李 佩，崔君濤，郭溪香，曾祥英，于志強(qiáng)*

(1．中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所 有機(jī)地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省環(huán)境資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2．中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

多環(huán)芳烴(PAHs)廣泛存在于環(huán)境中，主要來(lái)源于化石燃料、生物質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的不完全燃燒[1]。PAHs具有致癌、致畸和致突變效應(yīng)，對(duì)人體健康和生態(tài)系統(tǒng)具有危害作用[2-3]。20世紀(jì)70年代，美國(guó)環(huán)保署(USEPA)將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物。我國(guó)也將7種PAHs列入“優(yōu)先污染物黑名單”。近年來(lái)，人體暴露于多環(huán)芳烴已受到了廣泛關(guān)注[3-6]。

人們可通過(guò)呼吸空氣、攝入灰塵和食物、皮膚吸收等多種途徑暴露于PAHs[4,7]。進(jìn)入人體的PAHs在P450酶的作用下，通過(guò)Ⅰ相代謝反應(yīng)生成羥基化代謝物，也可繼續(xù)通過(guò)Ⅱ相代謝反應(yīng)與葡萄糖苷酸或/和硫酸酯結(jié)合形成水溶性更強(qiáng)的結(jié)合態(tài)代謝物，繼而通過(guò)人體尿液或糞便排出體外[8]。人體尿液中的羥基多環(huán)芳烴(OH-PAHs)被廣泛用作人體暴露于PAHs的生物標(biāo)志物，其中1-羥基芘(芘的代謝物)是最常用的生物標(biāo)志物。但研究表明，同時(shí)檢測(cè)尿液中多種羥基多環(huán)芳烴對(duì)于全面評(píng)估人體暴露于PAHs非常有必要[9-10]。隨著流行病學(xué)的發(fā)展，大樣本量尿液的檢測(cè)需求也對(duì)尿液中代謝物的檢測(cè)方法提出新的要求。因此，建立同時(shí)檢測(cè)尿液中的多種OH-PAHs的簡(jiǎn)單快速的分析方法具有重要意義。

目前，分析尿液中OH-PAHs的前處理方法有固相萃取[11-12]、在線固相萃取[13]、液液萃取[14]、攪拌棒吸附萃取[15]等，它們常與液相色譜/熒光檢測(cè)器(LC/FLD)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)等檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合分析尿液中的多種OH-PAHs。盡管這些方法均能基本滿足檢測(cè)需求，但對(duì)于大樣本量尿液的檢測(cè)有一定的局限性。如固相萃取的有機(jī)溶劑用量大，在線固相萃取和攪拌棒吸附萃取需特定的實(shí)驗(yàn)裝置，成本較高等。2006年，Assadi等[16]開發(fā)了液液分散微萃取的方法提取水溶液中的痕量有機(jī)物，該方法具有操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。但由于需收集萃取管底部的萃取劑，當(dāng)樣品基質(zhì)較復(fù)雜時(shí)，收集過(guò)程帶來(lái)的雜質(zhì)干擾較多。因此，Yamini等[17]提出漂浮固化液液微萃取技術(shù)(DLLME-SFO)，該方法使用低毒性的萃取劑，在低溫下凝固后漂浮在萃取管表層，易于收集。目前，此方法已成功用于水[18]、化妝品[19]和尿液[20]等液體樣品基質(zhì)中痕量有機(jī)物的測(cè)定。本文首次使用DLLME-SFO方法萃取尿液中6種OH-PAHs，并結(jié)合液相色譜/熒光檢測(cè)器(LC/FLD)技術(shù)，測(cè)定了人體尿液中的2-羥基萘(2-NAP)、2-羥基芴(2-FLU)、2-羥基菲(2-PHE)、3-羥基菲(3-PHE)、4-羥基菲(4-PHE)和1-羥基芘(1-PYR)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

6種OH-PAHs標(biāo)樣：2-NAP、2-FLU、2-PHE、3-PHE、4-PHE和1-PYR(50 mg/L，溶于甲苯)均購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯混合酶(124400β-glucuronidase unit/mL,36010 sulfatase unit/mL)(美國(guó)Aldrich-Sigma公司)；氯化鈉、醋酸鈉和冰醋酸均為色譜純(99.97%，美國(guó)Tedia公司)；鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)；正十一醇、甲醇和乙腈均為色譜純(99.9%，德國(guó)Merck公司)；丙酮(農(nóng)殘級(jí),99.0%，美國(guó)Honeywell公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)，由銳思捷科學(xué)儀器有限公司的實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)制備。

安捷倫1200型高效液相色譜配備熒光-二極陣列管檢測(cè)器(HPLC/FLD,美國(guó)Agilent公司)；液相分析柱(Eclipse Plus-C18250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm;美國(guó)Agilent公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制將OH-PAHs單標(biāo)均溶于甲苯，質(zhì)量濃度均為50 mg/L，作為儲(chǔ)備液；使用微量取樣針取不同體積的OH-PAHs各單標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋至所需濃度。

