楊天睿，苗云波，張彤，段靳嵐，朱瀅，穆寧暉，余錦雯

缺血性心臟病嚴重威脅人類健康，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)日益年輕化的趨勢。心肌缺血重新恢復血流供應后，反而會造成心肌超微結構、功能、代謝及電生理方面的進一步損害，甚至是不可逆損傷，繼而出現(xiàn)嚴重的心律失常和心功能不全，嚴重者可導致死亡，即出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷［1］。缺血與再灌注時間是再灌注損傷的重要影響因素，了解其對缺血再灌注損傷的影響程度有著重要意義。本研究運用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立實驗樹鼩心肌缺血再灌注模型，分別采用不同的停灌和再灌注時間進行干預，通過尋找組間心肌酶學及切片梗死面積的差異來源，分析缺血、再灌注時間及其交互作用對再灌注損傷的影響程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2015年9月—2017年5月，選取健康成年雄性滇西亞種實驗樹鼩60只，4～6個月齡，體質(zhì)量120～150 g。實驗動物由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供，動物許可證：滇發(fā)馴繁（92-29）號，合格證：SCXK（滇）K2015-0002。術前禁食過夜，自由飲水。本研究經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 設備與器材 Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)（型號：PowerLab，生產(chǎn)商：ADInstruments）是研究小鼠、大鼠、豚鼠、樹鼩等動物心臟的理想工具，該系統(tǒng)具有恒定流量或恒定壓力兩種模式，實現(xiàn)冠狀動脈流量監(jiān)控，同時溫控控制精確恒定，可記錄和分析各種心血管參數(shù)。

1.3 造模方法 實驗樹鼩水合氯醛（1 ml/只）腹腔麻醉，經(jīng)腹腔肝素化（普通肝素1 000 U/只）抗凝。迅速開胸分離心臟，在主動脈根部快速將主動脈與其他血管一并剪斷后取出心臟，立即放人0～4 ℃的K-H液中，排出殘留血液，盡快將心臟移至Langendorff離體灌注系統(tǒng)裝置上。主動脈逆行插管，同時放置球囊進入左心室后，用K-H液（pH為7.35～7.45）灌注，恒溫（37 ℃）恒壓（60 mm Hg，1 mm Hg=0.133 kPa），冠狀動脈流量為6～12 ml/min，將肺動脈根部剪開以保證冠狀動脈回流通暢，灌注液用量筒計時收集，以代表冠狀動脈流量。

K-H液成分為NaCl 6.92 g/L、KCl 0.35 g/L、KH2PO41.2 ml/L、NaHCO32.1 g/L、MgSO40.296 g/L、 葡 萄 糖2 g/L、CaCl20.28 g/L、乙二胺四乙酸（EDTA） 0.187g/L。鹽酸調(diào)節(jié)溶液酸堿度。灌注全程K-H液用95% O2和5% CO2混合氣平衡。

在右心房及心尖部放置記錄電極，連接多導電生理儀，全程記錄灌注心臟的心電情況。采用隨機數(shù)字表法，將實驗樹鼩分為5組，保證每組10只實驗樹鼩成功構建體外Langendorff心臟模型。A組穩(wěn)定灌注30 min后取5只實驗樹鼩觀察心肌梗死面積，其余模型繼續(xù)灌注直至90min。B組穩(wěn)定灌注30 min，停灌15 min，再灌注30 min。C組穩(wěn)定灌注30 min，停灌15 min，再灌注60 min。D組穩(wěn)定灌注30 min，停灌30 min，再灌注30 min。E組穩(wěn)定灌注30 min，停灌30 min，再灌注60 min。B～E組分別在停灌后取5只實驗樹鼩觀察心肌梗死面積，其余模型繼續(xù)再灌注。造模成功標準：離體心臟在實驗過程中心電穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯的心率減慢或持續(xù)室性心律失常，甚至心臟停搏的情況，持續(xù)灌注30 min后，心功能參數(shù)接近實驗樹鼩的生理狀態(tài)，心率250～350 次 /min。

