賈洪信

(廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學(xué)院，廣東 佛山　528216)

香菜(Coriandrumsativum)，別名芫荽、香荽等，傘形科，是具有強烈清香氣味的草本植物。香菜營養(yǎng)豐富，每 100 g中含有碳水化合物 6.9 g，蛋白質(zhì) 20 g，鐵 5.6 mg，脂肪 0.3 g，鈣170 mg，磷 49 mg，VC41 mg，胡蘿卜素 3.77 mg，它的胡蘿卜素含量是菜豆、西紅柿、黃瓜的 10倍以上，鐵、鈣的含量也高于許多其他的葉類蔬菜，另外還含有硫胺素、尼克酸、核黃素以及揮發(fā)油、黃酮甙、右旋甘露糖醇等[1]，主要用于消化困難、膨脹等癥狀，還有鎮(zhèn)痛效果[2]。國內(nèi)外諸多研究表明：香菜還具有利尿[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]、抗氧化[6]、降糖、降脂、抑制鉛沉積、促毛發(fā)生長等保健作用[7,8]。

黃酮類物質(zhì)是一類天然的抗氧化劑，在自然界中廣泛存在于各類蔬菜、水果及中草藥中。黃酮類化合物(flavonoids)，又名生物類黃酮化合物(bioflavonoids)，現(xiàn)泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A和B)通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。由于天然黃酮類化合物具有多種生物活性，所以國內(nèi)外專家學(xué)者對不同植物體進行了大量黃酮類化合物的研究報道。楊洋等[9]比較了熱水提取法、堿液提取法和70%乙醇提取法3種方法對柚皮中黃酮類化合物的提取效率的影響；陳紅梅等[10]以微波法處理蓮房，蓮房黃酮得率為11.42%；張吉祥等[11]用微波法提取棗核，得到黃酮含量為7%；Cao 等[12]研究了纖維素酶輔助法在植物黃酮類化合物提取中的應(yīng)用；楊保求等[13]用纖維素酶酶解紅棗核，黃酮提取率為4.88 mg/g，比沒有添加酶的總黃酮提取率高24.3%；岳紅等[14]研究了超臨界CO2萃取柿葉黃酮的工藝。

香菜大多情況下用來食用，對其研究開發(fā)較少。香菜相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分的分離和鑒定、干燥特性及貯藏品質(zhì)的影響、提取工藝優(yōu)化和栽培技術(shù)等[15-23]。目前，對于香菜的抗氧化方面的報道較少，田迪英等[24]發(fā)現(xiàn)香菜提取物都對魚油具有抗氧化作用，陳志紅等[25]研究香菜乙醇提取液對羥自由基和超氧陰離子自由基均有清除作用。因此本研究采用單因素試驗和正交試驗確定香菜黃酮的最佳提取條件，并進行其抗氧化性能的測定。

1　材料與方法

1.1　試驗材料和試劑

新鮮香菜：購于廣東省湛江市赤坎區(qū)市場；

蘆丁和VitC對照品：購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司購買；

無水乙醇、無水硫酸鐵、過氧化氫、水楊酸、硫酸、磷酸三鈉、硫酸亞鐵、鉬酸銨、水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2　試驗儀器和設(shè)備

GX-3020干燥箱東莞市高鑫檢測設(shè)備有限公司；DJ-04B粉碎機上海鼎廣機械設(shè)備有限公司；FC104電子天平上海精科天平廠； DZKW-C型電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海樹立儀器儀表有限公司；723N可見分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司；LG16-W離心機北京京立離心機有限公司；電冰箱廣東科龍電器股份有限公司；回流裝置等。

1.3　試驗方法

1.3.1香菜提取液的制備

香菜用自來水沖洗干凈，再用雙蒸水沖洗，晾干，80 ℃烘烤8 h，過40目篩粉碎得香菜粉末。稱量1 g香菜粉末，加95%乙醇25 mL，95 ℃回流2次，每次2 h，合并提取液，過濾，定容于50 mL容量瓶中，得到濃度為20 g/L的香菜提取液。

