何佳熹, 鐘力生, 宋曉源, 張新桐, 靳勐, 邱閩晨, 高景暉

(西安交通大學(xué)電力設(shè)備電氣絕緣國家重點實驗室, 710049, 西安)

實現(xiàn)細(xì)胞膜電荷特性測量是國際生物電磁學(xué)研究領(lǐng)域的一個重要課題[1-4]。通過研究細(xì)胞膜的電荷特性,有望分析和表征細(xì)胞的功能變化,為相關(guān)疾病的檢測和治療提供物理手段,對深入認(rèn)識電磁生物效應(yīng)具有重要意義[5]。在細(xì)胞懸液中,細(xì)胞表面帶電狀況與細(xì)胞的團(tuán)聚密切相關(guān),因此在進(jìn)行細(xì)胞顯微觀察時,觀測細(xì)胞團(tuán)聚程度是判斷細(xì)胞帶電狀況的一種實驗手段。

目前,通過顯微觀察判斷團(tuán)聚程度的方法大多憑借主觀識別[6-8],沒有統(tǒng)一的計算方法。要實現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)聚程度的測量和計算,首先需要對細(xì)胞位置和濃度進(jìn)行判斷,有許多方法可用于對低濃度細(xì)胞的精確識別[9-11],但是當(dāng)圖中細(xì)胞濃度很高,甚至人眼觀察都無法準(zhǔn)確識別每個細(xì)胞的位置時,設(shè)計精確識別細(xì)胞的算法就較為困難。此外,顯微觀察時,視野中細(xì)胞數(shù)量通常存在一定差異,而細(xì)胞數(shù)量對于細(xì)胞團(tuán)聚的影響又會給細(xì)胞團(tuán)聚程度的觀測帶來主觀因素。

本文通過考察細(xì)胞顯微圖像灰度從而讀取圖像中細(xì)胞所處位置和密度,并由此通過計算細(xì)胞中心距倒數(shù)的平均值定義了細(xì)胞聚集度,建立了計算細(xì)胞團(tuán)聚程度的方法。在此基礎(chǔ)之上,采用MATLAB軟件,實現(xiàn)了對顯微圖像的分析與重構(gòu),建立了使用細(xì)胞聚集度分析細(xì)胞表面電荷變化的方法,一定程度上解決了使用細(xì)胞聚集度定量判斷細(xì)胞帶電狀況的問題。

1　圖像的讀取與劃分

為了從細(xì)胞顯微觀測圖像中獲得細(xì)胞的聚集度,首先需要對圖像中細(xì)胞所處的位置和密度進(jìn)行讀取。為此,本文設(shè)計了如圖1所示的圖像讀取步驟。

圖1　細(xì)胞圖像讀取步驟

1.1　顯微圖像灰度處理

為了簡化處理,本文先將如圖2a所示的顯微觀測圖像保存為如圖2b所示的灰度圖,使用二維灰度矩陣來存儲和處理圖像;再使用MATLAB軟件讀取圖像數(shù)據(jù)并按照像素保存成矩陣形式,其中矩陣每個元素的值都是0-1的雙精度浮點數(shù),并在需要時將其顯示出來。

1.2　背景識別

如圖2b所示,首先要識別圖像中的背景部分,將背景和細(xì)胞加以區(qū)分?？紤]到分散的細(xì)胞通?；叶确植紖^(qū)間較大,而觀察背景的灰度范圍通常集中在較窄的區(qū)間之內(nèi)。本文采用讀取整個圖片灰度眾數(shù)的方法確定背景灰度,即認(rèn)為整張圖片中按照像素出現(xiàn)次數(shù)最多的灰度為背景灰度。

(a)血細(xì)胞顯微觀測圖

(b)顯微觀測灰度圖

(c)顯微觀測網(wǎng)格剖分圖圖2　血細(xì)胞顯微觀察與網(wǎng)格剖分圖

1.3　劃分網(wǎng)格

實驗中的細(xì)胞實際形狀通常較為復(fù)雜且在很多時候難以精確識別,需要建立一種簡化的識別方法來確定細(xì)胞所處位置。本文將整個圖像按照一定邊長劃分為網(wǎng)格,根據(jù)細(xì)胞在圖像中的實際大小確定網(wǎng)格邊長,圖2b中觀測區(qū)域為1 024×1 280像素。像素單元對應(yīng)邊長約為0.3 μm,每個細(xì)胞直徑約為15～20像素,因此為方便計算,將網(wǎng)格劃分為邊長為16像素的方格。細(xì)胞顯微觀測區(qū)域網(wǎng)格剖分結(jié)果如圖2c所示。