1.4 評價指標

1.4.1 心肌梗死面積 灌注結束，立即取下心臟，清洗，于-20 ℃冷凍2 h后，沿心臟冠狀面以2 mm間隔切片。經(jīng)2，3，5-氯化三苯基四唑（2，3，5-triphenyltrazoliumchloride，TTC）染色后進行數(shù)碼照相，計算梗死面積。TTC與正常組織中的呼吸鏈酶反應而成紅色，而缺血組織內(nèi)呼吸鏈酶活性下降，染色組織呈灰白色。

1.4.2 心肌損傷標志物 心肌組織分割剪碎，與預冷的勻漿介質(zhì)配比，研磨成10%的心肌均漿。取各組灌注液及心肌組織樣本，采用微板法檢測丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）水平，試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0、GraphPad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，計量資料各組間的比較使用單因素方差分析，各因素效應與交互作用的分析采用雙因素方差分析。以P＜0.05為差異為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌梗死面積 A組、D組、E組停灌與再灌注后實驗樹鼩心肌梗死面積比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組、C組再灌注后實驗樹鼩心肌梗死面積較停灌后增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。各組再灌注后心肌梗死面積比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.017，P＜0.001）；其中，B～E組心肌梗死面積大于A組，D、E組心肌梗死面積大于B、C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章）。

表1 各組停灌與再灌注后實驗樹鼩心肌梗死面積比較（±s，%）Table 1 Comparison of myocardial infarction area before and after perfusion in each group

表1 各組停灌與再灌注后實驗樹鼩心肌梗死面積比較（±s，%）Table 1 Comparison of myocardial infarction area before and after perfusion in each group

組別 停灌（n=5） 再灌注（n=5） t值 P值A組 4.95±0.92 6.35±3.62 -0.837 0.427 B組 10.28±1.86 15.09±0.74 -5.381 0.001 C組 10.51±2.79 20.26±6.89 -2.933 0.019 D組 27.99±6.79 31.49±11.01 -0.605 0.562 E組 25.60±6.26 32.42±9.49 -1.301 0.271

圖1 各組心肌組織梗死面積（TTC染色）Figure 1 Myocardial infarction areas in each group

2.2 心肌損傷標志物

2.2.1 灌注液 各組灌注液ALT、AST、CK-MB、LDH水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中，B～E組灌注液ALT、AST、CK-MB、LDH水平高于A組，C組CK-MB水平高于B組，D組CK-MB、LDH水平高于B、C組，E組ALT、CK-MB、LDH水平高于B、C組，AST水平高于B～D組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表 2）。

2.2.2 心肌組織 各組心肌組織ALT、AST、CK-MB、LDH水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中，B～E組灌注液ALT、AST、CK-MB、LDH水平高于A組，D組ALT、CK-MB、LDH水平高于B、C組，AST水平高于C組，E組ALT、CK-MB、LDH水平高于B、C組，AST水平高于B～D組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 停灌時間、再灌注時間及其交互作用對心肌損傷標志物水平的影響 停灌時間、再灌注時間對灌注液、心肌組織ALT水平的主效應顯著（P＜0.05），兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。

停灌時間、再灌注時間對灌注液、心肌組織AST水平的主效應顯著（P＜0.05），兩者對灌注液AST水平的交互作用顯著（P＜0.05），對心肌組織AST水平的交互作用不顯著（P＞0.05）。

停灌時間、再灌注時間對灌注液CK-MB水平的主效應顯著（P＜0.05），兩者交互作用顯著（P＜0.05）。停灌時間對心肌組織CK-MB水平的主效應不顯著（P＞0.05），再灌注時間對心肌組織CK-MB水平的主效應顯著（P＜0.05），兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。

停灌時間、再灌注時間對灌注液LDH水平的主效應顯著（P＜0.05），兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。停灌時間對心肌組織LDH水平的主效應不顯著（P＞0.05），再灌注時間對心肌組織LDH水平的主效應顯著（P＜0.05），兩者交互作用不顯著（P＞0.05，見表4）。