1.3.2單因素試驗設(shè)計

分別以回流溫度、回流時間和乙醇濃度為因素(見表1)，以香菜提取液的黃酮含量為評價指標(biāo)，利用單因素試驗確定各因素的最適范圍。

表1　單因素試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor design

1.3.3正交優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行L9(33)正交優(yōu)化試驗設(shè)計(見表2)，建立數(shù)字化模型，對香菜生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化。

表2　正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(33) orthogonal design

1.3.4黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定樣品中黃酮的含量[26]。0.4 mL樣品與0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液室溫反應(yīng)6 min后，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液混勻后反應(yīng)6 min，加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液和5.0 mL蒸餾水充分混勻，反應(yīng)15 min后，于波長510 nm處測吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(20～100 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0079x-0.037，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999。由回歸方程計算5倍稀釋提取液中黃酮的含量C(mg/L)，則香菜中總黃酮的含量(mg/g)=C×5/20。

1.3.5抗氧化活性的研究

1.3.5.1總抗氧化能力測定

采用磷鉬絡(luò)合法測定樣品的總抗氧化能力[27]。試管中依次加入3 mol/L H2SO4溶液2 mL、0.14 mol/L Na3PO4溶液2 mL和0.02 mol/L鉬酸銨溶液2 mL。再加入2 mL樣品，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻。加塞于95 ℃水浴中加熱90 min，取出冷卻后用空白(蒸餾水代替樣品)調(diào)零在695 nm波長下測量。以VitC為標(biāo)準(zhǔn)品(40～120 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=8.085x-0.1219，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9991。

1.3.5.2還原能力的測定

取1.0 mL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6) 2.5 mL和1% 鐵氰化鉀2.5 mL，混合均勻，于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min后急速冷卻；取出再加入10% 三氯乙酸2.5 mL[28]。而后于3000 r/min下離心10 min，取上清液2.5 mL加入蒸餾水2.5 mL，加1 mg/L三氯化鐵0.5 mL，混勻后用分光光度計于700 nm波長處測定吸光值。以VitC為標(biāo)準(zhǔn)品(60～140 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=5.337x+0.083，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9993。

1.3.5.3羥基自由基清除能力的測定

取2.0 mL不同濃度的樣品，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，混勻后靜置10 min[29]；再加入6 mmol/L水楊酸2.0 mL，混勻靜置30 min后于510 nm處測其吸光度，所得值為Ai；用去離子水代替H2O2時測定吸光值為Aj；空白對照組以2.0 mL蒸餾水代替不同濃度的樣品，測定其吸光度為A0。每個濃度提取液平行做3次，結(jié)果取平均值。用以下公式計算對·OH的清除率:

清除率 Y =[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

1.3.5.4超氧自由基清除能力的測定

取50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)4.5 mL，于25 ℃下預(yù)熱20 min，加入1.0 mL不同濃度的樣品，接著立即加入25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL混勻，25 ℃水浴反應(yīng)30 s后，立即滴加10 mmol/L的鹽酸1.0 mL終止反應(yīng)[30]，于320 nm下測定吸光度Ai；空白對照組以1.0 mL蒸餾水代替不同濃度的樣品，測定其吸光度A0。

清除率=(A0-Ai)/A0×100%。

1.3.6統(tǒng)計分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析。本實驗均做了3次平行，結(jié)果為3次實驗的平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗

圖1　回流溫度對黃酮含量的影響Fig.1 Effect of the refluxing temperature on the content of total flavonoids

由圖1可知，隨著回流溫度升高，總黃酮含量隨之增加，當(dāng)溫度達到80 ℃時，總黃酮含量最高，總黃酮含量達到21.79 mg/g。溫度過高，黃酮容易受到高溫破壞，其他雜質(zhì)分子溶出量也相應(yīng)增加，會給后續(xù)工作帶來不便[31]。為保證總黃酮能夠被充分提取的同時防止過高溫度所引起的黃酮類化合物分解以及溶劑的損失，考慮多種因素的影響，在探討香菜乙醇回流最適合研究試驗中選擇最適宜提取溫度在80 ℃范圍內(nèi)。

