程家興，趙起越，李令軍，杜振霞*，郭巧珍,3，沈正超

(1.北京化工大學(xué) 理學(xué)院，北京 100029；2.北京市環(huán)境保護(hù)檢測(cè)中心，北京 100048；3.北京市疾病預(yù)防控制中心 北京市食物中毒溯源診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013)

養(yǎng)殖業(yè)普遍存在以獸用抗生素治療各種因細(xì)菌真菌感染產(chǎn)生的疾病的現(xiàn)象[1]，部分企業(yè)甚至在動(dòng)物飼料中直接添加獸用抗生素以達(dá)到增產(chǎn)的目的[2-3]。2012年美國和韓國開始規(guī)范飼料中抗生素的使用[4],但我國并沒有嚴(yán)格的立法限制，導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素問題嚴(yán)重[5]。水產(chǎn)養(yǎng)殖直接使用抗生素會(huì)導(dǎo)致周圍水環(huán)境受到污染，并且抗生素在不同環(huán)境中的化學(xué)行為也不一致[6]。Pomati等[7]的研究結(jié)果顯示，水體中四環(huán)素或紅霉素等抗生素會(huì)嚴(yán)重抑制淡水單細(xì)胞藻類的生長(zhǎng)。常用的氯霉素可引起再生障礙性貧血，大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等具有抗原性，可引起人體的過敏反應(yīng)[8]，直接影響人類以及其它動(dòng)植物用水安全。

抗生素的常用檢測(cè)方法有高效液相色譜-紫外/熒光(HPLC-DAD/FLD)[9-10]法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[11-13]法等。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]使用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF MS)對(duì)牛奶中的抗生素進(jìn)行分析,但無法檢測(cè)到實(shí)際樣品中的痕量物質(zhì)(ng/L)。

而對(duì)北方地區(qū)養(yǎng)魚業(yè)中抗生素的使用情況及其對(duì)周圍地表水環(huán)境影響的研究，目前幾乎沒有相關(guān)文獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)首次使用UPLC-Q-TOF MS結(jié)合UPLC-MS/MS對(duì)養(yǎng)魚河水中抗生素進(jìn)行快篩和痕量分析(ng/L)，彌補(bǔ)了TOF靈敏度不高、定量準(zhǔn)確度較差,以及三重四極桿質(zhì)譜MRM模式只能對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析的缺陷。與地下水及自來水相比，養(yǎng)魚河水成分復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)更加嚴(yán)重。與其他文獻(xiàn)報(bào)道[15-17]相比，本實(shí)驗(yàn)著重優(yōu)化了水樣的前處理?xiàng)l件，在富集凈化4大類15種抗生素的同時(shí)具備較高的回收率及較小的基質(zhì)效應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-XS 三重四極桿質(zhì)譜儀、Waters Xevo G2-S 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國Waters 公司)；12位防交叉污染固相萃取儀(美國Supelco公司)；MTN-2800D 12位手動(dòng)氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；FE20 pH 計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL，美國 Waters公司)。

甲醇、乙腈為色譜純(美國 Fisher 公司)；甲酸為色譜純(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；鹽酸為分析純(北京化工廠)；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

0.45 μm玻璃纖維濾膜、0.22 μm尼龍濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取1 mg(精確至0.01 mg) 15種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用含0.1%甲酸的甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液保存于-20 ℃的冰箱中，使用時(shí)以初始流動(dòng)相稀釋。

1.3 樣品采集

在養(yǎng)魚池及其附近河流設(shè)置采集點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)采集2.5 L河水于褐色玻璃瓶中密封避光保存，在4 ℃下冷藏，24 h內(nèi)完成測(cè)定。

1.4 樣品前處理

1.4.1水樣品過濾在室溫下，水樣用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾后準(zhǔn)確量取500 mL于1 L玻璃燒杯中，用鹽酸調(diào)至pH 4.0，加入0.5 g Na2EDTA，充分混勻，待上柱凈化、富集。

