何山文 雷瓊 馬立安

( 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)( 湖北省荊州市文物保護(hù)中心，湖北 荊州 434020)( 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

傳統(tǒng)的真菌鑒定多以形態(tài)學(xué)為依據(jù)，存在不確定性，對(duì)于少見真菌診斷困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，真菌可鑒定至種的水平。目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)于難鑒定的真菌多采用PCR擴(kuò)增結(jié)合測(cè)序分析的方法[1]，該法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，而進(jìn)行PCR擴(kuò)增首先需要提取真菌基因組DNA，因此探索出快速、高效、安全的真菌基因組DNA抽提法顯得尤為重要。

目前提取真菌DNA的方法較多，包括十六烷基三甲基溴化銨( CTAB)法[2]、十二烷基磺酸鈉( SDS)法[3]、氯化芐法[4]等，但不同真菌類群適用的方法可能存在一定差異[5]。本研究通過改良的CTAB法和SDS-CTAB法提取真菌子實(shí)體DNA并進(jìn)行比較，以期獲得一種高效、高質(zhì)地提取真菌子實(shí)體DNA的方法，應(yīng)用于野生蕈菌的分類鑒定。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品

供試野生蕈菌4#、6#、8#、16#、18#、19紅、22#、26#、30B#、34#、36#、37#、48#、51#、60#、61#等樣品在2012年8月采集于英國諾里奇東英吉利亞大學(xué)校區(qū)附近，樣品子實(shí)體在恒溫鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干，粉碎保存于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。其中DNA提取方法的比較試驗(yàn)所用樣品為4#樣品。

1.1.2主要試劑

Taq酶、Goldview核酸染料、PCR相關(guān)試劑和DL2000 DNA Marker等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；上游引物ITS5和下游引物ITS4，由生工生物工程( 上海)股份有限公司合成。

2% CTAB提取液：20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA( pH 8.0)，100mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

1% CTAB沉淀液：10g/L CTAB，10mmol/L EDTA( pH 8.0)，50mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

2% SDS提取液：20g/L SDS，50mmol/L EDTA( pH 8.0)，1.4mol/L NaCl ，50mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

5% CTAB沉淀液：50g/L CTAB，1.0mol/L NaCl，50mmol/L EDTA( pH 8.0)，250mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA( pH 8.0)。

1.2　方法

1.2.1DNA提取方法

1)CTAB法參照文獻(xiàn)[5]的方法略加改動(dòng)。具體步驟為：①稱取4#樣品干燥粉末0.15g于預(yù)冷的研缽( 研缽于-80℃冰箱過夜放置)中，加入于65℃預(yù)熱的2% CTAB提取液快速碾磨成粘稠糊狀，然后將碾磨好的液體轉(zhuǎn)入50mL圓底離心管，提取液總共用3mL。②將裝有樣品的離心管放入65℃恒溫?fù)u床振蕩1h，以使其充分裂解。③加入等體積3mL氯仿/異戊醇( 24∶1)，振蕩混合均勻，4℃12000r/min離心10min，取上清，轉(zhuǎn)移到干凈50mL圓底離心管中，記下轉(zhuǎn)移上清體積。④加入1.4倍于上清體積的1% CTAB沉淀液，混合均勻，室溫沉淀30min。12000r/min離心10min，( 可看到微量沉淀)吸走部分上清，將剩下的( 約2mL)轉(zhuǎn)移到2個(gè)1.5mL EP管中，12000r/min離心10min，棄上清。⑤加450μL無菌水，溶解混勻，再加900μL冷無水乙醇置4℃沉淀30min，12000r/min離心10min，棄上清。⑥洗滌DNA：用300μL 75%乙醇渦旋洗滌，12000r/min離心15min，棄上清，再加入無水乙醇洗滌，棄上清，干燥30min。⑦每管加入30μL TE緩沖液充分溶解DNA后在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2)SDS-CTAB法參照文獻(xiàn)[6]的方法略加改動(dòng)。具體步驟為：①稱取4#樣品粉末0.15g于預(yù)冷的研缽( 研缽于-80℃冰箱過夜放置)中，加入于65℃預(yù)熱的2% SDS提取液快速碾磨成粘稠糊狀，將碾磨好的液體轉(zhuǎn)入50mL圓底離心管，提取液總共用3.5mL。②將裝有樣品的離心管放入65℃恒溫?fù)u床振蕩1h。③12000r/min離心10min，取上清，轉(zhuǎn)移到干凈50mL圓底離心管中，記下轉(zhuǎn)移上清體積。④加入等體積的5% CTAB沉淀液，混合均勻，放入65℃恒溫?fù)u床振蕩10min。加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇( 25∶24∶1)，混勻，12000r/min離心10min，取上清，轉(zhuǎn)移到干凈50mL圓底離心管中，記下轉(zhuǎn)移上清體積。⑤加入等體積的氯仿/異戊醇( 24∶1)，混勻，12000r/min離心10min，可看到清晰界面，取上清，轉(zhuǎn)移到干凈50mL圓底離心管中，記下轉(zhuǎn)移上清體積。⑥加入等體積異丙醇，混勻，置-20℃沉淀30min。12000r/min離心15min，去掉部分上清，將剩下的( 約2mL)轉(zhuǎn)移到2個(gè)1.5mL離心管中，12000r/min離心10min，棄上清。⑦洗滌DNA：加入300μL 75%乙醇至離心管中，用手指輕彈離心管壁，顛倒混勻，溫和洗滌，12000r/min離心15min，棄上清，再加入無水乙醇洗滌，棄上清，在通風(fēng)干凈的地方干燥30min。⑧每管加入30μL TE緩沖液，渦旋溶解。

1.2.2DNA樣品的檢測(cè)