圖2　回流時間對黃酮含量的影響Fig.2 Effect of the refluxing time on the content of total flavonoids

由圖2可知，在60～75 min時，隨著回流時間的增加，總黃酮含量增加，在75 min處達到最大值，此時總黃酮的含量為15.50 mg/g，而在75～120 min之間，隨著回流時間的增加，總黃酮含量反而下降，從15.50 mg/g降到14.38 mg/g。加熱回流時間的延長，會造成部分黃酮糖苷類的分解，導(dǎo)致總黃酮含量降低[32]。因此，在試驗范圍及結(jié)合可實際操作選擇回流時間為75 min比較適宜。

圖3　乙醇濃度對黃酮含量的影響Fig.3 Effect of the ethanol concentration on the content of total flavonoids

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮含量相對增加，濃度低時增加得比較慢；濃度高時增加得比較快。隨著乙醇濃度的增加，其極性變?nèi)?，有利于極性較小的黃酮類化合物的溶出，總的黃酮溶出量增多。因此，選擇無水乙醇進行回流，提取效果比較好。

單因素試驗表明回流溫度、回流時間和乙醇濃度對乙醇提取香菜黃酮有顯著的影響。隨著回流時間的增加，黃酮含量先增大后減小，回流時間為75 min時黃酮含量最高，因此確定相應(yīng)正交優(yōu)化設(shè)計的回流時間范圍為70～80 min。回流溫度對黃酮含量的影響與回流時間類似，但當(dāng)回流溫度為80 ℃時，黃酮含量值達到最大，因此確定相應(yīng)正交優(yōu)化設(shè)計的回流溫度范圍為75～98 ℃。乙醇添加量為100%時黃酮含量最高，因此確定乙醇濃度范圍為90%～100%。

2.2　正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、回流時間(B)和回流溫度(C)為試驗因素，分別選擇3個水平(見表3)，以黃酮提取率作為檢測指標(biāo)，進行L9(33)正交優(yōu)化試驗設(shè)計，試驗結(jié)果見表3。

表3　正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

續(xù)　表

由表3正交試驗的極差值R可知，3個因素對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響程度為A>C>B，即乙醇濃度>回流溫度>回流時間。黃酮提取率結(jié)果表明：9個樣品中，7號最高，達22.3 mg/g，即在98 ℃條件下，用無水乙醇回流2次，70 min 1次。而正交試驗得出的優(yōu)組合是A3B2C2，即在80 ℃條件下，用無水乙醇回流2次，75 min 1次。將正交試驗中黃酮提取率最高的7號組合與A3B2C2組合進行比較，兩者黃酮提取率相差不大，且7號組合是用98 ℃的高溫回流，所以選擇溫度低的優(yōu)組合為A3B2C2。

2.3　抗氧化活性實驗

2.3.1總抗氧化能力

圖4　香菜提取液的總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of ethanol extract from Coriandrum sativum

由圖4可知，香菜提取液黃酮濃度與總抗氧化能力呈現(xiàn)量效關(guān)系。以總抗氧化能力為Y、黃酮濃度為X，進行線性回歸計算，得回歸方程為：Y=48.24X+23.90，相關(guān)系數(shù)R2=0.9935。隨著黃酮濃度的增加，總抗氧化能力也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到1 g/L時，總抗氧化能力相當(dāng)于67.81 mg/L的VitC；而質(zhì)量濃度增加到5 g/L時，則總抗氧化能力相當(dāng)于142.39 mg/L的VitC。