1.4.2固相萃取依次用6.0 mL甲醇、6.0 mL超純水(pH 4.0)活化HLB固相萃取柱。樣品以約3 mL/min的流速通過柱子，用6 mL超純水淋洗，真空泵抽干。干燥后，分別用4 mL甲醇和4 mL含0.1%甲酸的甲醇洗脫。將洗脫液收集于10 mL離心管中，氮?dú)獯祾咧两桑缓笥贸跏剂鲃?dòng)相復(fù)溶至0.50 mL，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件色譜柱：BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國 Waters 公司)；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A為甲醇；B為 0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液。

ESI正離子模式梯度洗脫程序(流速0.35 mL/min)：0～1.00 min，5%A；1.00～2.00 min，5%～20%A；2.00～6.50 min，20%～34%A；6.50～7.00 min，34%～95%A；7.00～7.50 min，95%A；7.50～8.00 min，95%～100%A；8.00～8.30 min，100%A；8.30～8.40 min，100%～5%A；8.40～10.00 min，5%A。

ESI負(fù)離子模式梯度洗脫程序(流速0.30 mL/min)：0～1.00 min，5%A；1.00～2.00 min，5%～40%A；2.00～5.00 min，40%～45%A；5.00～5.10 min，45%～95%A；5.10～5.50 min，95%～5%A；5.50～7.00 min，5%A。

1.5.2飛行時(shí)間質(zhì)譜儀條件電離模式：ESI+/ESI-；檢測(cè)模式：MSE；毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔電壓：30 V，碰撞能量20～40 eV；LockSpray：m/z556.2776，每30 s切換一次進(jìn)行質(zhì)量數(shù)校正。

1.5.3三重四極桿質(zhì)譜儀條件電離模式：ESI+/ESI-；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

表1 15種抗生素的質(zhì)譜條件Table 1 MS/MS conditions of the 15 antibiotics

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1固相萃取柱的選擇結(jié)合文獻(xiàn)[13,18]的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)比較了HLB固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，后者對(duì)四環(huán)素類、磺胺類的回收率均遠(yuǎn)低于前者，例如與Sep-Pak C18固相萃取柱相比，TC在HLB固相萃取柱上回收率提高了30%，SDZ在HLB固相萃取柱上回收率提高了21%。而對(duì)于氯霉素類和喹諾酮類抗生素，HLB固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱的回收率相差不大。

進(jìn)一步對(duì)6 mL/500 mg和3 mL/60 mg兩種規(guī)格的HLB固相萃取柱進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)6 mL/500 mg對(duì)磺胺類的回收率更高，而且與3 mL/60 mg 相比TC回收率從原來的45%提高到65.3%，而DC則從原來的70%提高到82.5%。兩種規(guī)格HLB柱對(duì)喹諾酮類和氯霉素類的回收率無太大差異。原因是上樣體積大時(shí)3 mL/60 mg規(guī)格的固相萃取柱容易過載。因此選用體積容量較大的6 mL/500 mg的HLB固相萃取小柱。

2.1.2水樣pH值的調(diào)節(jié)部分抗生素樣品在堿性環(huán)境中不能穩(wěn)定存在，用鹽酸調(diào)節(jié)樣品pH值至2.0和4.0，分別比較原樣品與pH 2.0和pH 4.0時(shí)的回收率。將pH值調(diào)至4.0時(shí)，磺胺類的回收率可從不調(diào)節(jié)pH值的61.2%增至70.9%，四環(huán)素類和喹諾酮類的回收率也均有明顯提高，而當(dāng)pH值調(diào)至2.0時(shí)，一些喹諾酮類抗生素的回收率略有下降。pH值對(duì)氯霉素類抗生素的影響不大。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇調(diào)節(jié)水樣品pH值為4.0。

2.1.3上樣體積的選擇實(shí)驗(yàn)比較了500 mL和1 000 mL上樣體積的回收率，發(fā)現(xiàn)使用500 mL上樣體積時(shí)，氯霉素類和磺胺類抗生素的回收率略有提高，喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的回收率明顯提高，例如上樣體積從1 000 mL減少至500 mL時(shí)，NOR從30%提高到73.6%。上樣體積太大可能使水樣品中雜質(zhì)吸附在固相萃取柱填料上或超載，導(dǎo)致喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素回收率下降，因此實(shí)驗(yàn)選用的上樣體積為500 mL。