0.8%瓊脂糖凝膠電泳。電泳緩沖液為1×TAE緩沖液，吸取10μL TE溶解的DNA與適量的6×loading buffer上樣緩沖液吹吸混勻，電壓80V，30min至DNA跑到膠體2/3時(shí)，將膠體拿出放到凝膠成像室成像，并保存電泳圖片。

1.2.3PCR擴(kuò)增

PCR引物為通用引物：上游引物ITS5( 5’-GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG-3’)和下游引物ITS4( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。

PCR反應(yīng)體積為25μL，其體系為2.5μL 10×Taq Buffer，2.5μL dNTPs( 2mmol/L)，0.5μL Taq( 2U/μL)，0.5μL上游引物( 10μmol/L)，0.5μL下游引物( 10μmol/L)，16.5μL ddH2O，2μL DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物和Mark上樣量均為5μL，電泳結(jié)果于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.4野生蕈菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

采用比較分析得到的優(yōu)勢(shì)DNA提取方法，提取16種供試野生蕈菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和BLAST比對(duì)，列鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分子系統(tǒng)鑒定[7]。并采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2　結(jié)果與分析

1～2:CTAB法； 3～4:SDS-CTAB法圖1　2種方法提取的DNA電泳圖

1～2:CTAB法提取DNA不稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物；M:Marker 3:SDS-CTAB法提取DNA稀釋10倍擴(kuò)增產(chǎn)物4:SDS-CTAB法提取DNA稀釋100倍擴(kuò)增產(chǎn)物圖2　2種方法提取DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.1　2種方法提取的DNA電泳結(jié)果比較

2種方法提取的DNA電泳圖如圖1所示。由圖1可知，用CTAB法提取的DNA電泳條帶( 1～2泳道)亮度低，顯示DNA量較少，SDS-CTAB法得到的電泳條帶( 3～4泳道)亮度高且完整，顯示DNA產(chǎn)量較高且質(zhì)量好，但有大量的RNA。這表明，2種方法比較，SDS-CTAB方法提取的DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好。

2.2　2種方法提取DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物比較

選擇ITS5/ITS4為引物，以CTAB法提取的DNA

作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，SDS-CTAB法提取的DNA分別稀釋10倍和100倍后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。2種方法提取的DNA都能擴(kuò)增出清晰可辨的條帶而且沒有雜帶，說明2種方法提取的DNA都適合用于PCR分析研究。但圖2結(jié)果顯示，SDS-CTAB法提取的DNA用于PCR擴(kuò)增需要模板用量少( 1%，稀釋100倍)，可應(yīng)用于后續(xù)蕈菌子實(shí)體DNA鑒定。

2.3　SDS-CTAB提取DNA方法的應(yīng)用

對(duì)采集到的16個(gè)野生蕈菌樣品采用SDS-CTAB法提取DNA并進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)，鑒定為13個(gè)種，其中有4個(gè)樣品為同一種菌( 硫磺菌)。13個(gè)樣品序列提交到NCBI，獲得登錄號(hào)，具體結(jié)果如表1所示，其類群結(jié)構(gòu)如圖3所示。結(jié)果表明，采用SDS-CTAB法所提取的DNA可以作為模板用于PCR擴(kuò)增、測(cè)序和分類鑒定等后續(xù)研究。

表1　野生蕈菌分子鑒定結(jié)果匯總

圖3　13種野生蕈菌類群結(jié)構(gòu)

3　討論與結(jié)論

3.1　討論

基因組的產(chǎn)率和純度對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR、雜交等有重要影響。因此，DNA的提取是至關(guān)重要的一步。CTAB作為一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，去除菌體細(xì)胞壁中的多糖、酚復(fù)合物，與核酸結(jié)合形成復(fù)合物，其溶解度隨鹽溶液的濃度變化，可作為真菌DNA提取的優(yōu)良溶劑[8]，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖和酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來[9]。SDS在高溫( 55～65℃)條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析和蛋白變性，與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物，釋放出核酸[10]。

同一樣品采用不同方法或不同樣品采用相同方法提取DNA的純度和提取率有很大差異[11]。本研究采用CTAB和SDS-CTAB提取食用菌DNA得到的質(zhì)量相近，稱取同樣重量的樣品，SDS-CTAB提取到的DNA濃度比CTAB方法提取的要高。2種方法首先都是用預(yù)熱的裂解液對(duì)樣品進(jìn)行碾磨，裂解之后CTAB方法用氯仿/異戊醇( 24∶1)處理離心，預(yù)先去除了部分蛋白質(zhì)，這一步操作的不同導(dǎo)致2種方法結(jié)果的優(yōu)劣差異，因?yàn)樵谌コs質(zhì)的同時(shí)會(huì)帶走一部分DNA，造成損失。使得CTAB方法提取的DNA量偏少，而SDS-CTAB方法提取的DNA量多。

真菌多樣性豐富，基于某一種真菌提取DNA得到的結(jié)論并不一定適用于其他真菌[4]。SDS-CTAB法提取的DNA成功用于13種野生蕈菌的鑒定，表明SDS-CTAB法提取的DNA能夠滿足許多野生蕈菌進(jìn)行分子鑒定提取基因組DNA的需要。

3.2　結(jié)論

1)CTAB法和SDS-CTAB法都可提取真菌子實(shí)體DNA，并可直接用于PCR擴(kuò)增分析。

2)SDS-CTAB法提取DNA產(chǎn)量高質(zhì)量好，操作也簡(jiǎn)便，推薦應(yīng)用于蕈菌DNA分子生物學(xué)中研究。

3)SDS-CTAB法可成功用于13種蕈菌的分子鑒定，并建立類群結(jié)構(gòu)圖。

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