李慧，李春曉，南鵬，王婷，王勁松，張競(jìng)堯，竇娜，馬飛，王海娟，錢海利，詹啟敏

乳腺癌是女性最常見的腫瘤，其發(fā)病率在女性腫瘤中占第一位[1]，死亡率占第二位，僅次于肺癌[1]， 其中人表皮生長(zhǎng)因子2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽(yáng)性乳腺癌約占全部乳腺癌的20%[2]。HER2是一種膜受體酪氨酸激酶，通過(guò)激活下游通路磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein Kinase B，PKB，又稱AKT)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖及存活能力[3]，是HER2陽(yáng)性乳腺癌患者治療的一個(gè)關(guān)鍵且有效的靶點(diǎn)[4]。隨著抗HER2靶向治療的發(fā)展日趨成熟，該型患者的治療效果也得到有效改善。據(jù)報(bào)道，在抗HER2靶向治療下，41%的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者腫瘤癥狀獲得完全緩解[5]，尤其是早中期乳腺癌患者生存期延長(zhǎng)更加明顯[6]。但并非所有HER2陽(yáng)性患者均能從抗HER2治療中獲益，仍有一些患者的總生存期極短[6]，其主要原因之一便是抗HER2治療耐藥[7]，這可能是HER2基因突變導(dǎo)致蛋白構(gòu)象改變引發(fā)的治療性耐藥現(xiàn)象[8]，也可能是抗HER2治療常用藥物曲妥珠單抗與HER2蛋白結(jié)合受阻導(dǎo)致的耐藥[9]。所以，闡明抗HER2治療耐藥的機(jī)制將為HER2陽(yáng)性乳腺癌耐藥患者的治療提供新的靶標(biāo)和治療思路。但迄今為止抗HER2治療耐藥的具體機(jī)制還不甚清楚，現(xiàn)有研究亦局限于體外實(shí)驗(yàn)或小樣本研究，仍然缺乏大樣本數(shù)據(jù)支持。

為此，本研究從TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的1105例乳腺癌患者中遴選了所有HER2陽(yáng)性乳腺癌患者181例，對(duì)其生存時(shí)間及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者總生存時(shí)間相關(guān)的候選通路，并在KMplot(Kaplan Meier-plotter)數(shù)據(jù)庫(kù)中驗(yàn)證候選通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因及通路其他基因與患者總生存時(shí)間的相關(guān)性，在HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系中驗(yàn)證候選通路與抗HER2治療耐藥的相關(guān)性，期望有助于闡明抗HER2治療耐藥的機(jī)制，為抗HER2治療耐藥機(jī)制的研究和HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及材料 HER2陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞系BT474保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，RPMI 1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)。HER2小分子抑制劑拉帕替尼(lapatinib，Cat Num: S2111)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；PI3K抑制劑(PI103，Cat Num: S1038)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。

1.2 藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用檢測(cè) 利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(real-time cell analyzer，RTCA； xCELLigence 檢測(cè)系統(tǒng)，杭州艾森生物有限公司)檢測(cè)細(xì)胞阻抗值并以此計(jì)算細(xì)胞指數(shù)(cell index)以反映細(xì)胞增殖數(shù)目。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BT474細(xì)胞消化并接種于該儀器配置的含微陣列檢測(cè)電極的細(xì)胞增殖培養(yǎng)板 E-Plate S16(16孔板)中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24h狀態(tài)恢復(fù)后分別加入不同濃度的目的藥物，之后每隔1h檢測(cè)一次，計(jì)算細(xì)胞指數(shù)，指示細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及項(xiàng)目

1.3.1 HER2陽(yáng)性乳腺癌患者總生存(overall survival, OS)及實(shí)驗(yàn)分組 選擇TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中含1105例乳腺癌患者的暫時(shí)(provisional)人群，其中OS信息完整的女性HER2陽(yáng)性乳腺癌患者181例，對(duì)其進(jìn)行OS分析。將其中Ⅰ/Ⅱ期的128例患者根據(jù)OS分為<2年(A1組)和>8.5年(A2組)兩組，對(duì)兩組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；另外將其中Ⅲ/Ⅳ期的53例患者根據(jù)OS分為<2年(B1)和>7年(B2)兩組，對(duì)兩組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.3.2 Ⅰ/Ⅱ期A1與A2組以及Ⅲ/Ⅳ期B1與B2組HER2陽(yáng)性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比較分析 采用edgeR軟件包對(duì)A1與A2組、B1與B2組轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析。隨后對(duì)上調(diào)的部分差異基因(有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且變化倍數(shù)大于4)進(jìn)行KEGG通路富集，分析兩組患者中主要的相關(guān)差異通路。

