王希越，明 明，田媛媛，李有良，連麗麗，婁大偉

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

水稻作為最重要的糧食作物，為世界近1/2的人口提供糧食。水稻中的代謝物不僅為水稻生長提供能量，也是人類和動(dòng)物營養(yǎng)物質(zhì)的來源[1]。靶標(biāo)分析方法通常對(duì)水稻中的幾類代謝物進(jìn)行研究[2-3]，這種方法準(zhǔn)確性高，但在代謝表型分析時(shí)可能會(huì)遺漏有用信息，而非靶標(biāo)分析方法可以無偏向性地檢測細(xì)胞內(nèi)所有代謝物，更全面反映細(xì)胞整體代謝狀態(tài)[4-5]。近年一些研究者利用非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法分析水稻種子中代謝物的相對(duì)豐度，來研究水稻生長發(fā)育過程和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及其在不同基因型下的表型特征[6-10]，為水稻代謝適應(yīng)性研究提供重要信息，同時(shí)架起基因型和表型研究之間的橋梁，為水稻新品種選育及稻米質(zhì)量改善提供理論依據(jù)[11-12]。

水稻中物質(zhì)成分復(fù)雜，且物質(zhì)間的理化性質(zhì)差異較大，濃度跨度寬，所以最大限度地提取水稻中的物質(zhì)是非靶標(biāo)分析方法的關(guān)鍵步驟之一。植物中代謝物提取常用的溶劑包括水、甲醇、乙醇、氯仿、甲基叔丁基醚、乙腈、異丙醇等，為盡可能的提取較多物質(zhì)，常結(jié)合幾種溶劑在最優(yōu)的比例下進(jìn)行提取。Giavalisco等[13]利用甲基叔丁基醚-甲醇-水同時(shí)提取擬南芥中極性、中等極性、疏水性脂類、蛋白和淀粉等物質(zhì)。陳冬梅等[14]用氯仿-甲醇-水提取水稻種子中代謝物，建立了基于GC-MS分析的水稻代謝組學(xué)研究方法。除各種溶劑用于代謝物提取外，常利用物理化學(xué)或機(jī)械作用力，如超聲、加熱、振動(dòng)等輔助細(xì)胞破碎，幫助提高代謝物的提取效率[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)以水稻種子為研究對(duì)象，通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考察4種常用提取溶劑(80%甲醇、異丙醇-乙腈-水(3∶3∶2)、乙腈-甲醇-水(2∶2∶1)、80%乙腈)，以及3種細(xì)胞破碎方式(渦旋、恒溫振蕩、超聲)對(duì)水稻種子中物質(zhì)的提取效率，以得到的峰個(gè)數(shù)和峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立基于GC-MS的非靶標(biāo)代謝組分析方法，并對(duì)不同水稻種子中代謝物輪廓差異進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B M7-300EI氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent Technologies，USA&北京普析通用儀器有限公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)；H1650高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；HS-3120超聲波清洗器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；CPA225D精密電子分析天平(長沙康源科技開發(fā)有限公司)；N-EVAP111氮吹儀(Organomation Associates，Inc)。

N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)、甲氧胺購自西格瑪公司(Sigma-Aldrich Co.，USA)，色譜純甲醇和乙腈購自天地公司(Tedia Company Inc.，USA)，色譜純異丙醇、二氯甲烷購自沈陽市華東試劑廠，吡啶購自Alfa Aesar公司。超純水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Co.，USA) 純化。水稻樣品產(chǎn)自吉林省本地種植區(qū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品預(yù)處理將產(chǎn)自本地種植區(qū)的當(dāng)季水稻脫殼、粉碎后過60目篩，存放于-20 ℃冰箱中。稱取100 mg樣品，加入1.5 mL 80%甲醇，渦旋提取5 min，于12 000 r/min離心10 min，取800 μL上清液用氮?dú)獯蹈珊?，存放?20 ℃冰箱中，備用。

1.2.2樣品衍生向氮?dú)獯蹈蓸悠分屑?0 μL甲氧胺-吡啶溶液(20 g/L)，渦旋1 min充分溶解，37 ℃水浴下肟化反應(yīng)90 min，再加60 μL MSTFA，37 ℃水浴下衍生60 min。衍生后樣品經(jīng)12 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL于進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣分析。

1.2.3GC-MS分析條件氣相色譜條件:GC-MS分析毛細(xì)管柱為安捷倫HP-5 MS 柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm， J & W Scientific，USA)，載氣流速1.2 mL/min(99.999 6%，He) 。進(jìn)樣口溫度300 ℃，程序升溫條件：初始70 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至300 ℃，維持5 min；分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源(EI)，電離能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，全掃描方法質(zhì)量掃描范圍m/z33～600，溶劑切割時(shí)間6 min。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析利用儀器工作站GC-MS Station將采集到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)成cdf格式，然后導(dǎo)入XCMS軟件中進(jìn)行濾噪、代謝特征提取、保留時(shí)間對(duì)齊等處理[18]。XCMS參數(shù)設(shè)置如下：fwhm=6，max=100，snthresh=10，step=0.1。最后得到一個(gè)包含各代謝物特征質(zhì)荷比、保留時(shí)間和峰面積的二維峰表。用80%規(guī)則去除峰表中零值，然后用總面積進(jìn)行歸一化。主成分分析(PCA)用Metaboanalyst完成(http://www.metaboanalyst.ca/)[19]，非參數(shù)檢驗(yàn)在PASW Statistics 18.0(SPSS，Chicago，USA)軟件中完成，其中發(fā)生顯著變化物質(zhì)的p值設(shè)為0.05。由MultiExperiment View 4.9.0進(jìn)行熱圖分析(數(shù)據(jù)經(jīng)UV Scaling處理)。

