張奎，潘光照，蘇晶晶，談娟，徐曼，李鈺添，崔紅娟

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家蠶()基因鑒定、表達(dá)、亞細(xì)胞定位和功能

張奎，潘光照，蘇晶晶，談娟，徐曼，李鈺添，崔紅娟

（西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

【】鑒定、克隆家蠶（）()基因，分析其mRNA表達(dá)及亞細(xì)胞定位特征。制備多克隆抗體，同時(shí)在細(xì)胞水平進(jìn)行過(guò)表達(dá)，檢測(cè)gcm對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響，為探究Bmgcm功能打下基礎(chǔ)。【】利用RACE方法克隆獲得全長(zhǎng)cDNA序列，利用ORF Finder和SMART等在線工具對(duì)基本序列特征和結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分析，運(yùn)用Clustalx 和MEGA 6.0等軟件對(duì)多物種gcm蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì)和進(jìn)化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法檢測(cè)的表達(dá)情況。利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白，通過(guò)蛋白純化和免疫小鼠制備多克隆抗體，運(yùn)用Western blot對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)。構(gòu)建Bmgcm表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系，分析其亞細(xì)胞定位情況，同時(shí)利用EDU細(xì)胞增殖標(biāo)記和流式細(xì)胞儀對(duì)其功能進(jìn)行探索?！尽浚˙GIBMGA006182）定位于4號(hào)染色體的nscaf2847上，其基因全長(zhǎng) 4 046 bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。其cDNA全長(zhǎng)1 734 bp，包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)。該基因編碼446個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白分子量為50.61 kD，等電點(diǎn)5.557，含有典型的GCM結(jié)構(gòu)域。多重比對(duì)結(jié)果顯示GCM結(jié)構(gòu)域在不同物種間具有高度的保守性，進(jìn)化分析顯示昆蟲(chóng)gcm蛋白單獨(dú)聚為一支，其中Bmgcm蛋白與帝王蝶同源蛋白親緣關(guān)系最為接近。表達(dá)分析結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育第4天表達(dá)達(dá)到峰值，隨后表達(dá)水平逐漸下調(diào)，而在幼蟲(chóng)階段，主要表達(dá)于中腸、精巢和卵巢。將完整的開(kāi)放閱讀框序列構(gòu)建至原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和親和層析純化獲得高純度重組蛋白，通過(guò)免疫小鼠獲得了多克隆抗體，Western blot檢測(cè)該抗體可以特異性識(shí)別重組蛋白。在家蠶細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Bmgcm蛋白，結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核。在細(xì)胞水平，過(guò)表達(dá)會(huì)明顯抑制細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯于G1/S期?！尽靠寺¤b定得到全長(zhǎng)序列，獲得其表達(dá)和亞細(xì)胞定位信息。通過(guò)原核表達(dá)、蛋白純化和免疫小鼠制備了可用的多克隆抗體。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制增殖和影響正常的細(xì)胞周期進(jìn)程。

家蠶基因()；克隆；表達(dá)分析；抗體制備；過(guò)表達(dá)

