莫允煥，薛健長(zhǎng)，曾小波

(李錦記(新會(huì))食品有限公司，廣東 江門　529156)

目前，對(duì)于微量乙醇的測(cè)定主要以氣相色譜法為主，但檢測(cè)儀器投入大，檢測(cè)成本高，制約了此方法的廣泛應(yīng)用。重鉻酸鹽氧化分光光度法測(cè)定微量乙醇含量，是一種快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法，它具有操作簡(jiǎn)便、所需分析儀器簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，尤其適用于生產(chǎn)和質(zhì)檢部門的日常分析。而隨著科技的發(fā)展，更多的檢測(cè)儀器、檢測(cè)手段的應(yīng)用，是否有更快捷、更簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法呢？

在《中國(guó)藥典2005版一部》附錄Ⅸ M 乙醇量測(cè)定法Ⅱ中提及了蒸餾法的測(cè)定，是對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾后獲得乙醇餾出物進(jìn)行相對(duì)密度的測(cè)定，從而折算出乙醇的含量[1]。此方法在應(yīng)用儀器、檢測(cè)步驟、檢測(cè)時(shí)間上具備優(yōu)勢(shì)，符合企業(yè)生產(chǎn)檢測(cè)需求。

1　材料和方法

通過(guò)氣相色譜法(第一法)、重鉻酸鹽氧化分光光度法、蒸餾測(cè)量相對(duì)密度法測(cè)量發(fā)酵醬油中微量乙醇含量的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和數(shù)據(jù)結(jié)果，得出企業(yè)實(shí)際應(yīng)用的最優(yōu)檢測(cè)方案。

1.1　材料和試劑

典型廣式醬油和日式醬油：由李錦記(新會(huì))食品有限公司提供。

乙醇(無(wú)水乙醇)：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2　儀器和設(shè)備

GC-2010 Plus氣相色譜儀日本島津公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；凱氏定氮儀德國(guó)福斯分析儀器公司；DMA4500M密度計(jì)奧地利安東帕公司；電爐、電磁爐、蒸餾回流設(shè)備、容量瓶等常用實(shí)驗(yàn)室儀器廠家。

1.3　方法

1.3.1氣相色譜法測(cè)定乙醇含量

氣相色譜法應(yīng)用范圍廣，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)已將氣相色譜法列為啤酒、葡萄酒、果酒中酒精度的測(cè)定方法之一[2,3]；氣相色譜法測(cè)定藥酒中的乙醇量[4]；氣相色譜法測(cè)定果蔬汁飲料、含乳飲料中的乙醇含量[5]；氣相色譜法測(cè)定消毒劑中的乙醇含量[6]；中國(guó)藥典中酒精度的測(cè)定已將氣相色譜法列為第一分析法。

氣相色譜法測(cè)定乙醇含量主要應(yīng)用外標(biāo)法定量。用欲測(cè)組分的純物質(zhì)加稀釋劑(對(duì)液體試樣用溶劑稀釋，氣體試樣用載氣或空氣稀釋)配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取固定量標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，從所得色譜圖上測(cè)得相應(yīng)信號(hào)(峰面積或峰高)，然后繪制響應(yīng)信號(hào)(縱坐標(biāo))對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(橫坐標(biāo))的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。分析時(shí)，取和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)同樣量的試劑(固定量進(jìn)樣)，測(cè)得該試樣的響應(yīng)信號(hào)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出其質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。

圖1　氣相色譜乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ethanol concentration by gas chromatography

用外標(biāo)法進(jìn)行定量具有不使用校正因子、操作簡(jiǎn)單、計(jì)算方便等優(yōu)點(diǎn)，但是這種方法結(jié)果的準(zhǔn)確度主要取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性，且檢測(cè)儀器(色譜儀)投入大，檢測(cè)成本高。

1.3.2分光光度法測(cè)定乙醇含量

重鉻酸鹽氧化分光光度法測(cè)定微量乙醇含量，是一種快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法，它具有操作簡(jiǎn)便、所需分析儀器簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，適用于生產(chǎn)和質(zhì)檢部門的日常分析。

