于振海，安麗，朱樹(shù)人 孟慶磊，朱永安

山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013)

大鱗鲃(Barbuscapito)屬鯉科(Cyprinidae)鲃亞科(Barbinae)鲃屬(Barbodes)，主要分布于西亞的里海和咸海水域，是當(dāng)?shù)孛F的大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，它具有耐鹽堿、食性廣、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性[1～5]。2003年我國(guó)引入大鱗鲃在低洼鹽堿地水域進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。2008年成功進(jìn)行了人工繁殖，并開(kāi)展了人工養(yǎng)殖條件下的繁育、胚胎發(fā)育以及耐鹽堿等研究[6～8]。目前關(guān)于大鱗鲃胚胎發(fā)育的研究較少，因此有必要因此對(duì)胚胎發(fā)育各個(gè)階段特點(diǎn)進(jìn)一步觀察研究。2017年筆者所在課題組在山東開(kāi)展了大鱗鲃引進(jìn)及人工繁育試驗(yàn)，并對(duì)大鱗鲃胚胎發(fā)育及仔魚(yú)形態(tài)進(jìn)行了研究，以期為大鱗鲃的人工繁殖提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　親魚(yú)來(lái)源

試驗(yàn)親魚(yú)為臨沂市魚(yú)胖胖專業(yè)合作社蓄養(yǎng)的2～3齡大鱗鲃，產(chǎn)卵前對(duì)親魚(yú)進(jìn)行強(qiáng)化培育。在山東地區(qū)親魚(yú)產(chǎn)卵季節(jié)為每年5月份，水溫達(dá)到20℃以上時(shí)進(jìn)行人工繁殖。

1.2　產(chǎn)卵時(shí)間和地點(diǎn)

2017年6月3日在山東省淡水漁業(yè)研究院進(jìn)行大鱗鲃的人工繁殖和胚胎發(fā)育觀察。

1.3　設(shè)備和工具

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備和工具為NIKON體視變焦顯微鏡(SMZ1500)、NIKON D5100數(shù)碼相機(jī)、充氣泵和撈卵工具。

1.4　孵化條件

通過(guò)人工干法授精后取約300枚受精卵在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察。實(shí)驗(yàn)室孵化水溫( 26±0.5)℃，pH 7.8,受精卵孵化過(guò)程中用充氣泵充氣。

1.5　胚胎發(fā)育觀察記錄方法

胚胎發(fā)育早期的受精卵至囊胚期，需每15min在顯微鏡在觀察記錄1次；囊胚期到孵化期，每1h觀察記錄1次；每次記錄10枚卵。胚胎發(fā)育各時(shí)期時(shí)間的確認(rèn)以鏡檢約50%的胚胎出現(xiàn)相應(yīng)分期特征為標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)育時(shí)間的劃分參考硬骨魚(yú)類(lèi)的胚胎發(fā)育分期方法[9]。

2　結(jié)果與分析

2.1　胚胎發(fā)育

2.1.1受精卵階段

2017年6月3日8：40獲得大鱗鲃卵，卵子為灰白色，卵直徑( 1.3±0.1)mm。隨后進(jìn)行人工授精，授精結(jié)束移入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行觀察。大鱗鲃卵沉于水底，具有弱粘性，人工授精后，在靜置的水面會(huì)聚集黏合在一起，流水輕沖洗，即可散開(kāi)。受精卵吸水膨大，約1h30min后卵徑達(dá)4.5mm(圖1-1)。受精卵卵質(zhì)逐漸向動(dòng)物極集中，受精約1h后形成胚盤(pán)，側(cè)面觀察可見(jiàn)胚盤(pán)如帽狀隆起( 圖1-2)。

1.受精卵；2.胚盤(pán)隆起；3.2細(xì)胞期；3.4細(xì)胞期；4.8細(xì)胞期；5.16細(xì)胞期；6.32細(xì)胞期；7.多細(xì)胞期；9.高囊胚期；10.低囊胚期；11.原腸胚早期；12原腸胚中期；13.原腸胚晚期；14；神經(jīng)胚期；15.體節(jié)出現(xiàn)期；16.眼基出現(xiàn)期；17.眼囊出現(xiàn)期；18.尾芽期；19.晶體出現(xiàn)期；20.肌肉效應(yīng)期；21.胚體轉(zhuǎn)動(dòng)期；22.心跳期；23.出膜前期圖1　大鱗鲃胚胎發(fā)育過(guò)程