0 引言

【研究意義】 Glial cell missing（gcm）與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)，調(diào)控果蠅膠質(zhì)細(xì)胞的生成[1-2]，同時(shí)gcm通過(guò)與多種因子，如GATA和lozenge的相互作用，調(diào)控漿細(xì)胞的生成、復(fù)制和成熟等過(guò)程[3]。研究家蠶（）有助于解析該基因在家蠶神經(jīng)發(fā)育和造血調(diào)控中的功能，為推動(dòng)家蠶模式化作出貢獻(xiàn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Gcm是一小類(lèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，其N(xiāo)端含有一個(gè)長(zhǎng)度約為150個(gè)氨基酸殘基的保守GCM結(jié)構(gòu)域基序[4]。首先在果蠅中被鑒定出來(lái)，可以直接調(diào)控神經(jīng)元前體細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞，是膠質(zhì)細(xì)胞生成主要調(diào)控因子[1-2,5-6]。其功能缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的完全缺失，而過(guò)表達(dá)則可以激活repo和pnt等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[7-8]，進(jìn)而誘導(dǎo)與膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[9-11]，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞生成，此外通過(guò)激活ttk抑制神經(jīng)元的形成[12-13]。而在哺乳動(dòng)物中，是胎盤(pán)發(fā)育所必需的，參與調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化[14-15]。而另一個(gè)基因與甲狀旁腺發(fā)育相關(guān)[16]，發(fā)生突變會(huì)引發(fā)甲狀旁腺功能減退癥[17]。在果蠅造血中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]，能夠促進(jìn)漿細(xì)胞的發(fā)生，而抑制結(jié)晶細(xì)胞生成。/的缺失會(huì)導(dǎo)致漿細(xì)胞數(shù)量明顯減少，結(jié)晶細(xì)胞的數(shù)量增多，異位表達(dá)能夠誘導(dǎo)漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記基因的表達(dá)[18]。除調(diào)控血細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞外，果蠅同時(shí)也參與調(diào)控腱細(xì)胞的分化[15]。的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控作用具有高度的保守性，果蠅和的缺失會(huì)致死，而在人中，主要參與調(diào)控胎盤(pán)和甲狀旁腺，而這兩個(gè)組織在果蠅中是不存在的[19-20]，說(shuō)明的功能在不同物種間存在一定的差異[21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】家蠶作為一種經(jīng)典的鱗翅目昆蟲(chóng)代表，其在生物反應(yīng)器、蠶絲纖維材料和模式生物等方面顯示出廣闊的前景[22]。目前已經(jīng)在果蠅中鑒定出兩個(gè)同源基因，對(duì)其功能進(jìn)行了詳細(xì)的解析[3,23]。而在家蠶中，還未見(jiàn)關(guān)于的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)生物信息學(xué)分析和RACE技術(shù)鑒定克隆，分析其序列和表達(dá)特征。利用原核表達(dá)、蛋白純化和免疫小鼠制備多克隆抗體，在細(xì)胞水平研究Bmgcm蛋白的亞細(xì)胞定位，對(duì)其功能進(jìn)行探索。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年9月至2017年3月在家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（西南大學(xué)）完成。

1.1 材料與試劑

供試家蠶品系為大造，取自西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)，在正常條件下進(jìn)行催青和飼養(yǎng)。細(xì)胞系BmE-SWU3由筆者實(shí)驗(yàn)室建立并保存[24]。RNAiso、PMD19-T simple、限制性?xún)?nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自TaKaRa公司，HiFi酶和DNA Marker購(gòu)自Transgen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司，Click-iT? EdU Imaging Kits購(gòu)自Invitrogen公司，膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，RACE試劑盒、BrdU、熒光二抗和細(xì)胞爬片購(gòu)自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染試劑NDE3000由重慶高圣醫(yī)藥提供。質(zhì)粒DNA試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，Tubulin抗體、DAPI和抗熒光淬滅劑購(gòu)自碧云天，ECL顯色試劑盒購(gòu)自Thermo scientific公司，測(cè)序和所有引物的合成均在華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 胚胎1—9 d和5齡3 d各組織，包括表皮、頭部、中腸、絲腺、精巢、卵巢、脂肪體、血細(xì)胞和整蠶等材料，除血細(xì)胞直接加入RNAiso外，其他材料在液氮中研磨為粉末后加入RNAiso，提取總RNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別對(duì)RNA的完整性純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。