1.4　網(wǎng)格中細(xì)胞密度識別

識別每個網(wǎng)格中的細(xì)胞是圖像讀取過程中的關(guān)鍵一步,對于細(xì)胞位置和分布的精確識別直接影響到后續(xù)計算結(jié)果的準(zhǔn)確性。一些文獻(xiàn)研究了處理紅細(xì)胞圖像的方法[10-11],但是對細(xì)胞的精確識別依舊較為困難且多數(shù)算法較為復(fù)雜。為此,本文給出了一種簡便地識別網(wǎng)格中細(xì)胞位置和密度的方法,滿足計算基本要求。

首先計算每個網(wǎng)格中的平均灰度,然后依據(jù)平均灰度與背景灰度之差是否大于預(yù)設(shè)值a來判斷該點是否存在細(xì)胞;接著需要判斷每個方格中的細(xì)胞密度。經(jīng)過對圖像地分析發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞較少的網(wǎng)格中,細(xì)胞與邊界及細(xì)胞表面不同區(qū)域之間區(qū)分度較為明顯。因此,網(wǎng)格中不同區(qū)域灰度差別較大,而細(xì)胞較多處網(wǎng)格中的細(xì)節(jié)區(qū)分度較差,邊界較難區(qū)分,也即網(wǎng)格中的灰度差別較小。

(a)各參數(shù)細(xì)胞讀取結(jié)果

(b)人眼讀取結(jié)果與對應(yīng)區(qū)域顯微觀測圖的對比

(c)a=0.15,b=0.1細(xì)胞讀取結(jié)果放大圖圖3　劃分讀取后細(xì)胞分布圖

雖然程序讀取和人眼讀取結(jié)果采用不同的標(biāo)準(zhǔn),但在后續(xù)計算中,對細(xì)胞密度之和按概率分布進(jìn)行了歸一化處理,因此在一張圖中只有格點密度與所有格點密度和之比會影響計算結(jié)果,只要其相對密度準(zhǔn)確就可以保證計算結(jié)果的準(zhǔn)確性,按照不同標(biāo)準(zhǔn)讀取密度并不會對后續(xù)計算結(jié)果產(chǎn)生影響。若要比較不同讀取結(jié)果的細(xì)胞相對密度,就需要先將圖3a中格點對應(yīng)密度之和進(jìn)行統(tǒng)一。為比較圖3a中各圖與圖3b的密度差,本文將圖3a中各圖細(xì)胞總數(shù)全都統(tǒng)一成與圖3b相同,并保持細(xì)胞相對密度不變。在此基礎(chǔ)上,本文按下式比較了圖3a上1/4部分和圖3b人眼讀取結(jié)果的二階偏差

(1)

式中:n為對應(yīng)網(wǎng)格中總格點數(shù);a、b分別為圖3a對應(yīng)圖像和圖3b中各格點密度之和;A(i,j)、B(i,j)分別為圖3a對應(yīng)圖像和圖3b對應(yīng)的格點矩陣第i行第j列對應(yīng)元素。Δ2越小表明兩矩陣之間差距越小。Δ2的計算結(jié)果如表1所示,可見a=0.15、b=0.1時,讀取結(jié)果和實際情況最為接近,既包含了圖2中有細(xì)胞的區(qū)域,又排除了背景區(qū)域,同時讀取的細(xì)胞密度和實際情況也有很好的對應(yīng)關(guān)系。因此,本文最終選取a=0.15、b=0.1,放大結(jié)果如圖3c所示。

表1　不同參數(shù)讀取結(jié)果與人眼觀察的二階偏差

在進(jìn)行以上處理后,為減少存儲空間和運(yùn)算量,可以將細(xì)胞的位置保存在三列一維向量中,三列向量分別保存細(xì)胞的橫縱坐標(biāo)和該坐標(biāo)點的細(xì)胞密度,并且可將不存在細(xì)胞的點刪去。

