藍(lán)尉冰,王帥靜，韓鑫,肖金亮

(1.欽州學(xué)院，廣西 欽州　535099；2.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室(欽州學(xué)院)，廣西 欽州　535099；3.廣西大學(xué)，南寧　530004；4.武漢理工大學(xué)，武漢　430063)

甲殼素又名甲殼質(zhì)、殼蛋白和殼聚糖，甲殼素及其衍生物以獨特的功能和特性被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。如甲殼素直接被用來制造味精及醬油等調(diào)味品[2]，甲殼素經(jīng)脫乙酰得殼聚糖作為調(diào)味品[3]，南美白對蝦是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)質(zhì)蝦種之一，而我國的南美白對蝦除鮮售外大部分加工成去頭、去殼的凍蝦和蝦仁出口，在此過程中產(chǎn)生大量的蝦類廢棄物，造成資源浪費及環(huán)境污染[4]，因此這些廢棄物的利用應(yīng)給予足夠的重視。目前，國內(nèi)外新興的甲殼素制備方法主要有酶法[5]、發(fā)酵法[6]、化學(xué)改良法等[7-11]，但對南美白對蝦甲殼素制備過程中數(shù)學(xué)表達(dá)式及模型建立研究較少。故本實驗采用水浴消解技術(shù)來優(yōu)化傳統(tǒng)工藝，使脫除蛋白和脫除碳酸鈣鹽可在較短時間內(nèi)完成，建立廣西北部灣地區(qū)南美白對蝦廢棄物制備甲殼素數(shù)學(xué)表達(dá)式，從而有效利用廣西北部灣水產(chǎn)資源，減少廢棄物排放，有效降低環(huán)境污染。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

新鮮南美白對蝦：購自廣西欽州欽南區(qū)東風(fēng)海鮮市場。

1.2　儀器與設(shè)備

EL204電子天平、EL20實驗室pH計、HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司； SZ-500A-3超高速多功能粉碎機永康市善竹貿(mào)易有限責(zé)任公司；V-1800PC可見分光光度計上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1制備工藝

蝦頭、蝦殼→烘干預(yù)處理→NaOH溶液脫蛋白(水浴條件下)→水洗至中性→烘干→鹽酸脫鈣(水浴條件下)→水洗至中性→烘干→過氧化氫溶液漂白→水洗至中性→低溫干燥→甲殼素產(chǎn)品[12]。

1.3.2脫蛋白單因素試驗

以脫蛋白率為指標(biāo)，分別按以下考察因素進(jìn)行試驗：料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)；反應(yīng)時間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h；反應(yīng)溫度60，70，80，90，100 ℃；NaOH濃度1%，3%，5%，7%，9%后離心測定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.3.3蛋白質(zhì)含量測定

考馬斯亮藍(lán)法[13,14]。

1.3.4蛋白質(zhì)脫除率測定

式(1)

式中：α為脫蛋白率，%；x為蛋白質(zhì)含量，μg；V1為提取液總體積，mL；V0為測定時取用提取液體積，mL；m0為預(yù)處理樣品的質(zhì)量；X1為預(yù)處理樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.5脫鈣工藝

基于本課題組前期工作，選擇脫鈣工藝為HCl濃度3%，水浴時間1.0 h，水浴溫度60 ℃，料液比1∶35(g/mL)。

1.3.6脫鈣率W測定[15,16]

用移液管移取1 mL上清液于100 mL的錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水、1 mL濃度為10% NaOH溶液及鈣指示劑2～3滴，充分混勻后，用EDTA溶液滴定，錐形瓶中溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)色，即為終點。平行標(biāo)定3次，記下所消耗的EDTA溶液的體積。

脫鈣率W按下式計算：

式(2)

式中：W為脫鈣率，%；V為溶液體積，mL； VEDTA為滴定消耗的體積，L； CEDTA為EDTA濃度，mol/L；MCa為鈣的摩爾質(zhì)量，g/mol；m為脫蛋白后的質(zhì)量，g；X2為脫蛋白后樣品中鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.7甲殼素得率測定