1.2.2 全長(zhǎng)克隆 以黑腹果蠅（）的gcm蛋白作為質(zhì)詢(xún)序列，通過(guò)檢索比對(duì)家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB（http://silkworm.genomics.org.cn/）和KAIKObase（http://sgp.dna.affrc.go.-jp/KAIKObase/）獲得家蠶同源基因，設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得部分中間序列。然后設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增特異引物GSP1、NGSP1、GSP2和NGSP2（表1），參照RACE試劑盒提供的方法步驟進(jìn)行5′和3′ RACE擴(kuò)增。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收并連接至pMD19-T-simple載體后進(jìn)行測(cè)序。利用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，最終獲得全長(zhǎng)cDNA序列。為了驗(yàn)證RACE結(jié)果的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)了全長(zhǎng)cDNA引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 蛋白序列分析 利用在線工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對(duì)的表達(dá)框ORF進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得推導(dǎo)的氨基酸序列。利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）對(duì)信號(hào)肽基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)運(yùn)用Isoelectric point calculator（http://isoelectric.ovh.org/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。將全長(zhǎng)cDNA序列作為質(zhì)詢(xún)序列，比對(duì)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得基因組DNA信息，利用在線工具Splign（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign. cgi?textpage=online&level=form）對(duì)基因外顯子和內(nèi)含子分布進(jìn)行分析。

1.2.4 進(jìn)化分析 從NCBI下載包括智人（）、小鼠（）和黑腹果蠅等多種物種在內(nèi)的gcm蛋白序列，通過(guò)Clustalx軟件對(duì)這些蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，以NJ （neighbor-joining）法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.5 PCR擴(kuò)增 以胚胎1—9 d和5齡3 d各組織cDNA為模板，對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，以肌動(dòng)蛋白3（Actin3）為內(nèi)參（引物序列見(jiàn)表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板100 ng，10×PCR buffer 2.5 μL，2 mmol·L-1dNTPs 2 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，HiFi-Taq酶0.2 μL，最終加ddH2O至總體積為25 μL。反應(yīng)體系配制完成并瞬時(shí)離心后置入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、EB染色和成像后對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用試劑為T(mén)aKaRa公司的SYBR?Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），所用儀器為Applied Biosystems公司的StepOne PlusTMReal-Time PCR system。定量所用引物見(jiàn)表1，其中以家蠶為內(nèi)參。定量PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃結(jié)合與延伸30 s，循環(huán)數(shù)為40次。

1.2.7 原核表達(dá)、蛋白純化與抗體制備利用表達(dá)框ORF全長(zhǎng)引物擴(kuò)增得到Bmgcm的片段，經(jīng)R I和I酶切后連接至經(jīng)同樣限制性?xún)?nèi)切酶處理的pET32a載體中，命名為pET32a-gcm。測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)，挑取單菌落，利用PCR技術(shù)檢測(cè)目的質(zhì)粒是否導(dǎo)入菌體。將陽(yáng)性克隆接種至LB 培養(yǎng)基，于37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)。至OD值達(dá)到0.6—1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol·L-1，然后分別置于16、25和37℃進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間分別為20、12和4 h，其中以不加IPTG為對(duì)照。誘導(dǎo)完成后，低溫離心棄上清，收集菌體，用PBS清洗菌體數(shù)次重懸于PBS，利用高壓破碎儀進(jìn)行破碎至菌液透亮。高速冷凍離心后分別收集上清蛋白和包涵體蛋白，取8 μL蛋白樣品加入2 μL 5×SDS PAGE上樣緩沖液，混合均勻后100℃水浴變性30 min。隨后將樣品注入SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后對(duì)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行觀察。經(jīng)過(guò)比較，最終選擇IPTG終濃度為0.6 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)時(shí)間為20 h進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)gcm重組蛋白，經(jīng)Ni+親和層析法純化后獲得純度較高的重組蛋白。用純化的重組蛋白免疫昆明鼠，第1次取50 μg蛋白和等體積的弗氏完全佐劑混合，完全乳化后腹腔注射；第2、3、4次分別取75、100和125 μg蛋白和等體積的弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后腹腔注射，每次間隔為10 d。最后一次直接注射150 μg蛋白，3 d后摘取小鼠眼球取血，經(jīng)梯度離心獲得抗血清，加入25%滅菌甘油后分裝保存于-80℃。