2　聚集度的計算

2.1　聚集度計算模型

當(dāng)考察外界因素對于細(xì)胞團(tuán)聚程度的影響時,通常希望能夠排除視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量不同造成的細(xì)胞團(tuán)聚程度差異的影響。由于正態(tài)分布是最為常見的分布狀況,并且正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)差σ表示了分布的離散程度,這與本文中的聚集度具有類似的意義。因此,本文選取不同標(biāo)準(zhǔn)差σ的正態(tài)分布為例進(jìn)行舉例說明。如圖4所示,標(biāo)準(zhǔn)差σ=3和σ=5,隨機(jī)取100個和300個散點的結(jié)果,同一張圖中顏色越深的點表示該點散點數(shù)越多。其中通過直觀觀察可以看出,當(dāng)散點數(shù)相同的時候σ=3的散點團(tuán)聚程度明顯小于σ=5的散點。通過直觀觀察也很容易認(rèn)為當(dāng)σ相同時,300個散點的團(tuán)聚程度高于100個散點。這種由于視野內(nèi)細(xì)胞個數(shù)增加造成的細(xì)胞團(tuán)聚程度的增加,很多時候是在考察細(xì)胞團(tuán)聚程度時希望避免的。

圖4　正態(tài)分布隨機(jī)散點圖

為計算細(xì)胞團(tuán)聚程度,需要將細(xì)胞團(tuán)聚程度抽象為一個數(shù)學(xué)問題。本文提出如下建模方法:假設(shè)細(xì)胞在圖2所示的二維平面上概率密度分布為f(x,y),則該問題抽象為構(gòu)造一個關(guān)于f的參數(shù)聚集度δ來表示細(xì)胞團(tuán)聚程度。根據(jù)圖2～圖4,以及前文提出的避免細(xì)胞個數(shù)對細(xì)胞團(tuán)聚計算結(jié)果的影響,本文提出判斷細(xì)胞團(tuán)聚的以下幾個要求。

(1)在細(xì)胞數(shù)量相同的情況下,與一個細(xì)胞鄰近的細(xì)胞越多,則細(xì)胞聚集度越大,如圖4中標(biāo)準(zhǔn)差較小的圖片具有較大的聚集度。即任意兩對細(xì)胞,若其中心距有d1δ2。

(2)細(xì)胞聚集度主要受鄰近幾個細(xì)胞的影響而與相對較遠(yuǎn)處的細(xì)胞基本無關(guān)。根據(jù)圖2可以看出,在半徑約為10個細(xì)胞直徑范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量對細(xì)胞聚集度影響較大,而相距在10個細(xì)胞直徑以上處的細(xì)胞數(shù)量對細(xì)胞聚集度影響較小,如圖2中左上角的細(xì)胞團(tuán)聚和右上角的細(xì)胞團(tuán)聚基本無關(guān)。為此若兩細(xì)胞中心距為1時對δ的影響為Δδ1,兩細(xì)胞中心距大于10時影響為Δδ2,應(yīng)有Δδ1?Δδ2,或Δδ1>10Δδ2。

(3)由于顯微觀察存在很大的隨機(jī)性,當(dāng)判斷外界因素對細(xì)胞團(tuán)聚影響時,需要排除顯微圖片中細(xì)胞個數(shù)的影響。如圖4中散點數(shù)造成的聚集度影響應(yīng)被排除,即當(dāng)細(xì)胞分布f(x,y)確定時,δ應(yīng)為一個與細(xì)胞總數(shù)N無關(guān)的數(shù)。

綜合考慮以上3點要求,本文定義細(xì)胞聚集度δ為整張圖片中細(xì)胞中心距的倒數(shù)的平均值,作為細(xì)胞團(tuán)聚程度的表征參數(shù),即

(2)

為在細(xì)胞散點圖中估計參數(shù)δ,用每個格點中細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比代替概率分布函數(shù),將積分改寫為求和,式(2)改寫為

(3)

