Int.Biodeter.Biodegr.,2015,104:333-349.

[7] Wang H Z,Lou J,Gu H P,Luo X Y,Yang L,Wu L S,Liu Y,Wu J J,Xu J M.Environ.Sci.Pollut.Res.,2016,23:13378-13388.

[8] Madhumita R,Pratick K,Tapan K D.Microbiology,2012,158:685-695.

[9] Mallick1 S,Chakraborty J,Dutta T K.Crit.Rev.Microbiol.,2011,37(1):64-90.

[10] Jin J N,Yao J,Zhang Q Y,Liu J L.Chemosphere,2016,164:379-386.

[11] Hilton M,Lara D,Adolfo J,Joaquim F,André R,Oliveira T,Fernando M,Luiz A,Hileia S,Sandra P.Water,Air,SoilPollut.,2016,227:431-444.

[12] Zhong J N,Luo L J,Chen B W,Sha S,Qing Q,Nora F T,Zhang Y,Luan T G.Mar.Pollut.Bull.,2017,114:926-933.

[13] Meyer S,Cartellieri S,Steinhart H.Anal.Chem.,1999,71(18):4023-4029.

[14] Hennessee C T,Li Q X.Appl.Environ.Microbiol.,2016,82(11):3357-3369.

[15] Fernando J H B,Martha P G L.Chemosphere,2016,158:80-90.

[16] Huang X,Shi J,Cui C,Yin H,Zhang R,Ma X,Zhang X.J.Appl.Microbiol.,2016,121:1616-1626.

[17] Siraj N,Bilal E Z,Hamdan S,Karam T E,Haber L H,Li M,Fakayode S O.Anal.Chem.,2016,88:170-202.

[18] Li J F,Li C Y,Ricardo F A.Chem.Soc.Rev.,2017,46:3962-3979.

[19] Liu Y Z,Yang C H,Zhu Y X,Zhang Y.J.Instrum.Anal.(劉洋之,楊承虎,朱亞先,張勇.分析測試學(xué)報),2015,34(12):1366-1371.

[21] Liu X X,Wan Y Q.Chin.J.Anal.Lab.(劉香香,萬益群.分析試驗室),2013,32(8):7-10.

[22] Li R L,Zhu Y X,Zhang Y.Environ.Pollut.,2016,219:245-252.

[23] Du L,Zhang Z X,Zhu Y X,Zhang Y.ChinaEnviron.Sci.(杜蘭，張振軒，朱亞先，張勇.中國環(huán)境科學(xué)),2017,37(4):1375-1379.

[24] Sung H Y,Choi C W,Lee S Y,Kwon J,Leem S H,Chung Y H,Kahng J H,Kim S J,Kwon K K,Kim S.Plosone,2014,9(3):1-11.

[25] Sivakumar K,Bhakyajothi V,Parameswari M,Prema D,Stalin T.Polycycl.Aromat.Compd.,2013,23:221-235.

[26] Xu J G,Wang Z B.Fluorometry.3rd ed.Beijing:Science Press(許金鉤,王尊本.熒光分析法.3版.北京:科學(xué)出版社),2006.

[27] Benjamin M B,Wolfgang W.J.Environ.Qual.,2010,39:1349-1358.