1.2.8 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過(guò)gcm-CDS引物擴(kuò)增得到全長(zhǎng)ORF序列片段，根據(jù)完整的閱讀框序列設(shè)計(jì)特異性過(guò)表達(dá)引物，將片段利用I和I酶切后連接至PIZ-OpIE2-GST-DsRed-SV40載體[25]，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證后用于下一步試驗(yàn)，命名為PIZ-OpIE2- BmGcm-GST-DsRed-SV40和PIZ-OpIE2-GST-DsRed- BmGcm-SV40，其中g(shù)cm與GST-DsRed在同一讀碼框下，共同形成融合蛋白。將無(wú)菌玻片鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞鋪板1 d后用無(wú)抗Grace培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染方法參照談娟等[26]的報(bào)道，即在超凈工作臺(tái)中將0.5 μg PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed-SV40或PIZ- OpIE2-GST-DsRed-BmGcm-SV40質(zhì)粒添加至100 μL Grace培養(yǎng)基（不抗生素和血清）并輕柔混合均勻，然后加入1.5 μL脂質(zhì)體并混勻，室溫靜置30 min后將混合液加入24孔板，6 h 后換液。轉(zhuǎn)染3 d后，一部分孔直接收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，另外一部分經(jīng)多聚甲醛固定和DAPI染色后進(jìn)行熒光觀察。

表1 引物序列

為了提高轉(zhuǎn)染效率，利用限制性?xún)?nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ將PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed-SV40載體中的GST-DsRed元件切除，通過(guò)載體自連獲得表達(dá)Bmgcm蛋白的載體，命名為PIZ-OpIE2-BmGcm- SV40。利用同樣的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染3 d后進(jìn)行EDU標(biāo)記檢測(cè)、Western blot和流式分析，同時(shí)收集RNA材料，用于定量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Bmgcm克隆

以智人、小鼠和黑腹果蠅等物種的gcm同源蛋白序列在家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到一個(gè)高度相似的同源基因，編號(hào)為BGIBMGA006182。該基因定位于4號(hào)染色體的nscaf2847上，NCBI登錄號(hào)為XP_004929375.2。根據(jù)預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長(zhǎng)度約為1 200 bp的序列。利用RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為500 bp的5′ RACE產(chǎn)物和長(zhǎng)度約為450 bp的3′ RACE產(chǎn)物。根據(jù)軟件拼接得到的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，成功擴(kuò)增得到，證實(shí)RACE結(jié)果的準(zhǔn)確性?；蚪MDNA全長(zhǎng)4 046 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成（圖1）。該基因cDNA全長(zhǎng)序列為1 734 bp，其中包含一個(gè)166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），在3′ UTR末端有一個(gè)polyA尾（圖1）。其cDNA全長(zhǎng)編碼446個(gè)氨基酸殘基，其預(yù)測(cè)蛋白分子量為50.61 kD，等電點(diǎn)為5.557。

黑色框表示外顯子，黑線表示內(nèi)含子 Exons and introns are represented by black frames and black lines, respectively

2.2 Bmgcm蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用在線工具SMART（http://smart.embl- heidelberg.de/）對(duì)Bmgcm推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在23—163氨基酸之間存在一個(gè)典型的GCM結(jié)構(gòu)域。

2.3 序列比對(duì)分析

下載帝王蝶（，DpGcm，EHJ73156.1)、黑腹果蠅（DmGcm，BAA10905.1和DmGcm2，BAB83120.1）以及智人（HsGCMa，NP_003634.2和HsGCMb，NP_004743.1）相應(yīng)的gcm蛋白序列，與Bmgcm蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示這些蛋白在GCM結(jié)構(gòu)域部分具有高度的保守性，而在其他部分差異較大（圖2-A）。單獨(dú)分析GCM結(jié)構(gòu)域的相似性，結(jié)果表明Bmgcm蛋白的GCM結(jié)構(gòu)域與帝王蝶DpGcm、黑腹果蠅DmGcm、DmGcm2、智人HsGCMa、HsGCMb的序列相似度分別為95%、72%、69%、57%和68%（圖2-B）。