1.3.3 Ⅰ/Ⅱ期A1組與Ⅲ/Ⅳ期B1組患者上調(diào)差異基因交集分析 采用Venny在線網(wǎng)站分析A1組與B1組上調(diào)差異基因的交集基因，隨后進(jìn)行KEGG通路富集，選擇與HER2密切相關(guān)的通路進(jìn)行后續(xù)研究驗(yàn)證。

1.3.4 驗(yàn)證PI3K/AKT通路對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS的影響 為了驗(yàn)證PI3K/AKT通路過(guò)度激活與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS的相關(guān)性，采用KMplot數(shù)據(jù)庫(kù)中HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的PI3K基因表達(dá)水平與OS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)KMplot數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)計(jì)算PI3K和AKT基因的界值(cut-off)，將患者分為高、低表達(dá)組，分別繪制不同表達(dá)組患者的Kplan-Meier曲線，觀察患者OS的差異。

1.3.5 PI3K抑制劑與HER2小分子抑制劑對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)抑制作用的相關(guān)性分析 為了驗(yàn)證PI3K/AKT通路過(guò)度激活與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥之間的相關(guān)性，采用2.5μmmol/L 拉帕替尼和2.5μmmol/L PI3K抑制劑分別單獨(dú)或聯(lián)合處理HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系BT474，觀察藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

1.3.6 可能影響抗HER2治療耐藥的PI3K/AKT通路的其他基因分析 除PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因外，該通路其他基因也可能與抗HER2治療耐藥相關(guān)。通過(guò)KMplot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)A1組和B1組上調(diào)差異基因的交集基因進(jìn)行分析，尋找與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS相關(guān)且位于PI3K/AKT通路上的其他基因。

1.4 數(shù)據(jù)來(lái)源和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 PI3K、AKT、CFAP221和COL4A6表達(dá)水平與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者總生存時(shí)間差異的相關(guān)分析數(shù)據(jù)來(lái)自KMplot數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Kaplan-Meier法繪制患者OS曲線并應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。其余HER2陽(yáng)性乳腺癌患者生存及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，差異基因分析利用edgeR軟件包完成計(jì)算，差異基因KEGG通路富集通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)完成，差異基因的交集基因分析通過(guò)在線網(wǎng)站Venny完成，其余數(shù)據(jù)處理均通過(guò)GraphPad完成。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布的情況下以±s表示，細(xì)胞指數(shù)間的差異采用兩因素設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行比較，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS情況 在181例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者中，OS最長(zhǎng)可超過(guò)8.5年，尤其是128例Ⅰ/Ⅱ期的患者，其OS>8.5年者超過(guò)60%(圖1)，但其中4例OS<2年。53例Ⅲ/Ⅳ期患者的OS相對(duì)較短，但有4例OS大于7年。據(jù)此本研究將Ⅰ/Ⅱ期OS<2年者定義為A1組(n=4)，將>8.5年者定義為A2組(n=4)，后續(xù)研究將兩組患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比較；同時(shí)將Ⅲ/Ⅳ期患者中OS<2年(B1組，n=4)與>7年(B2組，n=4)的患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

圖1 各分期HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的OSFig.1 Overall survival (OS) of patients with HER2-positive breast cancer in each stage

2.2 A1和A2組HER2陽(yáng)性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較結(jié)果 利用edgeR軟件包對(duì)兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，結(jié)果可見差異基因共2069個(gè)(P<0.05)，其中A1組比A2組表達(dá)上調(diào)的差異基因共697個(gè)，表達(dá)下調(diào)的差異基因共1372個(gè)(圖2A)。由于小分子抑制劑和抗體類藥物在HER2陽(yáng)性乳腺癌患者治療中應(yīng)用更為廣泛，所以本研究更關(guān)注上調(diào)的部分差異基因，因此對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且變化倍數(shù)大于4的529個(gè)上調(diào)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A1組患者表達(dá)上調(diào)的基因KEGG富集到的通路排在前10位的分別是：代謝通路、神經(jīng)活性配體受體互作通路、癌癥通路、趨化因子信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體互作通路、干細(xì)胞多能性調(diào)節(jié)通路、Wnt信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路和谷氨酸能突觸通路(圖2B)。