2.1.4洗脫溶液的選擇實(shí)驗(yàn)比較了純甲醇和含0.1%甲酸甲醇的洗脫效果。結(jié)果顯示，以純甲醇洗脫時(shí)，DC、TC、NOR、ENR的回收率比用0.1%甲酸甲醇洗脫時(shí)平均低10%左右。但純甲醇洗脫時(shí)CIP和OTC的回收率略高于0.1%甲酸甲醇洗脫時(shí)的回收率。氯霉素類和磺胺類抗生素的回收率則差別不大。綜合考慮使用純甲醇和0.1%甲酸甲醇分別進(jìn)行洗脫，以提高回收率。

2.1.5洗脫體積的選擇分別選用3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸甲醇、4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇、5 mL甲醇和5 mL 0.1%甲酸甲醇進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇與5 mL甲醇和5 mL 0.1%甲酸甲醇的回收率差別不大，且對(duì)喹諾酮類和磺胺類抗生素的回收率均高于3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸甲醇，例如使用3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸甲醇洗脫時(shí)OFL的回收率為59%，使用4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇洗脫時(shí)回收率提高到70.6%。故選用4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇進(jìn)行洗脫處理。

2.2 基于UNIFI軟件建立抗生素?cái)?shù)據(jù)庫

利用ChemSpider專業(yè)化學(xué)數(shù)據(jù)庫整理生活中常用的103種抗生素的mol文件，將其導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件中。建立包含名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式、精確質(zhì)量數(shù)、特征離子、中性丟失、可能的MS/MS裂解規(guī)律等信息的 UNIFI抗生素?cái)?shù)據(jù)庫。利用該數(shù)據(jù)庫對(duì)經(jīng)UPLC-Q-TOF MS分析后的水樣數(shù)據(jù)進(jìn)行快速篩查。篩查條件為質(zhì)量偏差小于10 mDa。由于缺少全部的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品在色譜柱的保留時(shí)間數(shù)據(jù)，在篩查完成后，對(duì)篩查到的抗生素，購買標(biāo)準(zhǔn)品后通過三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。

2.3 儀器條件的優(yōu)化

2.3.1色譜條件優(yōu)化甲酸是在ESI+模式下增強(qiáng)被測(cè)物質(zhì)離子化程度的常用試劑，同時(shí)能夠有效改善峰形，使峰形更加尖銳。因此選擇含0.1%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相B。由于本實(shí)驗(yàn)的抗生素用甲醇溶液配制，因此選用甲醇作為流動(dòng)相A。

2.3.2三重四極桿質(zhì)譜條件優(yōu)化抗生素標(biāo)準(zhǔn)品在全掃描模式下直接進(jìn)樣，以從小到大的方式改變錐孔電壓，由產(chǎn)生的峰高判斷每種抗生素最合適的錐孔電壓并確定母離子的相對(duì)分子質(zhì)量，經(jīng)子離子掃描選擇最優(yōu)的兩對(duì)子離子的質(zhì)量數(shù)及最佳碰撞能量。為了進(jìn)一步提高反應(yīng)的靈敏度，采用多時(shí)段多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。15種抗生素的色譜圖如圖1所示。

2.4 線性范圍與檢出限

將“1.2”配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液用初始流動(dòng)相稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制15種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)。除了金霉素的線性范圍為1.0～50 μg/L，其余抗生素均在0.03～50 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.990。在空白水樣中添加15種抗生素，經(jīng)過“1.4”前處理方法后得到不同抗生素的方法檢出限(MDL，S/N≥3)，見表2。15種抗生素的檢出限為0.01～0.3 ng/L。