在酸性溶液中，乙醇可被重鉻酸氧化生成乙酸，重鉻酸鉀中的六價(jià)鉻被還原成三價(jià)鉻，其反應(yīng)式為：

3C2H5OH+2K2Cr2O7+8H2SO4=3CH3COOH+2K2SO4+2Cr2(SO4)+11H2O。

反應(yīng)中生成的三價(jià)鉻為綠色，它在585 nm處有最大吸收峰，且溶液顏色的深淺與乙醇含量成正比，可以在分光光度計(jì)上比色，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)系列比較進(jìn)行定量[8,9]。

取6支25 mL A級(jí)比色管，各加入1 mL重鉻酸鉀溶液和5 mL濃H2SO4，混勻，并冷卻，依次加入表1中的溶液。

表1　標(biāo)準(zhǔn)溶液配制Table 1 The preparation of standard solution

搖勻，于沸水浴中保溫發(fā)色10 min，取出冷卻至常溫，于600 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)吸光度Table 2 The absorbance of standard solution

由表1和表2繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2　分光光度法乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ethanol concentration by spectrophotometry

取50 mL 樣品置入500 mL圓底燒瓶中，加150 mL蒸餾水，連接好冷凝裝置(檢查出水管是否暢通，保證冷卻水進(jìn)出自如)后蒸餾，用50 mL容量瓶(接收容量瓶用冰粒冷卻)準(zhǔn)確接收餾出液50 mL，搖勻。根據(jù)樣品大概酒精含量以倍數(shù)(N)稀釋餾出液(0～0.1%不稀釋；0.1%～1% 稀釋10倍；1%～10%稀釋50倍；10%～30%稀釋100倍)。吸取5 mL稀釋液置入25 mL比色管中，加 1 mL 2%重鉻酸鉀溶液、5 mL濃硫酸，搖勻，于沸水浴中保溫發(fā)色10 min，取出冷卻。600 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得乙醇含量。

用分光光度法進(jìn)行定量的測(cè)定方法具有操作簡(jiǎn)便、所需分析儀器簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。但是這種方法結(jié)果容易受試劑變化所影響，因此每次新配試劑均需重新制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[10]。

1.3.3蒸餾法測(cè)定相對(duì)密度換算成乙醇含量

以蒸餾法去除樣品中的不揮發(fā)性物質(zhì)，再測(cè)量餾出液的相對(duì)密度，換算成乙醇含量[11-14]。

1.3.3.1蒸餾

依照分光光度法測(cè)定的蒸餾步驟，使用蒸餾瓶連接冷凝裝置接出餾出液，見(jiàn)圖3。

圖3　蒸餾裝置Fig.3 Distillation apparatus

使用凱氏定氮蒸餾儀，設(shè)定100 ℃，3 min，接出餾出液，見(jiàn)圖4。

圖4　凱氏定氮蒸餾儀Fig.4 Kjeldahl distillation apparatus

1.3.3.2相對(duì)密度

其原理是通過(guò)儀器內(nèi)部的U型振蕩管密度計(jì)測(cè)量餾出液密度后換算成乙醇濃度，見(jiàn)圖5。

圖5　安東帕DMA4500MFig.5 Anton Paar DMA4500M

其中蒸餾方法①操作步驟多，玻璃儀器連接的氣密性對(duì)最終結(jié)果影響較大，相對(duì)時(shí)間長(zhǎng)(約45 min/樣)；蒸餾方法②時(shí)間短(僅3 min)，且操作步驟少，可相應(yīng)減少檢測(cè)過(guò)程誤差的產(chǎn)生。在嘗試蒸餾方法②時(shí)，乙醇標(biāo)準(zhǔn)液回收率檢測(cè)合格。但檢測(cè)我公司產(chǎn)品時(shí)，沸騰后會(huì)產(chǎn)生很多泡沫，溢出蒸餾罐，造成檢測(cè)結(jié)果的誤差。通過(guò)一系列嘗試，最終添加少量單硬脂酸甘油酯(食品級(jí)消泡劑)可避免此現(xiàn)象。