2.1.2卵裂期

卵受精1h30min后，胚盤(pán)分裂成2個(gè)大小相等的細(xì)胞，受精卵進(jìn)入2細(xì)胞期( 圖1-3)；受精1h48min后，開(kāi)始第2次分裂，細(xì)胞分裂面與第1次分裂面相垂直，形成4個(gè)大小相等的細(xì)胞，進(jìn)入4細(xì)胞期( 圖1-4)；受精卵繼續(xù)分裂，2h后發(fā)生第3次分裂，進(jìn)入8細(xì)胞期( 圖1-5)，2h20min后發(fā)生第4次分裂進(jìn)入16細(xì)胞期( 圖1-6)，3h后發(fā)生第5次分裂，進(jìn)入32細(xì)胞期( 圖1-7)；隨著分裂次數(shù)的增加，細(xì)胞明顯變小變多，形成整個(gè)細(xì)胞團(tuán)，3h40min后進(jìn)入多細(xì)胞期( 圖1-8)。隨著卵裂的繼續(xù)，胚胎表面分裂球變得很小且平滑，細(xì)胞界限越來(lái)越不清楚，受精4h20min后，胚盤(pán)與卵黃之間形成囊胚腔，囊胚中部明顯隆起，呈高帽狀，進(jìn)入高囊胚期( 圖1-9)；此后，隆起的部分開(kāi)始變低，受精9h30min后，胚囊邊緣變薄，細(xì)胞開(kāi)始下包，進(jìn)入低囊胚期( 圖1-10)。

2.1.3原腸期

在囊胚階段后期，囊胚邊緣的細(xì)胞增多，這些邊緣的細(xì)胞開(kāi)始沿卵黃外圍向植物極方向遷移、延伸和下包，逐漸將卵黃囊包裹其中。囊胚細(xì)胞在赤道面附近某一位置發(fā)生內(nèi)卷，胚胎進(jìn)入原腸早期( 圖1-11)；胚層繼續(xù)下包，12h38min后胚層下包1/2，進(jìn)入原腸中期( 圖1-12)；13h58min后胚層下包3/4，胚胎發(fā)育至原腸末期( 圖1-13)

2.1.4神經(jīng)胚期

受精15h21min后，囊胚層逐漸包裹整個(gè)卵黃，胚胎開(kāi)始出現(xiàn)增厚的神經(jīng)板，神經(jīng)板中線出現(xiàn)柱狀的脊索，進(jìn)入神經(jīng)胚期( 圖1-14)，出現(xiàn)胚體輪廓。

2.1.5器官形成期

受精19h19min后在胚體中部出現(xiàn)肌節(jié)，進(jìn)入體節(jié)出現(xiàn)期( 圖1-15)；受精20h23min后神經(jīng)板前端隆起，顯示出頭部的位置，并向外突出一對(duì)腎形的團(tuán)塊，形成眼原基( 圖1-16)；受精21h8min后胚體繞卵黃囊過(guò)半，胚體頭部出現(xiàn)層橢圓形眼囊，進(jìn)入眼囊期( 圖1-17)；隨著器官繼續(xù)分化，肌節(jié)繼續(xù)增多，此時(shí)頭和尾已能清楚分辨，23h可見(jiàn)胚體尾部突起，進(jìn)入尾芽出現(xiàn)期( 圖1-18)；受精29h15min后，視囊內(nèi)可見(jiàn)折光性強(qiáng)的透明晶狀體，進(jìn)入晶體形成期( 圖1-19)；胚體持續(xù)發(fā)育，頭部逐漸膨大，尾芽繼續(xù)變長(zhǎng)，受精31h21min后出現(xiàn)明顯顫抖，擺動(dòng)，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期( 圖1-20)；隨著尾芽繼續(xù)延長(zhǎng)，受精27h43min后，尾芽擺動(dòng)幅度大幅增加，能夠帶動(dòng)整個(gè)胚體轉(zhuǎn)動(dòng)，進(jìn)入胚體轉(zhuǎn)動(dòng)期( 圖1-21)；受精35h24min后心臟開(kāi)始輕微跳動(dòng)，胚體顫動(dòng)頻率增加，進(jìn)入心跳期( 圖1-22)。