1.2.2尿液的酶解尿液從冷藏室取出后放至室溫，3 000 r/min離心后，準(zhǔn)確移取上層清液5 mL，于10 mL具塞玻璃離心管中，加0.5 mL 1.0 mol/L的鹽酸和1.5 mL 0.5 mol/L醋酸鈉和醋酸的緩沖溶液，調(diào)節(jié)尿液的pH值為5.0；然后加20 μLβ-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶，混勻后置于恒溫振蕩箱中避光振蕩16 h，恒溫37 ℃，振蕩速度100 r/min。尿液的酶解使尿液中呈葡萄糖苷酸/硫酸酯結(jié)合態(tài)的代謝物水解形成羥基代謝物。

1.2.3漂浮固化分散液液微萃取酶解后的尿液加入20%的氯化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù))調(diào)節(jié)離子濃度。取混合均勻的萃取劑(40 μL 正十一醇)和分散劑(400 μL 丙酮)，快速注入已處理好的尿樣中，使之迅速形成三相渾濁的溶液，渦旋混勻后，離心5 min(3 000 r/min)，此時(shí)，密度較輕的正十一醇形成一微小液滴懸浮于液體表面，然后將樣品置于-20 ℃冰箱中冷凍約10 min，待正十一醇固化后，將其取出至進(jìn)樣細(xì)胞瓶中，室溫下溶解后進(jìn)液相色譜檢測(cè)。

1.2.4儀器分析液相色譜分析柱采用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)。采用甲醇(A)-水(B)梯度洗脫：0 ～5 min，60%A；5 ～14 min，60%～78%A；14 ～21 min，78%～85%A；21 ～30 min,85%～100%A；30 ～35 min,100%A；35 ～39 min，100%～60%A；39 ～45 min,60%A。流速為0.6 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。各目標(biāo)化合物的最佳熒光條件分別為(激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng))：2-NAP (227/355 nm)、2-FLU (272/336 nm)、2-PHE (254/369 nm)、3-PHE (250/358 nm)、4-PHE (246/371 nm)、1-PYR (239/392 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取劑的影響該漂浮固化分散液液微萃取的萃取劑需滿足以下條件：同時(shí)溶于分散劑和尿液，密度比水小，凝固點(diǎn)較高，熔點(diǎn)較低。文獻(xiàn)中常用高醇(如壬醇、癸醇、十一醇和正十二醇)作為萃取劑。正十一醇具有較低的水溶性，萃取過(guò)程中穩(wěn)定且具有很好的萃取效果[17-18,21]。因此本研究采用正十一醇作為萃取劑。

圖1 萃取劑體積對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effect of the volume of extraction solvent (1-undecanol) on peak areas of OH-PAHs

萃取劑的體積是影響化合物萃取效率和富集倍數(shù)的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)考察了正十一醇的體積分別為30、40、50、60、70 μL時(shí)對(duì)OH-PAHs萃取效率的影響,結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)正十一醇的體積在30 μL及以下時(shí)，固化的上浮溶劑體積太小，很難被收集。當(dāng)體積增加至40 μL時(shí)，各化合物的萃取效率明顯提升,當(dāng)繼續(xù)增加萃取劑的體積時(shí)，對(duì)PHE和PYR代謝物的萃取效果影響較小，而2-NAP和2-FLU的回收率有所增加，這可能由化合物的極性所致，2-NAP和2-FLU的極性大于PHE和PYR的代謝物，因此更易溶于正十一醇。另外，萃取劑的使用體積增大，目標(biāo)物的富集倍數(shù)減小，從尿液中帶來(lái)的基質(zhì)干擾也增大。因此選擇40 μL正十一醇為萃取劑。

2.1.2分散劑的影響分散劑須滿足以下條件：能與尿液和萃取劑形成三相互溶的乳濁狀液體，增加化合物和萃取劑的接觸面積，以利于尿液中OH-PAHs更好地溶于萃取劑中。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈和丙酮3種溶劑作為分散劑時(shí)對(duì)OH-PAHs萃取效率的影響(圖2)，發(fā)現(xiàn)丙酮作為分散劑的效果最好，這可能是由于丙酮的混溶性比其它兩種溶劑更好。

不同體積的分散劑影響三相乳濁狀液體的分散程度，分散劑太少不利于乳濁狀的形成，分散劑過(guò)多不利于OH-PAHs溶于萃取劑，因此實(shí)驗(yàn)考察了分散劑的體積分別為200、300、400、500、600 μL時(shí)對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)分散劑體積為400 μL時(shí)，各目標(biāo)物的萃取效果最好。

圖2 分散劑種類對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of the type of dispersive solvent on peak areas of OH-PAHs

2.1.3尿液pH值的影響通過(guò)調(diào)節(jié)尿液的pH值，增加或減少尿液中質(zhì)子的總量，優(yōu)化OH-PAHs在溶液中以分子或離子狀態(tài)存在的比例，可能有利于OH-PAHs的萃取。通過(guò)添加0.1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)尿液的pH值范圍為2.0 ～9.0，考察了pH值對(duì)萃取率的影響，結(jié)果如圖3所示。在pH 5.0時(shí)，即酶解后不調(diào)節(jié)尿液的pH值，萃取效果最佳。這與文獻(xiàn)中報(bào)道的用攪拌吸附萃取OH-PAHs的條件一致[15]。