將本方法與其他文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行比較(表3)，結(jié)果表明，相較于HPLC，UPLC在保證抗生素分離效果的情況下所需分析時(shí)間更短。相同柱長(zhǎng)下，本實(shí)驗(yàn)的分析時(shí)間較短。本方法對(duì)各類抗生素的檢出限均低于或接近其他方法的檢出限，且靈敏度較高。

AnalyteRegressionequationCorrelationcoefficient(r)Linearrange(μg/L)MDL(ng/L)CAPy=5666 43x-4557 350 9990 03～500 01THIy=1825 85x-1301 20 9980 03～500 01FLOy=3405 45x-3387 60 9990 03～500 01SDZy=6483 98x-4494 580 9990 03～500 01SMZy=11095 2x-5280 250 9990 03～500 01TMPy=62495 8x-8666 390 9980 03～500 01NORy=22454 6x-21480 70 9900 03～500 1CIPy=15773x-14557 40 9920 03～500 1ENRy=10256 7x+1632 870 9900 03～500 1OFLy=25211 3x-17702 30 9920 03～500 1TCy=8613 77x-6422 760 9900 03～500 1DCy=15175x+27165 50 9900 03～500 1OTCy=6453 05x-4101 340 9900 03～500 1CTCy=2082 68x-186 90 9931 0～500 3

y：peak area of the target compound;x：mass concentration(μg/L)

表3 本方法與其他方法的比較Table 3 Comparison of this method with other methods

*untested

2.5 回收率與精密度

用河水上游的500 mL水庫水作為空白水樣，分別添加10、30 ng 的1 g/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平做3個(gè)平行，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，15種抗生素的回收率為61.0%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)為4.6%～14.0%，日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.8% ～ 8.7%和7.2% ～9.8%。

表4 15種抗生素的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 4 Average spiked recoveries and relative standard deviation(RSDs) for the 15 antibiotics at 2 spiked levels(n=3)

2.6 實(shí)際樣品分析

表5 水樣的初篩結(jié)果Table 5 The detection data of UPLC-TOF MS

the sample numbers were the same as those in Table 6

2.6.1利用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的快篩利用本研究建立的UPLC-Q-TOF MS方法對(duì)10個(gè)采樣點(diǎn)的水樣進(jìn)行了分析，水樣經(jīng)過“1.4”方法前處理后，用建立的抗生素?cái)?shù)據(jù)庫對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行快篩，結(jié)果如表5，樣品編號(hào)與表6采樣點(diǎn)編號(hào)相同。

2.6.2實(shí)際樣品的定性定量分析利用本研究建立的UPLC-MS/MS方法對(duì)10個(gè)采樣點(diǎn)的水樣進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，氯霉素類和喹諾酮類相較于其它類抗生素的檢出率更高，而且在部分采樣點(diǎn)檢出的濃度較高(表6)。對(duì)比表5，發(fā)現(xiàn)初篩的結(jié)果準(zhǔn)確性較高，初篩的15種抗生素在實(shí)際樣品中均有檢出，其中含量較低的抗生素使用靈敏度較高的三重四極桿質(zhì)譜才能準(zhǔn)確定性定量。

表6 10個(gè)采樣點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 6 The detection data of 10 sampling points (ng/L)

nd：lower than the LOD

3 結(jié) 論

有關(guān)北方地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中獸用抗生素的使用情況研究較為缺乏，本研究前期結(jié)合UNIFI軟件建立的數(shù)據(jù)庫使用UPLC-Q-TOF MS對(duì)水樣中的抗生素進(jìn)行快速篩查，有效避免了使用三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)抗生素的盲目性。再使用UPLC-MS/MS的MRM模式進(jìn)一步準(zhǔn)確定性和定量養(yǎng)魚河水中篩查到的4類(喹諾酮類、氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類)15種抗生素，其中氯霉素類和喹諾酮類抗生素的檢出率與檢出濃度較高。優(yōu)化之后的固相萃取方法有效避免了樣品的基質(zhì)效應(yīng)。該方法靈敏度較高，重復(fù)性好，可在10 min內(nèi)快速檢測(cè)河流等復(fù)雜水環(huán)境中的抗生素。

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