表2 各組灌注液心肌損傷標志物水平比較（±s，U/L）Table 2 Comparison of the levels of myocardial injury markers in perfusion fluid in each group

表2 各組灌注液心肌損傷標志物水平比較（±s，U/L）Table 2 Comparison of the levels of myocardial injury markers in perfusion fluid in each group

注：ALT=丙氨酸氨基轉移酶，AST=天冬氨酸氨基轉移酶，CK-MB=肌酸激酶同工酶，LDH=乳酸脫氫酶；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；與D組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) ALT AST CK-MB LDH A組 5 16.6±1.6 14.0±3.9 4.11±0.37 233.73±60.98 B 組 5 64.2±9.9a 59.5±10.2a 13.53±1.61a 372.27±41.91a C 組 5 65.7±13.7a 66.2±12.4a 9.88±3.33ab 348.51±41.31a D組 5 75.7±10.9a 68.0±8.5a 21.80±1.92abc 471.64±61.45abc E 組 5 81.1±11.7abc 86.8±8.9abcd 21.67±1.87abc 521.21±28.22abc F值 30.365 43.359 69.545 27.761 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 各組心肌組織心肌損傷標志物水平比較（±s，U/gprot）Table 3 Comparison of the levels of myocardial injury markers in myocardial tissues in each group

表3 各組心肌組織心肌損傷標志物水平比較（±s，U/gprot）Table 3 Comparison of the levels of myocardial injury markers in myocardial tissues in each group

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；與D組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) ALT AST CK-MB LDH A 組 5 21.7±5.8 24.6±5.9 5.23±0.80 170.32±51.84 B 組 5 59.9±9.3a 68.6±4.9a 12.92±10.09a 313.19±48.17a C 組 5 68.1±9.2a 63.8±6.6a 13.11±2.38a 377.36±52.23a D 組 5 79.2±9.6abc 75.6±5.6ac 21.50±2.57abc 478.17±45.51abc E 組 5 78.7±4.4abc 84.9±9.3abcd 22.98±0.86abc 481.63±66.03abc F值 44.313 61.081 87.928 29.623 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

缺血性心臟病是臨床常見疾病，心肌缺血是由于冠狀動脈病變或痙攣，心肌供血供氧不足導致心肌出現(xiàn)代謝異常的病理狀態(tài)，恢復血供是減輕缺血組織損傷的根本措施。目前，再灌注治療仍然是臨床治療缺血性心臟病最有效的手段，主要通過藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入和冠狀動脈旁路移植術使冠狀動脈再通，重新恢復血供［2］，然而由此帶來的缺血再灌注損傷嚴重影響臨床治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，缺血心肌再灌注損傷是由多種觸發(fā)物、媒介物效應器參與的復雜生物反應過程，涉及多種復雜細胞信號轉導機制，并在多層次和諸多環(huán)節(jié)存在交互作用，造成心肌超微結構、功能、代謝及電生理方面的進一步損害［3］。缺血再灌注損傷會導致心肌細胞水腫，結構受損、功能障礙，中性粒細胞趨集、黏附、釋放炎性遞質(zhì)，介導其他炎性細胞攻擊心肌細胞，最終引起心肌細胞壞死和凋亡，加劇缺血再灌注損傷。伴隨心肌細胞損傷，線粒體崩解，細胞內(nèi)酶大量釋放入血液，血清及組織中ALT、AST、CK、LDH及其同工酶活性的增高是衡量心肌受損的重要指標［4］。同時，心肌梗死區(qū)域進一步擴大，梗死區(qū)內(nèi)出血，合并存在心肌的壞死和凋亡現(xiàn)象。

表4 停灌時間、再灌注時間及其交互作用對心肌損傷標志物水平影響的雙因素方差分析Table 4 Two-factor analysis of variance of the effects of suspension time and reperfusion time and their interaction on the levels of myocardial injury markers