2.4 Bmgcm進(jìn)化分析

使用MEGA 6.0軟件，利用NJ法構(gòu)建包括家蠶在內(nèi)的多物種gcm蛋白序列進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物gcm蛋白分別位于不同的分支上，高等生物如智人和小鼠中均存在兩種Gcm蛋白，即GCMa和GCMb，分別構(gòu)成脊椎動(dòng)物中的兩個(gè)分支（圖3）。選取了包括棘皮動(dòng)物、軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物等多種低等生物進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的規(guī)律性，其中家蠶Gcm蛋白與其他昆蟲(chóng)的同源蛋白聚為一類(lèi)。在大部分昆蟲(chóng)中，雙翅目（如岡比亞按蚊、埃及伊蚊、黑腹果蠅和家蠅等）中存在兩個(gè)同源基因，而在鞘翅目（如赤擬谷盜）、膜翅目（如木蟻、印度跳蟻和麗蠅蛹集金小蜂等）和鱗翅目（如帝王蝶和家蠶）等昆蟲(chóng)中只發(fā)現(xiàn)一個(gè)。

2.5 Bmgcm表達(dá)分析

利用RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了在胚胎各時(shí)期的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其在胚胎第1、2天有表達(dá)，第3天時(shí)高表達(dá)，第4天達(dá)到峰值，隨后表達(dá)水平逐漸降低（圖4-A、4-C）。同時(shí)，檢測(cè)了5齡3 d幼蟲(chóng)各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在中腸、精巢和卵巢中有表達(dá)，而在脂肪體有微弱的表達(dá)（圖4-B、4-D）。

A：Bmgcm蛋白與其他物種同源蛋白比對(duì)分析 Alignment analysis of Bmgcm protein with its homologous protein from other species；B：不同物種gcm蛋白GCM結(jié)構(gòu)域相似性分析Similarity analysis of the GCM domain from various species。保守的半胱氨酸和組氨酸殘基用星號(hào)標(biāo)記Conserved cysteine and histidine residues are marked with asterisks

圖3 家蠶與其他物種gcm的系統(tǒng)進(jìn)化分析

A、C：Bmgcm在胚胎時(shí)期的表達(dá) The expression profile of Bmgcm at embryonic development stage；B、D：Bmgcm在幼蟲(chóng)各組織中的表達(dá) The expression profile of Bmgcm in different tissues at larval stage。Ep：表皮 Epidermis；He：頭部Head；Mi：中腸Midgut；Ma：馬氏管 Malpighian tubules；Si：絲腺Silk gland；Te：精巢Testis；Ov：卵巢Ovary；Fa：脂肪體Fat body；Ha：血細(xì)胞Haemocyte；Wh：整蠶Whole body

2.6 Bmgcm原核誘導(dǎo)、蛋白純化及抗體制備

選擇全長(zhǎng)序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接至pET32a質(zhì)粒，重組質(zhì)?？梢员籖 I和I酶切開(kāi)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)無(wú)突變，證明構(gòu)建的pET32a-gcm質(zhì)粒是成功的（圖5-A）。將pET32a-gcm轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組蛋白表達(dá)菌株。在0.6 mmol·L-1IPTG的誘導(dǎo)下，檢測(cè)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)25℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的產(chǎn)量最高（圖5-B），所以在后續(xù)試驗(yàn)中選擇此條件進(jìn)行大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過(guò)鎳離子親和層析純化，獲得了純度較高的重組蛋白（圖5-C）。通過(guò)免疫小鼠，最終獲得了抗gcm血清，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明該抗體可以特異性識(shí)別外源重組Bmgcm蛋白（圖5-D）。