2.3.2還原能力

圖5　香菜提取液的還原能力Fig.5 Reducing power of ethanol extract from Coriandrum sativum

由圖5可知，香菜提取液黃酮濃度與還原能力線性關(guān)系一般。以還原能力為Y、黃酮濃度為X，進行線性回歸計算，得回歸方程為：Y=24.86X-10.47，相關(guān)系數(shù)R2=0.9731。隨著黃酮濃度的增加，還原能力也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到1 g/L時，還原能力相當(dāng)于21.49 mg/L的VitC；而質(zhì)量濃度增加到5 g/L時，則還原能力相當(dāng)于121.04 mg/L的VitC。

2.3.3羥基自由基清除能力

根據(jù)羥基清除率公式計算清除率，香菜提取液黃酮濃度與清除率關(guān)系見圖6。

圖6　香菜提取液的羥基自由基清除能力Fig.6 Scavenging activity of ethanol extract from Coriandrum sativum on ·OH

由圖6可知，隨著黃酮濃度的增加，羥基自由基的清除率也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到2 g/L時，對羥基自由基的清除率為32.25%；而當(dāng)其質(zhì)量濃度增加到4 g/L時，對羥基自由基的清除率為45.04%；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到5 g/L時，則對羥基自由基的清除率大于50%。以清除率為Y(%)、黃酮濃度為X(g/L)，進行線性回歸計算，得回歸方程為：Y=9.34X+9.99，相關(guān)系數(shù)R2=0.9616，IC50=4.28 g/L。

2.3.4超氧自由基清除能力

根據(jù)超氧自由基清除率公式計算清除率，香菜提取液黃酮濃度與清除率關(guān)系見圖7。

圖7　香菜提取液的超氧自由基清除能力Fig.7 Scavenging activity of ethanol extract from Coriandrum sativum on O2-·

由圖7可知，隨著黃酮濃度的增加，超氧自由基的清除率也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到2 g/L時，對超氧自由基的清除率為29.56%；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到4 g/L時，則對超氧自由基的清除率大于50%。以清除率為Y(%)、黃酮濃度為X(g/L)，進行線性回歸計算，得回歸方程為：Y=10.30X+7.44，相關(guān)系數(shù)R2=0.9687，IC50=4.13 g/L。

綜上所述，香菜提取液黃酮濃度與其抗氧化活性之間有著顯著的相關(guān)性。隨著黃酮濃度的增加，還原能力越大，抗氧化能力越強；在試驗濃度范圍內(nèi)，香菜乙醇提取液還原能力和總抗氧化能力呈正相關(guān)；隨著黃酮濃度的增加，羥基自由基和超氧自由基的清除率也隨著增加；當(dāng)香菜提取液黃酮濃度較低(1～2 g/L)時，對羥基自由基的清除率強于超氧自由基的清除率；當(dāng)香菜提取液黃酮濃度為3～ 4 g/L時，對超氧自由基的清除率強于羥基自由基的清除率；當(dāng)香菜提取液黃酮濃度較高(5 g/L)時，對羥基自由基的清除率強于超氧自由基的清除率。

3　結(jié)論與討論

通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計確定香菜總黃酮的最優(yōu)乙醇回流工藝，無水乙醇在回流溫度80 ℃條件下回流2次，每次回流時間75 min，共2次150 min，在此條件下黃酮的提取率為2.24%。肖衛(wèi)華等[33]用90%的乙醇在75 ℃條件下回流150 min，測得黃芪提取黃酮得率為0.0934%。劉韜等用67%的乙醇，微波溫度80 ℃，從香菜中提取黃酮的得率為1.31%。

本文進一步探討香菜乙醇提取液的抗氧化活性。香菜提取液黃酮濃度與其抗氧化活性之間有著顯著的相關(guān)性。隨著黃酮濃度的增加，總抗氧化能力、還原能力、羥基自由基和超氧自由基的清除率也隨著增加。當(dāng)黃酮濃度為5 g/L時，總抗氧化能力相當(dāng)于142.39 mg/L的VitC，還原能力相當(dāng)于121.04 mg/L的VitC，對羥基自由基的清除率為59.11%，對超氧自由基的清除率為55.61%。

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