1.2.5樣品處理方法考察重復(fù)性：按“1.2.1”方法平行處理6份樣品，數(shù)據(jù)預(yù)處理后，統(tǒng)計(jì)各代謝物響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分布，考察方法重復(fù)性。

線性：分別稱取QC樣品20、40、60、80、100、120、140、160 mg，按“1.2.1”方法處理，每個(gè)樣品量平行處理3份。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，計(jì)算各代謝物響應(yīng)值與樣品量間的線性相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法優(yōu)化

考察了輔助超聲、恒溫振蕩、渦旋3種常見的提取方法對(duì)水稻中物質(zhì)提取效率的影響。其中輔助超聲和恒溫振蕩提取時(shí)間為60 min，渦旋提取時(shí)間為5 min，每種方法平行處理3份樣品。以得到的代謝物總個(gè)數(shù)和總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，渦旋提取方法得到的代謝物峰面積和總個(gè)數(shù)優(yōu)于其他兩種方法，而且渦旋方法提取時(shí)間短，操作簡單，所以選擇渦旋提取方式。

另外，實(shí)驗(yàn)比較了4種常用提取溶劑，包括 80%甲醇、異丙醇-乙腈-水(3∶3∶2，體積比)、乙腈-甲醇-水(2∶2∶1，體積比)、80%乙腈的提取效率，每種溶劑分別處理3份樣品。結(jié)果顯示，80%甲醇提取到的代謝物個(gè)數(shù)和總面積均最大，其次是乙腈-甲醇-水(2∶2∶1)和異丙醇-乙腈-水(3∶3∶2)，80%乙腈最差，這可能是由于水稻中糖類及其衍生物、氨基酸、有機(jī)酸等極性物質(zhì)較多，所以極性略強(qiáng)的80%甲醇可獲得最佳的提取效果。

2.2 方法驗(yàn)證

按照“1.2.5”方法考察了方法重復(fù)性，結(jié)果顯示，有50%以上代謝物峰面積的RSD小于20%，其峰面積累積響應(yīng)值占全部代謝物總面積的53%，峰面積的RSD小于30%的占總個(gè)數(shù)的76%，其總和占全部代謝物的80%以上。由此可看出該方法的重復(fù)性較好，可用于代謝組分析。

在非靶標(biāo)代謝組學(xué)分子中，可能會(huì)存在一些結(jié)構(gòu)未定的物質(zhì)，所以很難采用常規(guī)方法對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行線性考察。本研究中稱取20～160 mg樣品，用80%甲醇提取分析后，計(jì)算各物質(zhì)的峰面積與樣品量間的線性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有57%的代謝物響應(yīng)與樣品量間的線性相關(guān)系數(shù)大于0.9，線性相關(guān)系數(shù)大于0.8的物質(zhì)約占80%，說明在20～160 mg樣品量范圍內(nèi)，大部分物質(zhì)響應(yīng)值與其對(duì)應(yīng)樣品量間線性關(guān)系良好，該方法比較穩(wěn)定可靠。

2.3 方法應(yīng)用

基于所建立的分析方法研究了3種水稻(稻花香、農(nóng)大、狀元)的代謝物輪廓，得到代謝物的總離子流圖如圖2所示。將儀器采集得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行XC-MS處理，總面積歸一化后導(dǎo)入MetaboAnalyst進(jìn)行PCA模型識(shí)別分析。從PCA得分圖可知，3種水稻的代謝物輪廓有明顯差別，尤其是稻花香和農(nóng)大間的代謝差異最大，而農(nóng)大與狀元間也存在較大差異(圖3)。

圖2 水稻中代謝物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatography of metabolites extracted from rice

圖3 3種水稻的PCA得分圖Fig.3 PCA score plot of three rice seedsd:daohuaxiang rice(稻花香水稻),n:nongda rice(農(nóng)大水稻),z:zhuangyuan rice(狀元水稻)

各水稻間含量有明顯差異的物質(zhì)如圖4所示。圖4A顯示稻花香與農(nóng)大間有顯著差異的物質(zhì)，從圖可見，苯乙醇胺、甘油、L-天冬酰胺、3-磷酸甘油、檸檬酸、十四酸、 葡萄糖、半乳糖、棕櫚酸、肌醇、亞油酸、硬脂酸、油酸等相對(duì)含量在稻花香中較高，而琥珀酸、果糖相對(duì)含量較低。圖4B顯示，相對(duì)于農(nóng)大，狀元中乳酸、甘油、L-天冬酰胺、檸檬酸、十四酸、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸等代謝物含量較高，而蘇氨酸、磷酸的相對(duì)含量較低。與稻花香相比，狀元中乳酸、乙二酸、琥珀酸、十四酸、果糖、甘露醇、硬脂酸等代謝物的含量更高，而蘇氨酸、3-磷酸甘油、麥芽糖含量在稻花香中更高(圖4C)。

圖4 水稻間含量有顯著差異物質(zhì)的熱圖Fig.4 Heat map of significantly changed metabolitesA：between daohuaxiang and nongda；B：between nongda and zhuangyuan；C：between daohuaxiang and zhuangyuan

3 結(jié) 論

本文以水稻種子為研究對(duì)象，建立了基于GC-MS的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法研究其代謝物輪廓?？疾?種不同樣品處理方法和4種提取溶劑對(duì)代謝物的提取效果，確定渦旋提取方法和80%甲醇作為提取溶劑。方法驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，樣品量在20～160 mg范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，可用于水稻種子代謝表型分析，為研究基因或環(huán)境對(duì)水稻生長、產(chǎn)量、質(zhì)量的影響奠定了基礎(chǔ)。

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