A：pET32a-gcm原核表達(dá)載體的鑒定 The construction of the PET32a-gcm plasmid。M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn) DNA marker；1：gcm擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR product of gcm；2：PET32a質(zhì)粒 pET32a vector；3：pET32a-gcm重組質(zhì)粒pET32a-gcm recombinant plasmid；4：pET32a-gcm質(zhì)粒酶切驗(yàn)證 Restriction enzyme digestion analysis of PET32a-gcm plasmid。B：Bmgcm在大腸桿菌中的表達(dá) Induction of Bmgcm protein in E. coli。M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn) Protein marker；1：未誘導(dǎo)重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli without induced by IPTG；2：未誘導(dǎo)重組菌包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli without induced by IPTG；3：16℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 16℃；4：16℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 16℃；5：25℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 25℃；6：25℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 25℃；7：37℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 37℃；8：37℃，0.6 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli by 0.6 mmol·L-1 IPTG at 37℃。C：Bmgcm重組蛋白純化 Purification of Bmgcm recombinant protein。M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn) Protein marker；1：純化得到的包涵體蛋白Purified Bmgcm protein。D：Bmgcm抗體Western blot檢測(cè)Bmgcm antibody detection with Western blot。1：菌體蛋白 Bacterial protein；2：純化得到的包涵體蛋白 Purified Bmgcm protein

2.7 Bmgcm蛋白亞細(xì)胞定位

將Bmgcm完整的表達(dá)框構(gòu)建至PIZ-OpIE2-GST- DsRed-SV40載體上，獲得PIZ-OpIE2-BmGcm-GST- DsRed和 PIZ-OpIE2-GST-DsRed-BmGcm質(zhì)粒，分別表達(dá)BmGcm-GST-DsRed和GST-DsRed-BmGcm兩種融合蛋白（圖6-A）。轉(zhuǎn)染家蠶BmE-SWU3細(xì)胞系3 d后，進(jìn)行固定和DAPI染色。熒光顯微觀測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照質(zhì)粒EGFP 陽(yáng)性信號(hào)均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，而重組質(zhì)粒EGFP 信號(hào)則只存在于細(xì)胞核中（圖6-B），說(shuō)明Bmgcm蛋白與其他物種同源蛋白一樣，定位于細(xì)胞核，是一類(lèi)核蛋白。

A：載體構(gòu)建策略 The strategy for constructing vector。B：細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIZ-OpIE2-GST-EGFP、PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed和PIZ-OpIE2-GST- DsRed-BmGcm質(zhì)粒后觀察 The cells transfected with PIZ-OpIE2-GST-EGFP, PIZ-OpIE2-BmGcm-GST-DsRed and PIZ-OpIE2-GST-DsRed-BmGcm plasmids。標(biāo)尺Scale bar=5 μm

2.8 Bmgcm過(guò)表達(dá)及對(duì)周期的影響

對(duì)PIZ-OpIE2-GST-DsRed和PIZ-OpIE2-BmGcm- GST-DsRed質(zhì)粒進(jìn)行改裝，去除了GST-DsRed表達(dá)元件（圖7-A）。Western blot結(jié)果表明PIZ-gcm質(zhì)粒能夠在家蠶BmE-SWU3細(xì)胞中顯著上調(diào)Bmgcm蛋白的表達(dá)水平（圖7-B）。隨后，利用EDU細(xì)胞增殖標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖要低于空載組（圖7-C），且差異顯著（＜0.05）（圖7-D）。同時(shí)利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例增高，且差異顯著（＜0.05），而S期細(xì)胞比例顯著降低（圖7-E、7-F）。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)過(guò)表達(dá)前后周期相關(guān)調(diào)控因子進(jìn)行檢測(cè)。如圖7-G所示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組除外，、、和均廣泛下調(diào)。