式中:n(x,y)為(x,y)處細(xì)胞數(shù);N為圖像中細(xì)胞總數(shù)。由于(x1,y1)=(x2,y2)時上述求和中分母為0,需要剔除每個細(xì)胞和其自身計算的情況,共N個,式(3)變?yōu)?/p>

δ=

(4)

即當(dāng)估計參數(shù)δ時,只需要將每個細(xì)胞與其他細(xì)胞中心距倒數(shù)相加,然后除以細(xì)胞的兩兩組合數(shù),即得到其細(xì)胞中心距倒數(shù)平均值的估計值。

在細(xì)胞所處位置取整之后,不同細(xì)胞間也會存在坐標(biāo)相同的情況,即一個格點內(nèi)存在多個細(xì)胞。當(dāng)一個格點內(nèi)存在多個細(xì)胞時,如果細(xì)胞在格點內(nèi)呈平均分布,則式(2)中f(x,y)=1,但此時關(guān)于δ的積分難以解析計算。同時,考慮到格點內(nèi)細(xì)胞不會完全重疊,直接令f(x,y)=1也和實際情況不符,對這種情況采取直接賦值處理,假設(shè)細(xì)胞平均中心距為0.5格,則其倒數(shù)為2。因此,當(dāng)細(xì)胞處于同一格點時,利用式(4)進(jìn)行累加時約定其累加值為2。

2.2　計算方法驗證

針對圖4中提出的4個正態(tài)分布圖形,本文按照以上提出的計算方法對其聚集度δ分別進(jìn)行了計算,計算結(jié)果如表2所示。由表2可以看出,σ=3的圖像聚集度明顯大于σ=5的圖像,并且對于兩種不同的標(biāo)準(zhǔn)差有σ與δ乘積近似相等。這是由于δ是散點中心距倒數(shù)的平均值,σ是散點正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)差,正比于散點中心距;同時標(biāo)準(zhǔn)差相同的圖像,聚集度δ近似相等。由于正態(tài)分布取點的隨機(jī)性,不同圖像計算結(jié)果不可能完全相同,但是該計算結(jié)果已經(jīng)很明顯地反映了聚集度δ隨圖中散點正態(tài)分布標(biāo)準(zhǔn)差的變化趨勢,且該結(jié)果僅與散點分布的聚集程度有關(guān),與散點個數(shù)無關(guān)。因此,本文提出的計算方法滿足了2.1節(jié)中提出的建模要求。

表2　正態(tài)分布聚集度δ計算結(jié)果

3　使用聚集度表征細(xì)胞表面電荷變化

3.1　細(xì)胞聚集度表征細(xì)胞表面電荷變化

由于唾液酸是細(xì)胞表面負(fù)電荷的主要載體,使用唾液酸酶可以將唾液酸殘基從細(xì)胞表面去除,達(dá)到改變細(xì)胞表面電荷的作用[12]。為建立使用細(xì)胞聚集度分析細(xì)胞表面電荷的方法,本文使用4種不同濃度的唾液酸酶去除細(xì)胞表面唾液酸殘基,并對其進(jìn)行了10次顯微觀測,圖5為其中一次的顯微觀測及之后的計算過程。

圖5　血細(xì)胞聚集度計算過程

為驗證血細(xì)胞團(tuán)聚程度與唾液酸用量及細(xì)胞表面電荷的關(guān)系,并據(jù)此分析唾液酸酶對其表面電荷的影響,需要排除視野中細(xì)胞個數(shù)的影響,對血細(xì)胞團(tuán)聚程度進(jìn)行定量表征。實驗中,對10次觀測的結(jié)果利用式(4)計算細(xì)胞聚集度,并取其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果如圖6所示。由于唾液酸酶能夠去除細(xì)胞表面唾液酸,減少細(xì)胞表面帶電和細(xì)胞間的相互排斥作用,理論上會造成細(xì)胞聚集度的增加?？紤]到顯微圖像選取存在一定的隨機(jī)性,實驗中標(biāo)準(zhǔn)差較大,且添加0.005 U/mL的唾液酸酶聚集度δ計算結(jié)果大于0.02 U/mL,但仍可以認(rèn)為實驗結(jié)果在總體趨勢上反映了聚集度δ隨細(xì)胞表面電荷減小而增加的趨勢,同時從圖5中直觀觀察也可以得出類似的團(tuán)聚程度變化規(guī)律。因此,可以認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞聚集度δ增加時,表明細(xì)胞表面電荷減少,細(xì)胞間排斥作用減小,細(xì)胞趨于聚集;反之,當(dāng)細(xì)胞聚集度δ減小時,表明細(xì)胞表面電荷增多,細(xì)胞間排斥作用增大,細(xì)胞趨于分散。