2.1.6出膜階段

1.出膜期；2.循環(huán)期；3.體色素出現(xiàn)期；4.鰾形成期；5.腸管建成期圖2　大鱗鲃仔魚(yú)發(fā)育過(guò)程

隨著胚體繼續(xù)發(fā)育，受精46h45min后，心跳加快，尾部在膜內(nèi)自由擺動(dòng)，進(jìn)入出膜前期( 圖1-23)；隨后仔魚(yú)開(kāi)始破膜而出，受精50h12min后大部分仔魚(yú)完成破膜( 圖2-1)。剛孵出仔魚(yú)全長(zhǎng)( 7.11±0.26)mm ，全身透明，側(cè)臥，不時(shí)擺動(dòng)尾部，能在水中無(wú)規(guī)律竄動(dòng)。

2.2　仔魚(yú)發(fā)育

2.2.1循環(huán)期

出膜后的仔魚(yú)主要系統(tǒng)逐步完善，脊索加粗并逐漸伸直，魚(yú)體細(xì)長(zhǎng)，魚(yú)體頭部逐漸遠(yuǎn)離卵黃囊，口開(kāi)啟，受精57h49min后能清楚看到沿卵黃上部紅細(xì)胞在連通心臟至肛口的血管中循環(huán)，血液淡紅色，進(jìn)入循環(huán)期( 圖2-2)；眼球黑色素較為清晰，活動(dòng)能力明顯增強(qiáng)。

2.2.2體色素出現(xiàn)期

隨著仔魚(yú)的快速發(fā)育，受精90h后頭部上抬明顯，眼球黑色素顯著增加，全身表面開(kāi)始出現(xiàn)黑色花紋，位于頭部和卵黃之間的紅細(xì)胞明顯增加( 圖2-3)。

2.2.3鰾形成期

仔魚(yú)身體色素更加明顯，位于魚(yú)體上方出現(xiàn)綠帶狀花紋，此時(shí)卵黃繼續(xù)縮小，仔魚(yú)活動(dòng)能力更強(qiáng)。受精105h后，位于卵黃前端上部可見(jiàn)透明泡狀體，形成鰾( 圖2-4)。

2.2.4腸管建成期

表1　大鱗鲃胚胎和仔魚(yú)發(fā)育過(guò)程

出膜后128h，卵黃持續(xù)縮小，即將消失，身體黑色持續(xù)素增加，黑色斑點(diǎn)增多，晶體黑色，眼囊呈金黃色，仔魚(yú)已具備平游能力，在水中自由游動(dòng)，消化腸管也逐漸發(fā)育完成( 圖2-5)，開(kāi)始攝食。

大鱗鲃不同發(fā)育階段的時(shí)間見(jiàn)表1。

3　討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，參照硬骨魚(yú)類(lèi)及其他鲃亞科魚(yú)類(lèi)發(fā)育階段的劃分[10～12]，大鱗鲃的胚胎發(fā)育經(jīng)歷受精卵期、卵裂期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期等6個(gè)階段，根據(jù)其形態(tài)變化特征可劃分為24個(gè)發(fā)育時(shí)期，仔魚(yú)階段主要有4個(gè)發(fā)育時(shí)期。大鱗鲃發(fā)育階段的劃分與其他鲃亞科魚(yú)類(lèi)劃分基本一致，由于對(duì)胚胎發(fā)育特征的側(cè)重點(diǎn)不同，對(duì)胚胎發(fā)育特征的描述略有差異。