3 討論

Gcm作為一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在果蠅神經(jīng)[23,27-28]和血細(xì)胞[3,29]發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。在哺乳動(dòng)物（人和小鼠）以及果蠅等多種物種中均鑒定得到gcm的同源蛋白，這類(lèi)蛋白在N端均有一段非常保守的GCM motif基序，能夠特異性識(shí)別DNA上的(A/G)CCCGCAT序列[30]，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。為了揭示gcm在家蠶中的功能，通過(guò)檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)進(jìn)行鑒定和全長(zhǎng)克隆。與其他物種gcm蛋白結(jié)構(gòu)相似，BmGcm蛋白在N端也有一個(gè)保守的GCM motif，表明BmGcm與已報(bào)道的同源蛋白具有相似或相同的DNA結(jié)合模式，比對(duì)結(jié)果表明BmGcm蛋白與其他同源蛋白在GCM motif區(qū)域具有較高的保守性。

A：載體構(gòu)建策略 The strategy for constructing vector；B：Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)細(xì)胞中Bmgcm蛋白的表達(dá) Expression of Bmgcm protein in the transfected cells detected by western blot；C：EDU檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 The proliferate rates of transfected cells detected by EDU staining assay；D：轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖率統(tǒng)計(jì) Quantification of transfected cells positive for EDU staining；E：流式分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期（碘化丙啶染色） The cell cycle of transfected cells analyzed by flow cytometry (staining with pyridine iodide)；F：流式分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 Statistical analysis of the results from flow cytometry assay；G：周期相關(guān)基因定量檢測(cè)Quantitative detection of the genes related to cell cycle。*：p＜0.05；**：p＜0.01

在胚胎第4天表達(dá)達(dá)到峰值，隨后表達(dá)水平逐漸降低，暗示在家蠶胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。檢測(cè)在幼蟲(chóng)各組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因主要表達(dá)于中腸、精巢和卵巢，而在脂肪體有微弱的表達(dá)，暗示在這些組織中可能也發(fā)揮一定的功能。

核蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究中，核定位機(jī)制的確定是一項(xiàng)重要的研究?jī)?nèi)容。在真核細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)入核必須通過(guò)核孔復(fù)合體才能進(jìn)入細(xì)胞核。分子量較小的蛋白可以自由穿過(guò)或通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞核，而分子量較大的蛋白則需要與核輸入蛋白互作才能入核[25]。為了排除被動(dòng)運(yùn)輸?shù)母蓴_，在載體中添加了GST表達(dá)元件，這樣表達(dá)的GST-DsRed融合蛋白就只能定位于胞質(zhì)中，這也是許多學(xué)者在進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，特別是轉(zhuǎn)錄因子核定位信號(hào)分析時(shí)的一種常用策略[31-32]。圖6顯示GST-DsRed融合蛋白只分布于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核沒(méi)有信號(hào)，說(shuō)明該策略是有效的。此外，為了增加結(jié)果的可靠性，BmGcm蛋白與GST-DsRed融合標(biāo)簽采取了兩種不同的融合方式，即BmGcm-GST-DsRed和GST-DsRed-BmGcm。BmGcm熒光信號(hào)聚集于細(xì)胞核，這進(jìn)一步證實(shí)BmGcm也具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。

為了進(jìn)一步探索的功能，在家蠶BmE- SWU3細(xì)胞系上過(guò)表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組靶標(biāo)蛋白的表達(dá)水平明顯增高，意味著在細(xì)胞系水平成功過(guò)表達(dá)。本研究中，過(guò)表達(dá)會(huì)明顯抑制細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的細(xì)胞周期進(jìn)程明顯受到影響，G1期細(xì)胞比例增高，而S期細(xì)胞比例降低。定量結(jié)果顯示G1/S期細(xì)胞周期監(jiān)檢測(cè)點(diǎn)關(guān)鍵調(diào)控蛋白大部分出現(xiàn)了顯著的下調(diào)。推測(cè)可能通過(guò)調(diào)控這些周期相關(guān)蛋白，將細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。