將脫蛋白、脫鈣后所得樣品進(jìn)行雙氧水漂白(10%，80 ℃，2 h)，洗凈烘干即可得到甲殼素，甲殼素得率為：

式(3)

1.4　水浴消解脫蛋白正交試驗

采用4因素3水平的分析方法進(jìn)行正交試驗設(shè)計[17]，見表1。

表1　正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5　傳統(tǒng)工藝

取預(yù)處理過的蝦頭、蝦殼粉，調(diào)整料液比，加入10%氫氧化鈉，于100 ℃加熱2.0 h，不停攪拌，冷卻至室溫，抽濾蒸餾水洗至中性，重復(fù)此步2次后用5% HCl溶液于室溫下浸泡8.0 h，不斷攪拌，水洗濾渣至中性，重復(fù)此步2次。之后用雙氧水漂白，干燥，即得甲殼素產(chǎn)品。

1.6　數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　水浴時間對脫蛋白率的影響

水浴時間對蝦廢棄物脫蛋白率的影響見圖1。

圖1　水浴時間對脫蛋白率的影響及擬合曲線Fig.1 Effect of water bath time on protein removal rate and fitting curve

水浴時間在0.5～1.5 h脫蛋白率呈上升趨勢，水浴時間達(dá)1.5 h時脫蛋白率達(dá)最高；之后隨水浴時間延長脫蛋白率呈下降趨勢，可能是因為時間越長會導(dǎo)致產(chǎn)品的水解，因此水浴時間取1.5 h為最佳。且對該曲線進(jìn)行擬合，符合Gauss 函數(shù)模型，所得擬合曲線方程見為式(4)，y0=50.53232,Xc=1.49095,W=1.34464,A=20.99076,擬合判定系數(shù)R2=0.98,說明此模型符合，在水浴時間為0.5～2.5 h時，蝦頭蝦殼脫蛋白都有規(guī)律，可根據(jù)所得方程估算出用量，控制脫蛋白率。

式(4)

2.2　水浴溫度對脫蛋白率的影響

水浴溫度對脫蛋白率的影響見圖2。

圖2　水浴溫度對脫蛋白率的影響Fig.2 Effect of water bath temperature on protein removal rate

由圖2可知，溫度越高，脫蛋白質(zhì)的效果越好，當(dāng)溫度達(dá)80 ℃時脫蛋白率達(dá)最高，而當(dāng)溫度超過80 ℃時脫蛋白率有下降趨勢，從經(jīng)濟角度考慮，以80 ℃的水浴溫度脫蛋白質(zhì)為最佳。

2.3　料液比對脫蛋白率的影響

料液比對脫蛋白率的影響見圖3。

圖3　料液比對脫蛋白率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on protein removal rate

料液比對脫蛋白率有顯著影響，其趨勢是先增大后降低。料液比為1∶15～1∶20(g/mL)時脫蛋白率呈上升趨勢，當(dāng)達(dá)到1∶20(g/mL)時脫蛋白率最高，后脫蛋白率呈下降的趨勢，因此脫蛋白時料液比取1∶20(g/mL)為最佳。

2.4　NaOH濃度對脫蛋白率的影響

圖4　NaOH濃度對脫蛋白率的影響及擬合曲線Fig.4 Effect of NaOH concentration on protein removal rate and fitting curve

由圖4可知，脫鈣率隨NaOH的濃度增大呈先增大后下降的變化趨勢，呈非線性狀態(tài)，在1%～3%脫蛋白率呈上升趨勢，當(dāng)NaOH濃度在3%時達(dá)最高，當(dāng)繼續(xù)提高NaOH濃度時，脫蛋白率呈下降趨勢。對該曲線進(jìn)行擬合，符合Gauss 函數(shù)模型，所得擬合曲線方程見式(4)。y0=38.94297，Xc=3.7871，W=3.17071，A=111.26518，擬合判定系數(shù)R2=0.96,說明此模型符合，在NaOH的濃度為1%～9%時，蝦頭蝦殼脫蛋白都有規(guī)律，可根據(jù)所得方程估算出用量，控制脫蛋白率。