圖6　血細(xì)胞顯微觀察聚集度計算結(jié)果

3.2　聚集度表征細(xì)胞表面電荷變化的有效性

為驗證使用本文提出的方法計算細(xì)胞聚集度進(jìn)而分析細(xì)胞表面電荷變化的有效性,本文使用ζ電位分析儀對細(xì)胞懸液的ζ電位進(jìn)行了5次測量,實驗結(jié)果如圖7所示,由于細(xì)胞ζ電位為負(fù)值,為了使其變化趨勢更加明顯,圖中使用了其絕對值。

ζ電位是細(xì)胞表面雙電層中滑動層到溶液內(nèi)部的電位差,正比于細(xì)胞表面電荷量[13-14]。實驗中,唾液酸酶去除了細(xì)胞表面唾液酸殘基,細(xì)胞表面負(fù)電荷減少,因而細(xì)胞表面ζ電位絕對值減少。同時由于細(xì)胞表面負(fù)電荷減少,細(xì)胞間相互排斥作用減弱,造成了細(xì)胞團(tuán)聚作用增強(qiáng)。對比圖6與圖7中細(xì)胞聚集度δ與ζ電位變化曲線發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞表面ζ電位絕對值減小的時候,細(xì)胞聚集度表現(xiàn)出相似的上升趨勢,驗證了本文提出的使用細(xì)胞聚集度分析細(xì)胞表面電荷變化的有效性。本實驗定性描述了細(xì)胞聚集程度和細(xì)胞表面電荷及ζ電位的關(guān)系,但是其定量分析還有待進(jìn)一步研究。

圖7　血細(xì)胞ζ電位的實驗結(jié)果

4　結(jié)　論

本文建立了一種基于細(xì)胞灰度圖計算細(xì)胞聚集度并由此推斷細(xì)胞表面電荷變化情況的方法,主要結(jié)論如下。

(1)提出了一種識別細(xì)胞所在位置和密度的計算方法;針對細(xì)胞數(shù)量不同的情況定義了細(xì)胞的聚集度,建立了基于細(xì)胞中心距倒數(shù)平均值計算細(xì)胞聚集度的方法;針對正態(tài)分布的情況驗證了該計算方法的可靠性。

(2)在此基礎(chǔ)之上,本文使用唾液酸酶改變細(xì)胞表面帶電基團(tuán),建立了使用細(xì)胞聚集程度分析細(xì)胞表面帶電狀況的方法,發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞聚集度δ增加時,表明細(xì)胞表面電荷減少,細(xì)胞間排斥作用減小,細(xì)胞趨于聚集;反之,當(dāng)細(xì)胞聚集度δ減小時,表明細(xì)胞表面電荷增多,細(xì)胞間排斥作用增大,細(xì)胞趨于分散。

(3)通過測量細(xì)胞ζ電位驗證了使用細(xì)胞聚集度反映細(xì)胞表面電荷變化的有效性,建立了使用細(xì)胞聚集度分析細(xì)胞表面電荷變化的數(shù)值計算方法。

本文方法可以在很大程度上排除視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量對于細(xì)胞團(tuán)聚程度的影響,從而使分析細(xì)胞表面電荷變化和細(xì)胞團(tuán)聚程度的關(guān)系相比主觀觀察更具客觀性。

本文方法不僅可以用于細(xì)胞團(tuán)聚程度和表面帶電狀況的表征,在相似的膠體或濁液中也存在類似的聚集度[15]計算問題,對膠體或濁液中分散相的分散程度或團(tuán)聚程度及其表面帶電情況也可使用該方法進(jìn)行類似分析。

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