實驗樹鼩具有生理解剖、神經(jīng)發(fā)育和生化代謝等方面與人類相似的生物學特征，屬于攀鼩目，其體型小、繁殖快、飼養(yǎng)和研究成本低，易實驗操作，在生物醫(yī)藥研究方面是靈長類動物的補充［5］。Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)在離體灌注條件下避免神經(jīng)體液因素的干擾，可直接觀察到心肌缺血再灌注損傷作用［6］?；谝陨咸攸c，本研究運用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立實驗樹鼩心肌缺血再灌注模型，通過對組內(nèi)停灌和再灌注后心肌梗死面積比較發(fā)現(xiàn)，B組、C組再灌注后心肌梗死面積較停灌后增加。A組持續(xù)灌注，心肌組織切片無缺血梗死表現(xiàn)。B組、C組停灌時間為15 min，D組、E組停灌時間為30 min，說明停灌15 min時對實驗樹鼩心臟所造成的損傷已經(jīng)發(fā)生，之后的再灌注加重了心肌缺血梗死的程度和范圍，證實了心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生；而缺血30 min對心臟所造成的損傷較為嚴重，心肌梗死后即使發(fā)生了再灌注損傷，梗死面積沒有增加。在進行組間比較時發(fā)現(xiàn)各組心肌組織梗死面積，灌注液和心肌組織ALT、AST、CK-MB、LDH水平均存在差異，D組、E組再灌注后心肌梗死面積最大、心肌損傷標志物水平最高，心肌損傷表現(xiàn)最重。本研究進一步以停灌時間和再灌注時間為兩因素進行雙因素方差分析，探討組間各指標差異來源。結果證實，停灌時間對灌注液、心肌組織的ALT、AST，以及對灌注液CK-MB、LDH的主效應顯著，而再灌注時間對灌注液、心肌組織的ALT、AST、CK-MB、LDH主效應均顯著，這一發(fā)現(xiàn)有利于進一步認識缺血再灌注損傷過程。

缺血再灌注損傷分為兩個階段，即缺血、再灌注階段；一方面，由于缺血缺氧、酸中毒導致細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)超微結構損傷，另一方面，再灌注可造成細胞產(chǎn)生大量自由基、細胞內(nèi)鈣離子超載。有研究表明，缺血再灌注較單純?nèi)毖辜毎麅?nèi)自由基、鈣離子水平增加12～25倍，過多的自由基和鈣離子可造成細胞的嚴重損傷［7］。由此，再灌注過程對損傷起著關鍵性作用，該階段出現(xiàn)了嚴重能量代謝障礙，細胞內(nèi)酸中毒，溶酶體膜不穩(wěn)定，細胞蛋白合成與分解失衡，影響生物合成修復過程，成為不可逆變化。因此，臨床工作中應積極關注不同的再灌注時間對急性心肌梗死患者預后的影響，開展早期再灌注治療，但最佳再灌注時間尚需要進一步大樣本研究證實。

綜上所述，缺血時間和再灌注時間是影響心肌缺血再灌注損傷程度的關鍵因素，其中以再灌注時間更為重要。臨床應積極關注缺血時間與再灌注時間，采取有效措施防止再灌注損傷的產(chǎn)生或減輕其損傷程度。本研究在實驗樹鼩心肌缺血再灌注模型中探討了停灌時間和再灌注時間對心肌缺血再灌注損傷的影響，為防止缺血再灌注損傷的發(fā)生或減輕其損傷程度提供了重要依據(jù)，但本研究樣本量相對較小，尚需大樣本的動物實驗進一步驗證。

作者貢獻：楊天睿、苗云波進行文章的構思與設計，負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理；楊天睿進行研究的實施與可行性分析、撰寫論文；張彤、穆寧暉進行數(shù)據(jù)收集；楊天睿、穆寧暉、余錦雯進行數(shù)據(jù)整理；楊天睿、段靳嵐進行統(tǒng)計學處理；楊天睿、張彤進行結果的分析與解釋；楊天睿、朱瀅進行論文的修訂。

本文無利益沖突。

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