大鱗鲃的成熟卵為灰白色，大鱗鲃卵比重略大于水，弱粘性，彼此分離，水體的流動(dòng)很容易引起卵的移動(dòng)，屬漂流卵，與徐偉等[7]的研究結(jié)果一致。大鱗鲃成熟卵卵徑( 1.3±0.1)mm，略小于徐偉等[7]和藺玉華等[13]報(bào)道的大鱗鲃卵徑約為1.5mm。推測(cè)卵徑差異的原因有2點(diǎn)，一是是親魚(yú)來(lái)源不同，現(xiàn)有研究以馴化的野生大鱗鲃為親魚(yú)，而實(shí)驗(yàn)所用受精卵來(lái)自人工養(yǎng)殖的子代親魚(yú)，二者生境不同，因此卵徑不同；二是個(gè)體差異也會(huì)導(dǎo)致卵徑有差異。

大鱗鲃受精卵在孵化水溫( 26±0.5)℃時(shí)，從受精至出膜需50h12min，現(xiàn)有研究在22℃～24℃孵化條件下從受精卵到出膜需54h21min。大鱗鲃胚胎發(fā)育時(shí)間與中華倒刺鲃胚胎發(fā)育時(shí)間基本接近[10～12]，光倒刺鲃與黑脊倒刺鲃胚胎發(fā)育時(shí)間接近，大鱗鲃和中華倒刺鲃胚胎發(fā)育所用時(shí)間明顯長(zhǎng)于光倒刺鲃和黑脊倒刺鲃( 表2)。說(shuō)明在一定溫度范圍內(nèi)，胚胎發(fā)育快慢與水溫高低呈正相關(guān)。魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育快慢除了與水溫高低關(guān)系密切外，還與卵子大小相關(guān)，一般說(shuō)來(lái)，卵徑大的胚胎發(fā)育較慢[14]。但大鱗鲃和中華倒刺鲃卵徑要小于光倒刺鲃與黑脊倒刺鲃的卵徑，但所用孵化時(shí)間長(zhǎng)于光倒刺鲃和黑脊倒刺鲃。推測(cè)原因可能為孵化水溫對(duì)大鱗鲃胚胎發(fā)育的影響要大于卵徑對(duì)胚胎發(fā)育的影響。

表2　大鱗鲃與3種鲃亞科的相關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比

胚胎發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)胚期至出膜前期是主要器官形成的時(shí)期。硬骨魚(yú)類(lèi)在神經(jīng)胚期前的發(fā)育順序基本一致，神經(jīng)胚期后，不同魚(yú)類(lèi)發(fā)育順序會(huì)有所不同[14,15]。大鱗鲃胚胎發(fā)育在晶體出現(xiàn)后，肌肉開(kāi)始間歇性微縮，出現(xiàn)肌肉效應(yīng)，這一發(fā)育順序與中華倒刺鲃相同，而同為鲃亞科的黑脊倒刺鲃和光倒刺鲃肌肉效應(yīng)發(fā)生在晶體出現(xiàn)前。

仔魚(yú)階段分為早期仔魚(yú)和晚期仔魚(yú)[16]。早期仔魚(yú)卵黃囊沒(méi)有消失，以卵黃囊的存在為其典型特征，也稱卵黃囊仔魚(yú)。隨著卵黃的逐漸吸收，仔魚(yú)腸管逐漸建成，形態(tài)發(fā)生變異，最后卵黃囊消失，仔魚(yú)開(kāi)始攝食外源性營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)入仔魚(yú)晚期。卵黃營(yíng)養(yǎng)對(duì)于仔魚(yú)的發(fā)育和生存具有非常重要的意義。大鱗鲃初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)( 7.11±0.26)mm，明顯長(zhǎng)于徐偉等[7]報(bào)道的初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)( 6.07±0.18)mm，與同為鲃亞科的黑脊倒刺鲃全長(zhǎng)接近，平游攝食的時(shí)間也早于徐偉等[7]的報(bào)道。推測(cè)初孵仔魚(yú)大小差異除受取樣個(gè)體、時(shí)間等影響外，可能與卵黃囊存在時(shí)間長(zhǎng)短密切相關(guān)。卵黃囊存在時(shí)間是否影響孵化率和成活率需進(jìn)一步研究。

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