圖3 尿液pH值對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of the pH value on peak areas of OH-PAHs

2.1.4鹽濃度的影響在尿液中添加鹽溶液增加尿液中的離子強(qiáng)度，有利于OH-PAHs以分子形式存在于尿液中，能更好地溶于萃取劑。實(shí)驗(yàn)考察了分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)添加20%的NaCl時(shí)，各化合物的萃取效果最好。

2.1.5萃取時(shí)間的影響在注入分散劑和萃取劑后，尿液迅速形成渾濁的液體，實(shí)驗(yàn)比較了萃取時(shí)間分別為0 (不靜置，直接離心)、2、5、10 min時(shí)對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響。結(jié)果顯示，萃取時(shí)間對(duì)化合物的萃取效率無(wú)影響。表明液液分散萃取過(guò)程非常迅速，在分散劑和萃取劑注入形成渾濁液體后，目標(biāo)物即被萃取出來(lái)。

2.2 方法評(píng)價(jià)

方法評(píng)價(jià)中所用的尿液基質(zhì)為采集的10例志愿者尿液等體積混合后的尿液。本方法的回收率采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行考察，由于混合尿液基質(zhì)中廣泛存在OH-PAHs，因此同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)基質(zhì)和空白基質(zhì)的前處理，每個(gè)加標(biāo)濃度進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，所有目標(biāo)化合物在10、50、250 μg/L加標(biāo)濃度下的回收率為70.4%～129%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～14.8%，方法的準(zhǔn)確度和精密度可滿足尿液中OH-PAHs的分析要求(表1)。其中2-NAP在10 μg/L加標(biāo)水平時(shí)，檢測(cè)的波動(dòng)稍大，這可能由于低濃度下的基質(zhì)干擾較大。分別以3倍信噪比計(jì)算得檢出限(LOD)為0.5 ～1.0 μg/L，以10倍信噪比計(jì)算得定量下限(LOQ)為1.5 ～3.0 μg/L，所有目標(biāo)化合物在2.5～150.0 μg/L范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 1～0.999 8(表2)。方法的靈敏度可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。

表1 不同加標(biāo)濃度下各OH-PAHs的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recoveries and RSDs of OH-PAHs in human urine spiked at different concentrations(n=6)

表2 DLLME-SFO方法檢測(cè)尿液中OH-PAHs的線性關(guān)系、重復(fù)性、檢出限與定量下限Table 2 Analytical performance data for determination of OH-PAHs in urine by DLLME-SFO method

xrepresents the response area,yrepresents the quality of analyte

2.3 與其他方法的比較

該方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的比較見表3，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的固相萃取[23-24]和自動(dòng)液液萃取[14]相比，該方法無(wú)需特殊的實(shí)驗(yàn)裝置，前處理時(shí)間短。雖然本方法的檢出限高于使用質(zhì)譜檢測(cè)方法的檢出限[14,23]，但熒光檢測(cè)器對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，價(jià)廉易得，有利于方法的推廣使用。該方式使用的萃取劑正十一醇僅需幾十微升，且?guī)缀鯚o(wú)毒，對(duì)環(huán)境友好，減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康危害?？傊啾扔谖墨I(xiàn)方法，該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，可滿足尿液中OH-PAHs的檢測(cè)需求；易于推廣，對(duì)大樣本量尿液中的OH-PAHs檢測(cè)具有應(yīng)用前景。

表3 本研究方法和已報(bào)道方法的比較Table 3 Comparison of various analytical methods for the detection of OH-PAHs in urine

a:6-Chr represents 6-bydroxychrysene

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

隨機(jī)采集實(shí)驗(yàn)室17位志愿者的尿液樣本，每個(gè)樣本約10 mL，使用本方法進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)化合物的濃度使用肌酐值進(jìn)行校正(表4)。除了4-PHE的檢出率僅為58%，其它化合物的檢出率均達(dá)到80%以上。2-NAP是最主要的檢出化合物，最高濃度達(dá)到16.78 μmol/mol肌酐。證實(shí)該方法可用于人體尿液中OH-PAHs的檢測(cè)。

表4 實(shí)際人體尿液中OH-PAHs的濃度Table 4 Concentrations of OH-PAHs in human urine(n=17) (μmol/mol肌酐)

3 結(jié) 論

本文建立了漂浮固化分散液液微萃取的方法，富集人體尿液中多種PAHs代謝產(chǎn)物，并通過(guò)液相色譜/熒光檢測(cè)器(LC/FLD)進(jìn)行檢測(cè)。該方法顯示了很好的萃取效果，操作簡(jiǎn)單快速，可滿足人體尿液中6種羥基多環(huán)芳烴的分析需求，為流行病學(xué)上大樣本量尿液中OH-PAHs的檢測(cè)提供了參考方法。

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本研究采用 UPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型大鼠腦脊液樣品中 5-羥色胺和 5-HIAA 的濃度，該方法簡(jiǎn)單、快速，可用于腦脊液中 5-羥色胺和 5-HIAA 的含量測(cè)定。

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