2.5　水浴脫蛋白正交試驗結(jié)果

表2　正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

續(xù)　表

由表2可知，料液比的極差R為8.404，水浴時間的極差R為1.830，堿濃度的極差R為12.677，水浴溫度的極差R為7.056。由此可知，堿濃度是影響脫蛋白率的最主要因素，綜合考慮，影響脫蛋白率的因素的主次為：NaOH濃度>料液比>水浴溫度>水浴時間。根據(jù)極差分析結(jié)果可知，脫蛋白的最佳工藝參數(shù)為：A3B1C2D1，即NaOH濃度為3%，料液比為1∶20(g/mL)水浴溫度為80 ℃，水浴時間為1.5 h。

為進(jìn)一步判斷上述4因素對正交試驗結(jié)果的影響是否顯著，將正交試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選擇水浴時間為誤差所在的列，結(jié)果見表3。

表3　方差分析Table 3 Variance analysis

注：**表示非常顯著水平(F>F0.01(2，2))；*表示顯著水平(F0.05(2，2)

由表3可知，在95%置信度時，誤差所在列為水浴時間，料液比與堿濃度對脫蛋白率的影響顯著，而水浴時間和水浴溫度對脫蛋白率影響不顯著，這說明料液比和NaOH濃度對脫蛋白率起主要作用，水浴溫度和水浴時間對脫蛋白率影響不大。

2.6　最佳工藝條件的驗證分析

本試驗以南美白對蝦蝦頭、蝦殼為原料，通過脫蛋白、脫鈣、脫色素三步驟提取甲殼素，以脫蛋白率、甲殼素得率為指標(biāo)，分別通過對脫蛋白進(jìn)行單因素試驗和正交試驗，經(jīng)正交結(jié)果分析，脫蛋白的最佳工藝條件為NaOH濃度3%，料液比1∶20(g/mL)，水浴溫度80 ℃，水浴時間1.5 h；為提高試驗的可信度，在此條件下驗證，5次驗證試驗得到的甲殼素的得率分別為23.88%，24.02%，23.92%，24.00%，23.87%。通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)甲殼素的平均得率可達(dá)23.94%，故甲殼素提取工藝穩(wěn)定可行。

2.7　水浴消解與傳統(tǒng)工藝提取甲殼素的結(jié)果比較

表4　水浴消解與傳統(tǒng)工藝提取甲殼素結(jié)果比較Table 4 Comparison of water bath digestion and traditional process for chitin extraction　%

由表4可知，用水浴消解法提取甲殼素時，脫蛋白率為75.12%，脫鈣率為96.00%，甲殼素得率為23.94%；傳統(tǒng)工藝提取甲殼素時，脫蛋白率為52.45%，脫鈣率為70.54%，甲殼素得率為14.63%。由此可知，水浴消解提取甲殼素比傳統(tǒng)工藝多了9.31%，該方法不僅可以解決傳統(tǒng)工藝的一些不足，而且可以提高甲殼素得率。

3　結(jié)論

本次試驗采用水浴消解法優(yōu)化傳統(tǒng)工藝，考察水浴時間、水浴溫度、料液比、NaOH濃度制備甲殼素過程的規(guī)律研究，脫蛋白率都隨水浴時間、水浴溫度、料液比、堿濃度增大呈先增大后減小的趨勢，且時間、NaOH濃度對脫蛋白率符合Gauss 函數(shù)模型，所得擬合曲線方程系數(shù)分別為y0=50.53232，Xc=1.49095，W=1.34464，A=20.99076，R2=0.98及y0=38.94297，Xc=3.7871，W=3.17071，A=111.26518，R2=0.96。4個因素對脫蛋白率的影響依次為：NaOH濃度>料液比>水浴溫度>水浴時間。最佳工藝參數(shù)為：A3B1C2D1，即NaOH濃度3%，料液比1∶20(g/mL)，水浴溫度80 ℃，水浴時間1.5 h。水浴消解提取甲殼素比傳統(tǒng)工藝多了9.31%,這能為有效提取甲殼素提供一定的理論支撐，同時也能緩解提取甲殼素時所造成的污染問題的嚴(yán)重性。

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