2.3 B1和B2組HER2陽(yáng)性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較結(jié)果 利用edgeR軟件包對(duì)兩組患者的轉(zhuǎn)錄組差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因共2039個(gè)，其中B1組比B2組表達(dá)上調(diào)的差異基因共1023個(gè)(P<0.05)，表達(dá)下調(diào)的差異基因共1016個(gè)(P<0.05，圖3A)。將B1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且變化倍數(shù)超過(guò)4倍的705個(gè)上調(diào)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集，結(jié)果表明B1組患者表達(dá)上調(diào)的基因KEGG富集得到的前3位通路分別是代謝通路、PI3K/AKT通路和神經(jīng)活性配體受體互作通路(圖3B)，這3個(gè)通路均是A1組上調(diào)差異基因富集到的通路。

圖2 A1與A2組患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析Fig.2 Transcriptome data of patients in groups A1 and A2

圖3 B1與B2組患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析Fig.3 Transcriptome data of patients in groups B1 and B2

2.4 A1組與B1組患者上調(diào)差異基因交集分析結(jié)果A1與B1組的上調(diào)差異基因共120個(gè)交集基因(圖4A)，將這些交集基因進(jìn)行KEGG通路富集后發(fā)現(xiàn)兩組富集到的相同通路包括PI3K/AKT通路和代謝通路(圖4B)，這兩條通路并列第一位。雖然在這兩條通路中富集到的基因數(shù)相同，但由于PI3K/AKT通路是HER2的下游通路，因此我們認(rèn)為PI3K/AKT通路的過(guò)度激活與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS相關(guān)。此外，由于富集到的代謝通路涉及類固醇生物合成等多條通路，明確其中與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS相關(guān)的具體通路需要更加深入的分析，因此在本研究中僅選擇PI3K/AKT通路作為候選通路進(jìn)行重點(diǎn)驗(yàn)證。

圖4 A1組上調(diào)差異基因與B1組上調(diào)差異基因的交集基因分析Fig.4 Overlapping genes analysis of up-regulated differential genes in groups A1 and B1

2.5 PI3K/AKT通路與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS的相關(guān)性驗(yàn)證結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PI3K和AKT低表達(dá)者比較，高表達(dá)患者的OS更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025，圖5A；P=0.0063，圖5B)。

2.6 PI3K抑制劑與HER2小分子抑制劑對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系BT474生長(zhǎng)抑制作用的相關(guān)性驗(yàn)證結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑能夠增強(qiáng)拉帕替尼對(duì)BT474的生長(zhǎng)抑制作用(P=0.019，圖6)。

圖5 PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)PI3K和AKT基因高、低表達(dá)患者OS的Kplan-Meier曲線Fig.5 Kplan-Meier curve of OS in patients with high and low expressions of PI3K(A) and AKT(B)

圖6 PI3K抑制劑與拉帕替尼對(duì)BT474細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的相關(guān)性驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 The correlation between PI3K inhibitors and growth inhibitory effect of lapatinib on BT474 cells

2.7 可能影響抗HER2治療耐藥的PI3K/AKT通路其他基因分析結(jié)果 A1組與B1組患者共有120個(gè)上調(diào)的交集基因，其中19個(gè)基因高表達(dá)患者的OS明顯短于低表達(dá)患者(P<0.05)。其中CFAP221基因(P=0.00097，圖7A)可能是PI3K/AKT通路中基因之一。此外，這19個(gè)基因中還包括KEGG通路富集到的PI3K/AKT通路基因COL4A6，其高表達(dá)患者OS也短于低表達(dá)患者(P=0.037，圖7B)。

圖7 PI3K/AKT通路CFAP221(A)和COL4A6(B)基因不同表達(dá)水平患者OS的Kplan-Meier曲線Fig.7 Kplan-Meier curve of OS in patients with different expression levels of CFAP221(A) and COL4A6 (B) in the PI3K/AKT pathway

3 討 論

HER2陽(yáng)性乳腺癌患者首選抗HER2治療，常用的抗HER2治療藥物包括單克隆抗體，如曲妥珠單抗(商品名赫賽汀)[10]，以及一些小分子抑制劑如拉帕替尼[11]。雖然超過(guò)40%的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者均受益于抗HER2治療[12]，但仍有不少患者對(duì)抗HER2治療耐藥，既包括原發(fā)性耐藥，也包括繼發(fā)性耐藥[13]?？笻ER2治療耐藥的發(fā)生增加了HER2陽(yáng)性乳腺癌患者死亡和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[14]，是造成患者OS短的主要原因之一[7]。關(guān)于抗HER2治療耐藥的機(jī)制已有一些報(bào)道：HER2自身的改變會(huì)導(dǎo)致抗HER2治療耐藥，如HER2失活突變，HER2 L755S突變引起的HER2失活會(huì)導(dǎo)致HER2小分子抑制劑拉帕替尼耐藥[15]；細(xì)胞表面黏蛋白如MUC4高表達(dá)會(huì)形成空間位阻從而阻止赫賽汀與HER2的特異性結(jié)合，導(dǎo)致赫賽汀耐藥[16]。免疫相關(guān)調(diào)控也會(huì)影響抗HER2治療耐藥的發(fā)生，HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)介素U(NmU)高表達(dá)會(huì)提高免疫抑制分子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和程序性死亡配體L1(PD-L1)的表達(dá)水平，從而通過(guò)增加免疫逃逸而引發(fā)耐藥[17]。盡管如此，有關(guān)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者抗HER2治療的耐藥機(jī)制仍然不是很清楚。