4 結(jié)論

從家蠶基因組中克隆得到，該基因定位于4號(hào)染色體。在胚胎發(fā)育第4天表達(dá)達(dá)到峰值，而在幼蟲(chóng)階段，主要表達(dá)于中腸、精巢和卵巢。構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化獲得重組蛋白后免疫小鼠，成功制備了可特異識(shí)別重組蛋白的抗體。BmGcm蛋白定位于細(xì)胞核，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制增殖和影響正常的細(xì)胞周期進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification, expression, subcelluar localization, and function of() in silkworm ()

ZHANG Kui, PAN Guangzhao, SU Jingjing, TAN Juan, XU Man, LI Yutian, CUI Hongjuan

(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716)

【】The objective of this study is to identify and clone(), analyze its expression and subcelluar localization, prepare polyclonal antibody and overexpressat the cellular level to explore its function in proliferation and cell cycle, and to provide a theoretical basis for further studying the function of Bmgcm in.【】The full-length ofwas acquired by RACE technology. Basic sequence and structural information ofwere analyzed by using several online softwares, including ORF Finder and SMART. Multiple sequence alignment and evolutionary analysis were acquired by Clustalx and MEGA 6.0, respectively. The expression profile was investigated by RT-PCR and real-time PCR. The recombinant protein of Bmgcm was obtained using prokaryotic expression system, and purified with nickel affinity chromatography, then the antibody was prepared. Bmgcm over-expression vector was transfected intocell line to analyze the subcellular location of Bmgcm, and EDU and flow cytometry were used to study its function. 【】The(BGIBMGA006182) was clustered on nscaf2847 which was located on chromosome 4. The genomic DNA total length ofis 4 046 bp, which contains 4 exons and 3 introns. The full-length of cDNA is 1 734 bp, with a 166 bp 5′ UTR, a 227 bp 3′ UTR and a 1 341 bp open reading frame (ORF). This gene encodes 446 amino acid residues, the predicted molecular mass is 50.61 kD and the pI is 5.557, which contains a typical GCM-motif. Multiple sequence alignment demonstrated that GCM motif was highly conserved. Phylogenetic analysis revealed that gcm of insect was clustered alone, and Bmgcmhad thehighest relationship withgcm from. The expression profile revealed thatreached peak at the 4th day of embryonic period, and then gradually decreased during embryonic stage.mainly expressed in larval midgut, testis and ovary. The complete ORF sequence of Bmgcm was inserted into prokaryotic expression system, and the recombinant protein of Bmgcm was induced by IPTG and purified using affinity chromatography. Finally, mice were immunized with purified proteins to produce polyclonal anti-gcm antibody. Western blot results indicated that the antibody could specifically recognize the target protein. Moreover, Bmgcm was overexpressed incell line, and the result suggested that Bmgcm was located in nucleus. Furthermore,could inhibit cell proliferation and arrested cell cycle in G1/S period. 【】Thewas identified and cloned, its expression profile and subcelluar localization were analyzed. The available polyclonal antibody was generated by prokaryotic expression, affinity chromatography, and animal immunization. Overexpressedcould inhibit cell proliferation and affect cell cycle progression.

(); cloning; expression analysis; antibody preparation; overexpression

2017-08-13；

2017-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31672496）、中國(guó)博士后科學(xué)基金（2017M620408）、重慶市自然科學(xué)基金（cstc2016jcyjA0425）、重慶市高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（CXTDX201601010）

張奎，Tel：023-68251712；E-mail：Zhangk87@gmail.com，Zhangk87@163.com。

崔紅娟，Tel：023-68251713；E-mail：Hongjuan. cui@gmail.com，hcui@swu.edu.cn