2　結(jié)果和分析

2.1　方法有效性驗(yàn)證

氣相色譜法和分光光度法均收錄在國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法中，則此兩種方法不做相關(guān)回收率驗(yàn)證。主要對(duì)蒸餾測(cè)相對(duì)密度法進(jìn)行回收率驗(yàn)證，用標(biāo)準(zhǔn)溶液驗(yàn)證。計(jì)算儀器引起的偏差和檢測(cè)方法的偏差，以判斷方法的可行性，驗(yàn)證數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3　標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率結(jié)果Table 3 Recoveries of standard solution

再依據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中關(guān)于回收率范圍的規(guī)定[15]，見(jiàn)表4。

表4　回收率范圍Table 4 The recoveries range

得出結(jié)論：配制濃度為0.1%的樣品檢測(cè)偏差超出回收率許可范圍，即此方法不適用于0.2%以下乙醇含量的樣品檢測(cè)。而0.2%標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)結(jié)果的儀器和檢測(cè)方法偏差均較大，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以考察該方法的最低檢測(cè)限和方法的穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表5　最低檢測(cè)限和穩(wěn)定性驗(yàn)證Table 5 Minimum detection limit and stability verification

再依據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中關(guān)于測(cè)定值與真值的偏差指導(dǎo)范圍的規(guī)定，見(jiàn)表6。

表6　測(cè)定值與真值的偏差指導(dǎo)范圍Table 6 Range of deviation between measured value and true value

配制濃度為0.5%以下的樣品檢測(cè)偏差超出偏差許可范圍，即此方法不適用于0.5%以下乙醇含量的樣品檢測(cè)。0.5%以上的結(jié)果偏差符合要求且穩(wěn)定性較好。

最后進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用驗(yàn)證(發(fā)酵醬油產(chǎn)品加標(biāo)回收)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表7。

表7　加標(biāo)回收測(cè)試Table 7 The recovery rate

同時(shí)考慮常規(guī)發(fā)酵醬油產(chǎn)品乙醇含量在1%～3%之間，因此該方法符合發(fā)酵醬油檢測(cè)無(wú)水乙醇的要求。

2.2　三種檢測(cè)方法的對(duì)比

2.2.1檢測(cè)成本對(duì)比

方法一儀器投入成本高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，每日(以8 h算)樣品處理量約6～8個(gè)；方法二儀器投入成本不高，且所用儀器(蒸餾設(shè)備、分光光度計(jì)等)為日常醬油檢測(cè)所用儀器，操作簡(jiǎn)便。但是這種方法結(jié)果容易受試劑變化所影響，因此每次新配試劑均需重新制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，每日樣品處理量約20～30個(gè)；方法三儀器簡(jiǎn)單，所用儀器(蒸餾設(shè)備、比重計(jì)等)為日常醬油檢測(cè)所用儀器。不需消耗化學(xué)試劑，每日樣品處理量約40～60個(gè)。

2.2.2檢測(cè)結(jié)果精密度對(duì)比

使用三種方法對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)對(duì)照，以氣相色譜法(第一分析法)檢測(cè)的樣品結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果對(duì)分光光度法和蒸餾測(cè)相對(duì)密度法的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，判斷后面兩種方法的精確度，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8　結(jié)果對(duì)比Table 8 The results of comparison

由表8可知，蒸餾測(cè)相對(duì)密度法所得的樣品乙醇含量與氣相法所測(cè)結(jié)果較接近。

3　結(jié)論

微量乙醇的測(cè)定方法在我公司檢測(cè)樣品應(yīng)用的發(fā)展，由最初氣相法測(cè)定的樣品檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高，優(yōu)化到分光光度法檢測(cè)。而分光光度法檢測(cè)的操作步驟多、相對(duì)誤差大，最終開(kāi)發(fā)應(yīng)用了蒸餾測(cè)相對(duì)密度法。相比之下每次的方法改進(jìn)都比之前的檢測(cè)更快捷方便，降低了檢測(cè)成本。同時(shí)，新方法的開(kāi)發(fā)使用必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)尿?yàn)證。

其他檢驗(yàn)方法在日常應(yīng)用中也要與時(shí)俱進(jìn)，食品檢驗(yàn)人員必須具備相關(guān)學(xué)習(xí)應(yīng)用和優(yōu)化檢驗(yàn)方法的技能。

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