本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中181例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組及生存數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Ⅰ/Ⅱ期患者中，與A2組患者相比，A1組明顯上調(diào)的基因經(jīng)KEGG通路富集分析后，HER2下游通路PI3K/AKT被富集于第9位；在Ⅲ/Ⅳ期患者中，與B2組患者相比，B1組明顯上調(diào)的基因經(jīng)KEGG通路富集分析后，PI3K/AKT通路被富集于第2位。將A1組與B1組明顯上調(diào)的120個(gè)交集基因進(jìn)行KEGG通路富集后，PI3K/AKT通路被富集在第1位。該結(jié)果提示HER2下游通路PI3K/AKT過(guò)度激活與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS短相關(guān)。通過(guò)KMplot數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路的2個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因PI3K和AKT高表達(dá)的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS均短于低表達(dá)患者，這進(jìn)一步說(shuō)明PI3K/AKT通路過(guò)度激活與患者生存期短相關(guān)。為闡明PI3K/AKT通路過(guò)度激活是否會(huì)影響HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗HER2藥物治療的敏感性，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PI3K抑制劑能夠增強(qiáng)HER2小分子抑制劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，說(shuō)明PI3K/AKT通路過(guò)度激活有可能與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥有關(guān)。

關(guān)于PI3K/AKT通路過(guò)度激活引發(fā)抗HER2治療耐藥的機(jī)制研究已有一些報(bào)道。陳曦等[18]通過(guò)體外誘導(dǎo)獲得赫賽汀耐藥細(xì)胞株，證實(shí)赫賽汀耐藥株中PI3K/AKT通路過(guò)度激活，在抑制PI3K活性后，細(xì)胞對(duì)赫賽汀再次變得敏感。Wang等[19]提出PI3K/AKT通路過(guò)度激活是導(dǎo)致拉帕替尼耐藥的機(jī)制之一。但是這些研究均為體外實(shí)驗(yàn)或小樣本研究結(jié)果，缺乏大樣本研究支持。本研究利用TCGA中的大樣本人群數(shù)據(jù)為這一結(jié)論提供了理論支持。

通過(guò)KMplot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)A1組與B1組上調(diào)差異基因的120個(gè)交集基因的基因表達(dá)水平與OS之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，除PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因之外，PI3K/AKT通路基因CFAP221或COL4A6高表達(dá)的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS也短于低表達(dá)患者，因此推測(cè)這兩個(gè)基因也可能與抗HER2治療耐藥相關(guān)。CFAP221基因全稱是纖毛和鞭毛相關(guān)蛋白221，與該基因相關(guān)的研究報(bào)道還不是很多，但已有研究證實(shí)該基因與鈣調(diào)蛋白具備相互作用[20]。 而對(duì)于鈣調(diào)蛋白與腫瘤之間的相關(guān)性已有不少報(bào)道，如Wang等[21]證實(shí)在肝臟中鈣調(diào)蛋白可激活PI3K/AKT通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。根據(jù)本研究的分析結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道[22]，PI3K/AKT通路上的另一個(gè)基因COL4A6高表達(dá)同樣會(huì)縮短HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的OS。因此，PI3K/AKT通路基因CFAP221和COL4A6也可能與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥相關(guān)。

本研究通過(guò)TCGA大數(shù)據(jù)分析證實(shí)PI3K/AKT通路過(guò)度激活與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS及抗HER2治療耐藥相關(guān)，提出對(duì)抗HER2治療耐藥的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者可嘗試PI3K抑制劑聯(lián)合治療的設(shè)想。除PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因之外，該通路其他基因CFAP221和COL4A6也可能與抗HER2治療耐藥相關(guān)。本研究結(jié)果為HER2陽(yáng)性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥機(jī)制的研究提供了大樣本數(shù)據(jù)分析支持，同時(shí)為抗HER2治療耐藥的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療提供了新的可借鑒的參考。

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